Питательная среда для выявления фимбриального антигена адгезии f-41

 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и может быть использовано в ветеринарии.для выявления белка адгезии F-41 при диагностике колинфекции молодняка сельскохозяйственных животных. Целью настоящего изобретения является повышение селективности среды. Для этого используется питательная среда с рН 7,9- 8,1 при следующих количественных соотношениях компонентов, .мас.%:глюкоза 0,04-0,05; гидролизат казеина 0,25-0,30; дрожжевой экстракт 0,005-0,01; Na2HPCMx х2Н20 0,5-0,55; КНаРСм 0,07-0,08; агарагар 1,2-2; дистиллированная вода остальное . . (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (sj)s А 61 К 39/02, С 12 N 1/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Остальное

7,5

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4796093/13 (22) 06.12.89 (46) 23.03.92. Бюл. N 11 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии (72) О.К,Шулюпин, Э.А.Светоч, Е-.Л.Жиленков, В.B,Ãócåâ, О.А.Тугаринов и Ю,А.Малахов (53) 576,8,093.31(088,8) (56) Morris J.À., Thorng C„Scon А.С. et al.

Adhesion in vitro and in vivo associated vvith

an adhesive antigen (F41) produced by а К 99

mutant of the teference strain Е.СоИ В 41. Inf.lmm., i982, ч.38, М 3, р.1148-1153.

Yraaf de F.Ê., Roorda V. Production, Purification and characterization of the fimbri а1 adhesive antigen F 41 isolated from calf

enteraphathogenic Е.СоП strain В 41 M,—

lnf.imm., 1982, v.38, N 2, р.751 — 758.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и может быть использовано в ветеринарии для выявления белка адгезии

F-41 у энтеротоксигенных эшерихий при диагностике колибактериоза молодняка. сельскохозяйственных животных.

Известны среды для выявления антигена F-41, содержащие баранью кровь.

Недостатком применяемых питательных сред с кровью для выращивания испытуемых эшерихий является то, что они не позволяют во многих случаях обнаружить фимбриальный антиген у заведомо F-41 позитивных эшерихий, Это связано с непостоянством состава применяемой крови и невозможностью контролировать ее состав, Кроме того, применяемые питательныесреды с кровью делают невозможным обнаружение антигена F-41 у эшерихий, образующих на богатых средах А-капсульный термостабильный.антиген. Последний Ж, 1720652 А1 (54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ФИМБРИАЛЬНОГО АНТИГЕНА АДГЕЗИИ F-41 (57) Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и может быть использовано в ветеринарии для выявления белка адгезии

F-41 при диагностике колинфекции молодняка сельскохозяйственных животных.

Целью настоящего изобретения является повышение селективности среды. Для этого используется питательная среда с рН 7,98,1 при следующих количественных соотношениях компонентов, .мас.%;глюкоза

0,04-0,05; гидролизат казеина 0,25-0,30; дрожжевой экстракт 0,005 — 0,01; йагНРО4х х2Н20 0,5 — 0,55; КН2Р04 0,07-0,08; агар- ) агар 1,2 — 2; дистиллированная вода остальное.. вызывает инагглютинабельность культуры специфической сывороткой.

Наиболее близкой к предлагаемой является среда Минка следующего состава, мас.%:

Глюкоза 0,1

Гидролизат казеина кислотный 0,1

NazHPO4 2H2O 1,01

КН2Р04 0,13

Дрожжевой экстракт 0,1

Агар-агар 1.5

Дистиллированная вода рн

Микроэлементы, мг/л:

MgS04 6Н20 1

FeCls 6HzO 0,135

CaCb 3

Указанную среду засевали F-41 позитивным штаммом Е.coli ВГНКИ 397А/37-14, 3

1720652 инкубировали при 37 С 18 ч. Клетки снимали с плотной среды и анализировали в РА и под электронным микроскопом, Культура агглютинировалась специфической сывороткой с оценкой (1 ), под электронным мик-. ро.скопом фимбрий не обнаружили.

Следовательно, недостатком данной среды является низкая надежность выявления антигена F-41 в PA и невозможность выявления антигена под . электронным микроскопом.

Целью изобретения является повышение надежности выявления антигена F-41 у эшерихий.

Поставленная цель достигается выращиванием эшерихий на питательной среде при следующем количественном соотношении компонентов, мас, %:

Гл ю коза 0,04-0,05

Гидролизат казеина кислотный 0,25 — 0;30

Дрожжевой экстракт 0,005 — 0,01

ИагНР04 2Нг0 0-5-0,55

KH2P04 0,07 — 0,08

Агар-агар 1,2-2

Дистиллированная вода Остальное рН 7,9-8,1.

Количественное соотношение компонентов предлагаемой питательной среды и ее рН обеспечивают повышенный уровень синтеза белка F-41 и высокую надежность его выявления как в РА; так и морфологически, под.электронным микроскопом, Питательную. среду приготавливают следующим образом.

Гидролизат казеина кислотный и дрожжевой экстракт взвешивают и растворяют в дистиллированной воде в концентрации

5% доводят до рН 7;9 — 8:.1 и стерилизуют автоклавированием при 1 атм 15 мин, Фосфатный буфер приготавливают в концентрированном виде из расчета КагНРО4 .2НгО

40 гВ и КгНР04 5,6 г/л и доводят до рН

7,9-8,1, стерилизуют автоклавированием при 1 атм 15 мин, К 800 мл расплавленного стерильного раствора 1,5-2,5 агар-агара на дистиллированной воде добавляют 140150 мл концентрированного фосфатного буфера, 45-55 мл 5%-ного раствора гидролизата казеина, 1 мл 5 Д-ного раствора дрожжевого экстракта, 1-1,2 мл 40, -хого раствора глюкозы. Питательную среду перемешивают и разливают в чашки Петри.

После подсушивания среды ее засевают клетками E.ñîÈ ВГНКИ 397А/37-14 (F-41+) редкими штрихами — 4 — 5 штрихов во взаим но перпендикулярных направлениях на чашке диаметром 90 мм (при посеве газоном антиген F —.41 не выявляется). Посевы инкубируют при 37 С 18 — 20 ч. Выросшую культуру проверяют на уровень синтеза антигена F 41 в РА со специфической сыво5 роткой и под электронным микроскопом.

Для постановки РА на чистом стекле смешивают бактериальную суспензию обьемом 5-10 мкл, (1 — 5) 10" мкл/мл, с анти-F— .41 сывороткой в разведении 1. 10 и проводят

10 учет РА в рассеянном освещении на темном фоне.

Оценку результатов агглютинации проводят по следующей схеме.: быстрая, в течение нескольких секунд, агглютинация

15 клеток с образованием хлопьев и полным просветлением жидкости в промежутках между хлопьями — оценка (4 ), около 75% клеток слиплось — оценка (3), около 50% неслип шихся клеток — оценка (2 ), замедлен20 ное, в течение минуты, образование хлопьев при слабом просветлении жидкости, около

25% агглютинировавших клеток — оценка (1 .), бактериальная суспензия после смешивания с сывороткой остается гомогенно мут25 ной — оценка (-), отрицательная реакция.

РА, оцениваемая на (4 /3 ) свидетельствует о высоком количестве синтезируемого антигена, на (2 /1 j — реакция сомнительная, необходима проверка в дополнитель30 ных экспериментах. Обнаружение фимбриального антигена под электронным микроскопом в виде специфичной нитчатой структуры на поверхности клеток повышает надежность выявления антигена F — 41, 35 В результате постановки отсеивающего эксперимента было найдено, что наибольшее влияние на синтез антигена F — 41 оказывает рН среды, концентрация аниона фосфорной кислоты и глюкозы. Значение

40 указанных компонентов питательной среды для синтеза антигена F 41 было дополнительно проверено в серии однофакторных экспериментов. Предлагаемая питательная среда отличается количественным соотно- .

45 шением входящих в нее компонентов. В среде Минка глюкоза и фосфатный буфер входят в ингибирующий синтез антигена концентрациях, а рН и кислотный гидролизат казеина — в лимитирующих концентра50 циях, следствием чего является низкий уровень диагностически значимого антигена и трудности при установлении отличий в

Ра между клетками, содержащими антиген

F-41, и клетками без антигена, 55 Предлагаемая питательная среда содержит указанные компоненты в концент-. рациях, оптимальных для синтеза F-41, Культуры, выросшие на этой среде, дают положительную РА (4 /3 ) и под электронным микроскопом наблюдаются специфич1720652

0,25

0,0,05

0,05

0,30

0,01 ные нитеподобные структуры на поверхности клеток, Пример 1. Проверка предлагаемой среды для выявления антигена Р-41 производилась посевом штамма -E,coll ВГНКИ 5

397А/37-14 (F-41) на питательную среду следующего состава, мас.7ь:

Глюкоза,0,04

Гидролизат казеина. кислотный 10

Дрожжевой экстракт

Натрий фосфорнокислый двухзамещенный 0,5

Калий фосфорнокислый однозамещенный 0 07 .. 15

Агар-агар 1,5

Дистиллированная вода Остальное рН 7,9

После культивирования при 37 С 18 ч 20 оценки агглютинации референс-сывороткой составили (3 /4 ).

Пример 2. Выявление антигена F-41 проводили, как в примере 1, но при посеве„ референс-штамма на питательную среду 25 следующего состава, мас. :

Глюкоза 0,045

Гидролизат казеина 0,027

Дрожжевой экстракт 0;007

Калий фосфорнокис- . ЗО лый однозамещенный 0,075

Натрий фосфорнокислый двухзамещенный 0,52

Агар-агар 1,5

Дистиллированная 35 вода Остальное рН 8,0.

В PA получены оценки (3 /4 ).

Пример 3. Проверку предлагаемой среды проводили, как в примере 1, но при 40 посеве на питательную среду следующего состава, мас.%:

Глюкоза

Гидролизат казеина

Дрожжевой экстракт 45

Натрий фосфорнокислый двухзамещенный . 0,55

Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,08

Агар-агар 1,5 50

Дистиллированная вода Остальное рН 8,1.

Оценки в PA (3+/4+).

Следовательно, найденные границы из- 55 менения состава питательной среды обес. печивают одинаковый уровень синтеза антигена F-41 и надежность его выявления.:

Пример 4 (негативный). Проверку предлагаемой среды проводили, как в при-: мере 1, но при посеве референс-штамма на питательную среду следующего состава, мас,%:

Глюкоза 0;1

Гидролизат казеина кислотный 0,25

Дрожжевой экстракт 0,05.

Натрий фосфорнокислый двухзамещенный 1

Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,13

Агар-агар 1,5

Дистиллированная вода, Остальное рН 8,0

Оценки агглютинации (1 /-), Пример 5 (негат.ивный). Проверку предлагаемой среды проводили, как в примере 1, но при посеве референс-штамма на питательную среду следующего состава, мас.7: .Глюкоза 0,1

Гидролизат казеина кислотный 0,25

Дрожжевой экстракт 0,005

Натрий фосфорнокислый двухзамещенный 0,03

Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,01

Агар-а ra p 1,5

Дистиллированная вода Остал ьное рН 8,0, Оценки агглютинации (1 /-).

Следовательно, количество глюкозы и фосфатов за пределами; оптимального интервала ухудшает надежность выявления антигена F-41, так как, чем больше отличается оценка РА от отрицательной, тем выше надежность выявления антигена.

Пример 6. Клетки Е.соИ ВГНКИ

397А/37-14 выращивали на среде Минка и использовали для иммунизации кроликов.

Иммунизацию .проводили внутривенным введением живой бактериальной суспензии вследующихдозах:10,2.10 и8 10 кл/кр.

9 . 9, 9 с недельным интервалом. Через 7-10 дней после последней инъекции делали забор крови и определяли титр антител к антигену

F-41. Из 8 иммунизированных кроликов только один кролик стал донором специфичной.сыворотки с титром РП 1/2, у.остальных животных специфичных антител не обнару-жили, Пример 7. Клетки Е,coll -ВГНКИ

397А/37 (Е41+) выращивали на предлагаемой питательной среде:и проводили иммунизацию, как описано в примере 6. Было использовано 10 животных, от которых пол1720652

0.25-0,3 0

0;005-0,01

Формула изобретения

Питательная среда для выявления фимбриального антигена адгезии F-41, содержащая глюкозу, гидролизат казеина кислотный, дрожжевой экстракт, натрий фосфорнокислый, двухэамещенный двухводный, калий фосфорнокислый однозаме0,07-0,08

1,2-2

Остальное

Составитель О. Шулюпин

Редактор 0. Юрковецкая Техред М.Моргентал Корректор О, Ципле

Заказ 907 Тираж Подписное ., ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 учена специфическая анти-F-41 сыворотка с титрами РА 1/10-1/16, Специфическая иммуногенность клеток референс-штамма, выращенных на предлагаемой среде выше, чем иммуногенность того же штамма, выращенного на среде

Минка, следовательно, содержание белка F41 больше на клетках эшерихий, выращенных в первом случае, чем во втором. щенный агар-агар и воду, о т л и ч а ю щ а яс я тем, что, с целью повышения селективности среды, компоненты содержатся при следующих количественных соотношениях, 5 мас.%:

Глюкоза 0,04 — 0,05

Гидролизат казеина кислотный

Дрожжевой экстракт

10 Натрий фосфорнокислый двухзамещенный

Двухводный 0,5-0,55

Калий фосфорнокислый однозамещенный

Агар-агар

Вода рН 7,9-8,1.