Способ выбора донора при аллотрансплантации почки

 

Изобретение относится к медицине, преимущественно к трансплантационной иммунологии, и может быть использовано при выборе донора при аллотрансплантации почки. Целью изобретения является повышение точности выбора донора. Цель достигается за счет того, что смешивают сыворотку крови реципиента с лимфоцитами донора в концентрации 2,6 106/мл, которые предварительно инкубируются с конканавалином А в дозе 6,6-8,3 мкг/мл на 410 лимфоцитов при температуре 37°С в течение 50-60 мин, инкубируют, добавляют комплект сыворотки кролика, инкубируют и определяют количество мертвых клеток окрашиванием их водным раствором эозина. Способ позволяет повысить точность прогнозирования криза отторжения на 30% и, следовательно, повысить точность выбора донора.

(19) (|!) СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУ.БЛИК (si)s 6 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕН|Ъ|И КОМИТЕТ

flO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И С.ТКРЪ|ТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4752305/14

,(22) 25.10.89 (46) 07.04.92. Ьюл. М 13 (71) Научно-исследовательский институт. трансплантологии и искусственных органов (72) Р.Я.Войлокова (53) 615.375 (088.8) (56) Зарецкая Ю.M. Клиническая иммуногенетика. — M., 1983, с. 41-43, (54) СПОСОБ ВЫБОРА ДОНОРА ПРИ АЛЛОТРАНСПЛАНТАЦИИ ПОЧКИ (57) Изобретение относится к медицине, преимущественно к трансплантационной иммунологии, и может быть использовано при выборе донора при аллотрансплантаИзобретение относится к медицине. в частности к трансплантационной иммунологии, и касается прогнозирования криза отторжения для снижения частоты отторжения трансплантата вследствие пресенсибилизации реципиента к дойорским

HLA-антиген ам.

Целью изобретения является повышение точности выбора донора.

Способ осуществляют следующим образом.

Выделение клеток из селезенки. Селезенку донора измельчают ножницами, кусочки селезенки опускают в гомогенизатор со средой 199 и осторожно выдавливают клетки пестиком. Далее клетки помещают во флакон со средой 199. суспензия о гстаивается несколько минут для осаждения крупных конгломератов, оставшуюся суспензию наносят на градиент фиколл — верографина и центрифугируют 35 мин при 400g.

Клетки "облачка". собранные из интерфазы, ции почки. Целью изобретения является повышение точности выбора донора. Цель достигается за счет того, что смешивают сыворотку крови реципиента с лимфоцитами донора в концентрации 2,.6 10 /мл, которые предварительно инкубируются с конканавалином А в дозе 6,6-8,3 мкгlмл на

4 10 лимфоцитов при температуре 37 С в течение 50-60 мин, инкубируют, добавляют комплект сыворотки кролика, инкубируют и определяют количество мертвых клеток окрашиванием их водным раствором эозина.

Способ позволяет повысить точность прогнозирования криза отторжения на 30, и, следовательно, повысить точность выбора донора. отмывают один раз средой 199 и разводят до концентрации 4х10 клеток в 1 мл. К 0,2 мл суспензии лимфоцитов (конечная. концентрация 2.6х10 клеток/мл) приливают 2—

2,5 мкг конканавалина А в 0,1 мл среды 199 (конечная концентрация 6,6+8,3мкгlмл), инкубируют 50-60 мин при 370С. Обработанные конканавалином А клетки закапывают в лунки с сывороткой реципиента для постановки микролимфоцитоксического теста.

Поставнока реакции, По 1 мкл сыворотки реципиента закапывают в лунку планшета Терасаки под вазелиновое масло. 1 мкл суспензии лимфоцитов (концентрация клеток 2-3 х10 /мл) закапывают в лунки. инкубируют 30-40 мин при комнатной температуре, в лунки добавляют 5 мкл свежеразмороженного комплемента. кролика и инкубируют один час, закапывают. в лунки по 3 мкл 5 $-ного водного раствора эозина, через 2 мин останавливают реакцию 6 мкл

40, -ного нейтрального формалина, Чтение

1725124 реакции осуществляют при помощи инвертированного микроскопа. Реакцию оцени. вают как положительную, если количество мертвых клеток в опыте было на 10 выше, чем в контроле.

Пример 1. Реципиент Д., донор Т.

Аллотрансплантация почки 4.02.88, Выбор донора по известному способу- рекомендована аллотрансплантация.

Определение по предлагаемому способу.

Выделение клеток из селезенки. Селезенку донора измельчают ножницами, кусочки селезенки опускают в гомогенизатор со средой 199 и осторожно выдавливают клетки пестиком. Далее клетки помещают во флакон со средой 199, суспензия отстаивается несколько минут для осаждения

- крупных конгломератов, оставшуюся суспензию клеток наносят на градиент фиколл .— верографина и центрифугируют 35 мин при 400g. Клетки "облачка", собранные из интерфазы, отмывают один раз срепой 199 и разводят до концентрации 4 х10 клеток на 1 мл. К 0,2 мл суспензии лимфоцитов (конечная концентрация 2,6х10 клеток/мл)

6 приливают 2,5 мкг конканавалина А в 0,1 мл (конечная концентрация 8,3 мкг/мл), инкубируют 60 мин при 37 С. Обработанные конканавалином А клетки закапывают в лунки с сывороткой реципиента для постановки перекрестной пробы.

Постановка реакции. По 1 мкл сыворотки реципиента закапывают в лунку планшета Терасаки под ваэелиновое масло.

Суспензию лимфоцитов раскапывают по 1 мкл в лунку, инкубируют 30 — 40 мин при комнатной температуре. В лунку добавляют 5 мкл свежеразмороженного комплемента кролика и.инкубируют один час, закапывают в лунки 3 мкл 5%-ного водного раствора эозина, через 2 мин закапывают 5 мкл 40%ного нейтрального формалина для остановки реакции. Чтение реакции осуществляют при помощи инвертированного. микроскопа: проба оказалась положительной, так как количество мертвых клеток в лунках с сывороткой реципиента составило 50, а в лунках без сыворотки (контроль) 5%, Заключение, Проба положительная— операция не рекомендована. Однако, поскольку способ на стадии проверки, аллотрансплантация проведена 4.02,88 по показаниям известного способа. Биопсия трансплантата на четвертый день показала криз отторжения и 1.03.88 аллотрансплантат удалили.

Il p и м е р 2. Реципиент Я., донор К.

Аллотрансплантация 1.09.87. Выбор донора по известному способу — рекомендована аплотранеплантация.

Определение по предлагаемому способу, Выделение клеток из селезенки. Селезенку донора измельчают ножницами, кусочки селезенки опускают в гомогенизатор со средой 199 и осторожно выдавливают клетки пестиком, Далее клетки помещают

10 во флакон со средой 199, суспензия остаивается несколько минут для осаждения крупных конгломератов, оставшуюся суспензию наносят на градиент фиколл — еерографина и центрифугируют 35 мин при 400g.

15 Клетки "облачка", собранные из интерфазы. отмывают один раз средой 199 и разводят до концентрации 4 х10 клеток в 1 мл. К 0,2 мл суспензии лимфоцитов (конечная концентрация 2,6х10 клеток/мл) приливают

20 2,5 мкг конканавалина А в 0,1 мл среды 199 (конечная концентрация 8,3 мкгlмл), инкубируют 60 мин при 37 С, Обработанные конканавалином А клетки закапывают в лунки с сывороткой реципиента для постановки

25 перекрестной пробы.

Постановка реакции. По 1 мкл сыворотки реципиента закапывают в лунку планшета Терасаки под вазелиновое масло. 1 мкл суспензии лимфоцитов закапывают в лунки, 30 инкубируют 30-40 мин при комнатной температуре. В лунки добавляют 5 мкл свежеразмороженного комплемента кролика и инкубируют один час, закапывают в лунки по 3 мкл 5%-кого водного раствора эозина.

35 через 2 мин останавливают реакцию 5 мкл

40 -ного нейтрального формалина. Чтение реакции осуществляют при помощи инвертированного микроскопа; сыворотка реципиента не проявляет цитотоксического

40 эффекта (все клетки живые).

Заключение. Проба отрицательная- пересадка рекомендована. Через полтора года почка функционирует.

Пример 3. Реципиент 3„ донор К.

45 Аллотрансплантация почки 18,04,87, Выбор донора по известному способу — рекомендо. вана аллотрансплантация.

Определение по предлагаемому способу.

50 Выделение клеток из селезенки. Селезенку донора измельчают ножницами, кусочки селезенки опускают в гомогенизатор,. со средой 199 и осторожно выдавливают клетки пестиком. Далее клетки помещают

55 во флакон со средой 199, суспензия отстаивается несколько минут для осаждения крупных конгломератов, оставшуюся суспензию клеток наносят на градиент фиколл — верографина и центрифугируют 35 мин при 400g. Клетки "облачка", собранные из

1725124

Формула изобретения

Способ выбора донора при аллотрансплантации почки, включающий постановку микролимфототоксического теста при смешивании лимфоцитов донора и сыворотки крови реципиента с последующим учетом результатов реакции, о т л и.ч а ю щ и.й с я тем, что, с целью повышения точности способа, лимфоциты донора.в койечной концентрации 2,6 10 клеток/мл. предварительно инкубируют в присутствии конканавалина А в конечной концентрации 6,6-8,6 мкг/мл в течение 50-60 мин при 37ОС.

Составитель П,Бонарцев

Техред M.Mîðãåíòàë Корректор О.Ципле

Редактор И.Горная

Заказ 1172 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, )К-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород. ул.Гагарина, 101 интерфазы, отмывают один раз средой 199 и разводят до концентрации 4 х10 клеток в мл, К 0,2 мл суспенэии лимфоцитов (конечная концентрация 2.6 х10 клеток/мл) приливают 2,0 мкг конканавалина A e 0,1 мл 5 (конечная концентрация 6,6 мкг/Mn), инкубируют 50 мин при 37 С. Обработанные конканавалином А клетки закапывают в лунки с сывороткой реципиента для постановки перекрестной пробы, 10

Поставнока реакции, По 1 мкл сыворотки реципиента закапывают в лунку планшета Терасаки. под вазелиновое масло.

Суспензию лимфоцитов раскапывают по 1 мкл влунку,инкубируют30-40мин приком- 15 натной температуре. В лунку добавляют 5 мкл свежеразмороженного комплемента кролика и инкубируют один час, закапывают в лунки 3 мкл 5 -ного водного раствора эозина, через 2 мин закапывают 5 мкл 40%- 20 ного нейтрального формалина для остановки реакции. Чтение реакции осуществляют при помощи инвертированного микроско.па: проба оказалась положительной, так как количество мертвых клеток в лунках с сыво- 25 роткой реципиента составляло 35%, а в лунках без сыворотки (контроль) 5 .

Заключение. Проба положительная-операция не рекомендована. Однако; поскольку способ на стадии проверки, аллот- 30 рансплантация проведена 18;04.87 по показаниям известного способа. Аллотрансплантат удален через 10 мес из-за некупирующейся реакции отторжения, Для осуществления. способа выбора до- 35 нора сыворотки 56 реципиентов исследова-, ли на наличие антител к донорским лимфоцитам, обработанным конканавалином А. Сыворотки 32 человек были отрицательными, у 24 в сыворотках определялить 40 антитела к донорским лимфоцитам, обра- . ботанным конканавалином А. Реципиенты, не имеющие антител к донорским лимфоцитам, обработанным конканавалином А имели статистически достоверно лучшие,45 результаты аллотрансплантации почки по сравнению с серопозитивными реципиентами (количество удаленных трансплантатов составляло 40,6 и 70,8% соответственно). Таким образом, больные, имеющие антидонорские.антитела составляют группу риска (51,8 ), которую позволяет выявить предлагаемый метод.

Сравнивая результаты аллотрансплантации у больных, имеющих антитела к донорским клеткам, обработанным конканавалином А, с результатами пересадки, проведенной со.гласно результатам реакции известного способа (у всех 56 исследованных больных реакция — была отрицательная), отмечено улучшение результатов аллотрансплантации на 17% (статистически не достоверное).

При сравнении данных bio результатам выживаемости пересаженной почки в зависимости от результатов. микролимфоцитотоксического теста по предлагаемому способу и данных по группе больных с положительными реакциями, которые по известному способу: были оценены как отрицательные, т.е. рекомендовалась аллотрансплантация почки, которая и была осуществлена, установлено; что в 71% случаев произошло отторжение пересаженной почки, что является доказательством специфичности предлагаемого способа, так как в этой группе реципиентов не была рекомендована пересадка, поскольку реакция была оценена как положительная,