Препарат биоспорин для профилактики и лечения желудочно- кишечных заболеваний человека

 

Использование: медицина, дисбактериозы, профилактика и лечение желудочно-кишечных заболеваний, вызванных патогенными и условно-патогенными микроорганизмами . Сущность изобретения: живые штаммы Bacillus Subtiiis ВКПМ № В- 2335 и Bacillus llchenlformis ВКПМ №В-233б с типичными свойствами смешивают в количестве соответственно 4-109-16-109 и 2-108-3 «109 кл/мл по 47 об.% каждого, доводят наполнителем до 100%. Препарат проверяют на безвредность и антагонистическую активность , определяют фагоцитарную активность лейкоцитов и индукцию интерферона, Препарат испытан на людях, 7 табл.

союз советских социялистических

РЕСПУБ!1ИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4641513/13 (22) 06.02.89 (46) 30.03,92. Бюл. М 12 (71) Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного (72) В.В.Смирнов, С.P.Ðåçíèê, И.Б.Сорокулова, В.А.Вьюницкая, А.Т.Слабоспицкая, 3.A.Áåðèëëî, И.Г.Скорикова, В.Я.Чаплинский и А.В.Тофан (53) 616.37 (088.8) (56) Руководство по вакцинному и сыворточному делу. /Под ред. П.Н.Бургасова. M.: Медицина, 1978, с. 90. (54) ПРЕПАРАТ БИОСПОРИН ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЧЕЛОВЕКА

Изобретение. относится к биотехнологии, а именно к препаратам для профилактики и лечения дисбактериозов и других желудочно-кишечных заболеваний человека, вызванных патогенными и условно патогенными микроорганизмами.

Целью изобретения является повышение эффективности профилактики и лечения дисбактериозов и других желудочно-кишечных заболеваний человека.

Препарат биоспорин содержит в качестве живых микробных культур Bacillus

subtills 3 (ВКПМ М В-2335) и Bacillus.

llchenlformls 31 (ВКПМ N. В-2336) и наполнитель.

В качестве наполнителя препарат содержит предпочтительно сахарозу — >келатиновую смесь.

Входящие в состав препарата живые микробные культуры характеризуются следующими свойствами.,, Ж,, l722502 Al (я)л А 61 К 39/02, 35/74 (57) Использование: медицина, дисбактериозы, профилактика и лечение желудочно-кишечных заболеваний, вызванных патогенными и условно-патогенными мик- роорганизмами. Сущность изобретения: живые штаммы ВасШиз Subtflis BKllM М В2335 и Bacillus llcheniformls В КПМ МВ-2336 с типичными свойствами смешивают в количестве соответственно 4 10 -16 10 и 2 10 -3 .10 кл/мл по 47 об.7 каждого, доводят наполнителем до 100;(. Препарат проверяют на безвредность и антагонистическую активность, определяют фагоцитарную активность лейкоцитов и индукцию интерферона. .Препарат испытан на людях, 7 табл.

В.subt!iis 3 (ВКПМ hb В-2335) — грамположительные аэробные спорообразующие палочки, продуцирующие каталазу. На сусло-агаре, среде Громыко, стрептомицетном агаре растут обильно, образуя матовые складчатые колонии телесного цвета с изрезанными краями, легко снимаются петлей.

В мазках из колоний, выросших на МПА, через 18 ч обнаруживаются прямые палочковидные клетки размером 2,7х0;8 мкм, расположенные одиночно или в виде цепочек.

Клетки подвижны, образуют аэробно споры овальной формы, которые располагаются в клетке центрально, При спорообразовании клетки не раздуваются. После роста на глюкозном агаре в протоплазме не обнаруживаются включения поли-Р -оксимасляной кислоты. На МПБ культура образует пленку.

Не растет в анаэробных условиях, не гидролизует мочэвину, не образует газ из нитратов в анаэробных условиях. не продуцирует аргининдигидролаэу, Дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра, растет в присутствии 7Я NaCI. Гидролизует крахмал и казеин, разжижает желатину. Ферментирует глюкозу, арабинозу, ксилозу, маннит с 5 образованием кислоты без газа. Редуцирует

-нитраты, обеспечивает метиленовую синь.

Не обладает коагулаэной и лецитиназной активностью.

В.llchenlformis 31 (ВКПМ № 8-2336) — 10 грамположительные клетки, палочковидные, размером 2,5х0,6 мкм. Клетки подвижны, перитрихи, располагаются, в основном, в виде цепочек. Споры овальной формы, располагаются в клетке центрально. Клетки 15 при спорообразовании не раздуваются. После роста на глюкозном агаре в протоплазме не обнаруживаются включения полир -оксимасляной кислоты.

На MllA колонии с тусклой грубой по- 20 .верхностью, непрозрачные, плотно прикреплены к агару; нередко на поверхности обнаруживается слизь. На МПБ образуется морщинистая пленка, иногда с кремовым опенком. 25

Культура образует каталазу, характеризуется способностью расти на агаре в анаэробных условиях. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра, растет при 7%

NaCI. Гидролизует крахмал, казеин, не гид- 30 ролизует мочевину. Желатин разжижает медленно. Ферментирует глюкозу, арабикозу, ксилозу, маннит с образованием кислоты беэ газа. Редуцирует нитраты, в анаэробных условиях иэ нитратов образует 35 газ. Продуцирует аргининдигидролаэу. Не обладает коагулазной и лецитиназной активностью.

Пример 1. Из штаммов В. subtiiis 3 и

В.llcheniformis 31 с типичными морфологи- 40 ческими, культуральными, биохимическими свойствами приготовлены три варианта препарата биоспорин с различным содержанием микробных клеток в составе препарата. 45

Вариант 1.

Препарат, содержащий следующие компоненты, об.;4:

Биомасса В.subtilis

ВКПМ №В-2335 4 млрд. живых микробных клеток

s 1 мл физиологического 5 раствора 47

Биомасса B.licheniformls

ВКПМ №В-2336 200 млн. живых микробных клеток . в 1 мл физиологического 10 раствора 47

Наполнител ь Остальное до 100

Вариант 11, Препарат, содержащий следующие компоненты, об,7:

Биомасса В.subtllls ВКПМ №В-2335 10 млрд. живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора 47

Биомасса В.llchenlformls

ВКПЫ №В-2336 1,6 млрд. живых микробных клеток в

1 мл физиологического раствора

Наполнитель

47

Остальное до 100

Вариант IП.

Препарат, содержащий следующие компоненты, об. О :

Биомасса В slbtilis ВКПМ

¹B-2335 16 млрд. живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора

Биомасса В.licheniformis

ВКПМ ¹B-2336 3 Млрд. живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора

Наполнитель Оста

47 льное до 100

Результаты испытания вариантов препарата биоспорин Нll на безвредность и антагонистическую активность и редставлены в табл, 1.

Как видно из представленных в табл. 1 данных, оптимальные количества живых микробных клеток в 1 мл составляют для

B.subtllis ВКПМ ¹B-2335 4-10 млрд и для

B.llcheniformls ВКПМ ¹8-2336 200 млн -1,6 млрд при их объемном соотношении 47

47, . Дальнейшее увеличение количества микробных клеток не изменяет существенным образом специфическую активность препарата в отношении тест-культур микроорганизмов.

Пример 2. Эффективность препарата биоспорин, содержащее различные соотношения культур В subtllis 3 и В,ltcheniformls

31 оценена путем воздействия их íà Staph.

aureus, Результаты опытов представлены в табл. 2.

Результаты табл. 2 также подтверждают, что наиболее оптимальным сочетанием культур В.subtllis ВКПМ №В-2335 и

В.licheniformls В КПМ №В-2336 является соотношение между ними соответственно

47 Д и 47 . При таком соотношении культур регистрируется наиболее быстрое и наиболее полное подавление стафилококка. Сход1722502 ные данные получены и при изучении воздействия различных вариантов препарата биоспорин на патогенные для человека зшерихии, сальмонеллы, шигеллы и другие болезнетворные микроорганизмы.

Пример 3. Культуры, входящие в состав препарата биоспорин, безвредны для лабораторных животных, Введение даже значительных доэ препарата не вызывает гибели и патологических изменений у животных. Противопоказаний к применению препарата нет.

Результаты исследования безвредности штаммов В subtllis 3 и В.lichenlformis

31, входящих в состав препарата биоспорин, представлены в табл. 3 и 4.

Пример 4. Антагонистическую активность биоспорина определяют методом отсроченного антагонизма. Для этого содержимое ампулы растворяют в 1 мл физиологического раствора. Полученную взвесь высевают штрихом по диаметру чашки Петри с агазированной средой Гаузе N. 2 (или в центре чашки) петлей диаметром 3,5 мм. Посевы инкубируют в термостате при

37 С в течение 72 ч. Затем к выросшей ассоциации культур подсевают штрихом посевной материал тест-микроорганизмов (500-миллионные суспензии суточных культур в физиологическом растворе), Учет результатов проводят через 18 ч инкубирования при 37 С по величине зон отсутствия роста тест-культур. Контролем роста тест-культур служит их параллельный посев на чашки с агариэованной средой Гаузе М 2 без исследуемой ассоциации куль-. тур.

Данные об антагонистической активности препарата биоспорин представлены в табл. 4.

Пример 5. Определение фагоцитарНоА активности лейкоцитов животных проводят по Лабинской (1968).

Опыты проводят на кроликах массой

2 5-2,8 кг, которым вводят перорально препарат на протяжении 10 дней. Пробы крови исследуют по фагоцитарной активности в различные сроки после перорального введения препарата (до опыта, через 5 дней, 10 дней и 15 дней и через один месяц), Контрольным животным вводят перо-, рально физиологический раствор или яичный белок (200 мг).

Определение фагоцитарной активности лейкоцитов проводят в отношении различных текст-культур возбудителей желудочнокишечных заболеваний человека.

Клинические наблюдения за экспериментальными животными, проведенные в процессе перорального введения препара40 ток доводят с помощью 0,1N Na0H до нейтрального значения,.Эту операцию проводят с целью инактивации индукторов интерферона, которые могут быть в сыворотке крови.

Для определения интерферонной активности.полученных сывороток их титруют на культуре мышиных клеток линии а против вируса индуктора —,вируса везикулярного стоматита(штамм Индиана). С этой целью пробы раститрованных сывороток наносят на монослой клеток линииа, выдерживают

18-20 ч при 37 С, затем отмывают их раствором Хенкса и вводят 100 ТЦД о вируса индикатора. Учет проводят через 24 ч. За титр интерферона принимают наибольшее разведение сыворотки, которое угнетает репродукцию вируса в культуре клеток.

Для подтверждения интерферонной активности полученных сывороток их выдерживают на монослое клеток ав та, а также на протяжении двух месяцев после окончания введения показывают: все животные остаются активными, полностью поедают пищевой рацион, физиологические .

5 отправления у них не нарушаются, поведение обычное, изменений со стороны шерстного покрова не отмечается.

При исследовании показателей фагоцитоэа (по отношению к энтеропатогенным

10 штаммам E.ooil и сальмонеллам) отмечается существенное повышение афгоцитарной av,тивности лейкоцитов кроликов, которым вводят препарат перорально (табл.5).

Число фагоцитируемых клетох Е.cali

15 увеличивается почти вдвое, а число фагоцитируемых сальмонелл — в полтора раза. Фагоцитарная активность лейкоцитов крови кроликов, получавших перорально препарат биоспорин, по отношению к разным бак20 териям представлены в табл. 6.

Таким образом полученные данные сви-, детельствуют о том, что пероральное введение препарата вызывает существенное повышение фагоцитарной активности лей25 коцитов животных, Пример 6. С целью проверки.индукции интерферона биоспорин вводят через рот подопытным мышам весом 18-20 r. В контроле две группы по 30 животных. Одной

30 группе вводят физиологический раствор другой — вирус болезни Ньюкасла (2-10

БОЕ/мл). Через различные промежутки времени мышей декапитируют и собирают пул сывороток от 5-6 животных одной группы.

35 Сыворотки центрифугируют в течение 1 мин при 3000 об/мин, затем обрабатывают 0,1И

HCl (доводя рН их до 2,2) и выдерживают 3 сут при температуре 4 С. Затем рН сыворо1722502

47

До 100

Таблица 1 присутствии антибиотика актиномицина Д, который используют в концентрации 5 мкг/мл а качестве ингибитора транскрипции, Затем в реакционную систему вносят вирус индикатора (100 ТЦДщ), Отсутствие антивирусного действия сывороток свидетельствует об их интерферонной активности.

Результаты опыта представлены в табл.7.

Данные, представленные в табл, 7, свидетельствуют о том, что пероральное введение препарата биоспорин существенно индуцирует продукцию зндогенного интерферона.

Пример 7. Препарат биоспорин применен на людях, показана его абсолютная безвредность, хорошая переносимость

- и высокая эффективность.

Пациент В-в, 57 лет. Жалобы на частый .стул с примесью слизи, боли в животе. При обследовании отмечается болезненность по ходу толстого кишечника. Диагноз — обострение хронического колита, дисбактериоз кишечника, Принимает биоспорин по 2 дозы 4 раза в день. Уже через несколько часов после применения препарата отмечается исчезновение тошноты, болей в животе. После 3 дней приема препарата состояние хорошее, стул нормализовался, живот мягкий, безболезненный. Таким образом препарат биоспорин оказывает выраженное лечебное действие, причем действие его наступает быстрее и значительно эффективнее, чем действие употребляемых пациентом ранее в подобных случаях препаратов (бисептола, фуразолидона и др.).

5 Таким образом препарат биоспорин может быть использован для профилактики и лечения дисбактериозов и других желудочно-кишечных заболеваний человека, вызванных патогенными и

10 условно-патогенными микроорганизмами.

Формула изобретения

Препарат биоспорин для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека, содержащий живую культуру

15 штамма Bacillus Subtllls и наполнитель, о тл и чаю щи и с ятем,что, с целью повышения эффективности препарата за счет усиления фагоцитарной активности крови и индукции интерферона, дополнительно со20. держит штамм Bacillus tlchenlformls ВКПМ

МВ 2336 в количестве 2 10 -3 10 кл/мл, а в качестве культуры Bacillus Subtllls штамм

ВасНЪз Subtllls ВКПМ МВ-2335 в количестве 4 109-16 10 кл/мл при следующем соот25 ношении компонентов, об. О :

Штамм Васщоз Subtllis

ВКПМ МВ-2335 в количестве 4 ° 10э-16 10 кл/мл 47

Штамм Bacillus Iicheni30 formts ВКПМ МВ-2336 в количестве 2 10 -3 10 кл/мл

Наполнитель

1722502

Га блиц а 2

При- Варианты препарата, 3 мер

Количество живых клеток

S.aureus 209 через

12 ч 18 ч 24 ч 36 ч

3 10 510 10

10 2 10 0

2"1О

3 10

Контроль 209 (без препарата)

В.subtilis ВКПМ И В-2335 47

В.licheniformis ВКПИ Н В-2336 47

В.subtilis ВКПМ N В-2335 64

В.licheniformis ВКПМ У В-2336 30, 6

2 10

5 .,А

2 10 3 10 2>10

3 В.subtilis ВКПМ М B"2335 77

1О 10з

В.licheniformis ВКПМ М В"2336 17

4 В.subtilis ВКПМ N В-2335 84

10 4 10з 10

В. licheniformis ВКПМ N В-2336 10

2 10 10 10з

5 В.subtilis ВКПИ1 В-2335 22

102

В.licheniformis ВКПИ М В-2336 72

6 В.subtilis ВКПММ В-2335 35

3;10

В.licheniformis ВКПМИ В-2336 59

7 B.subtilis В1<ПМ " В"2335 57 10 3 10 3,10з .В.licheniformis BKflMN B 2336 37

8 В.subtilis ВКПМЬ" В-2335 7

1О 10 10з

103

В.lichenif ormis ВКПМИ В-2336 87

Табли ца 3

Определение вирулентности культур, выращенных в течение 24 ч при 37ОС на мясо"пептонном агаре

Курс Заболело Выжило введен.

Доза мик- Путь введения, робных раз клеток, . млрд.

Количест" во мышей в опыте

«и»

Перорально

В.licheniformis 31

В/брюшинно

В/венно

Подкожно

Перорально

10 18

5 O

5,0

5,0

5,0

5,0

5,0

5,0

5,0

5,0

5,0

В. subtilis 3 .

В/брюшинно

В/венно

Под кожно

1

10.

Таблицами

Определение токсичности фильтратов и центрифугатов культур, выращенных на среде Гаузе И 2 при 37 С в течение

8 сут

Доза фильтрата или центрифугата, ил

Путь введения

Количество мышей в опыте

Курс введения

3а боле ло

Вьш!ило

ЮО й* °

В.subtilis

I0

1,0

0 5

0,5

ОЭ5

В/брюшинно

В/венно

Подкожно

1

0

0

10!

Перорально

8.1ichenifonnis 3 1

1,0

0>5

0 5

0,5

0 t0

0 10

0 I0

О, 10

0 . 10

В/брюшинно

В/венно

Подкожно

11

Перорально

1

5

Таблийа5

) Зона подавленна роста тест-культур, ье4

Тест-культура

Staph.aureus 209

Staph.aureus 1479

Staph1rhureus 1623

Staph !!ood 46

Рв.pichettii 4140

Рв. maltophllia 4131

Ser.marcescens !0002

Cand. в1Ыcans

corynebact. michig.

Rantomanas рЬввео12

ЯЬьЯв11а aonnei

Salm.Stan1åy 5266

Salm reading 5270

Salm. neuport 5751

Selm. greis 1190

Salm.abortus-egui 202

Salm. derby 1519

salm. veal aco 247149

Pr. vulgaris 226

Pr. vulgaris 72

Pr. ля10втз.в 162

Pr. vulgaris l8l

Stachybotris alternans

Dendrodochium tosicum

° М

25-28

29-32

18-22 .. 23,25, 23"25

13"15

12 14

18"20

18 20

18-20

10-12

14"!6

1216

1012

14-17

11 13

15-18

12-14

18"20

18"20

18-20

13" 16

14 16

1012

1722502

Та 6 л и ца 6

Бактериальные культуры, ру па использованные s реакции вивотных

Фагоцитарный индекс

До введе- Дни после введения препарата нив пре1 парата 5 (10 15 20

149 203 228 216 211

1,42 1,40 1,44 1,47 I 42

1,64 2,17 2,44 2,61 2,27

1 56 1,61 1,60 1,58 1,59

2,00 2,86 3,14 3,22 3,01

2,41 2,40 2,44 2,22 2,17

1 ° 67 2,87 3, 14 3, 12 3,03

1,68 1,54 1,72 1,68 1,66

1,44 2, 87 3,22 3, 14 2,94

1,52 1,56 1,64 1,60 1,53

1,54 2,68 3,06 3,11 2,96

1,78 1,/2 1,68 1,64 1,59

1,66 3,28 3,28 3,22 2,97

Фагоцитоэа

Salm.morbicans

V.nevport 5701

Опыт

Контроль

Sale.typhimurium

V.IIeidå1Üerg 1150

Sa1ы.typhimurium

Опыт

Контроль

Опыт

V.Stanley 5266

Salm. enteritidis

Контроль

Опыт

Контроль

Опыт

Контроль

E.coli 0127

Опыт

E.coli 0119

Контроль

Опыт. E.coli 055

E.coli 086

Proteus vulgaris 226

I ° 73

2,54

1,65

2,38

1,46

2,41

1,42

Контроль

1 ° 72

1,.47

1,70

1,44

1 ° 58

1,53

1>52 .

1,76

3,12

1 ° 70

2,56

I >72

2,36

1,58

1,Ь9 1,75

3,05 3,22

I ° 72 1,67

2,35 2,28

1,63 1,59

2,33 2,32

1,59 1,61

Опыт

Контроль

Опыт

Контроль

Опыт

Proteus vulgaris 72

Контроль

П р и и е ч а н и е. Интервалы значений составлвли от а 0 ° 01 до 20,21.

Таблица 7

Составитель Г.Соболева

Техред M.Moðãåí Tàë Корректор В.Гирняк

Редактор С.Лисина

Заказ 1011 Тираж Подписное

8НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина. 101