Способ определения тиолов

 

Изобретение относится к электрохимическим способам анализа тиолов (соединений общей формулы PSH) путем электролиза исследуемой пробы. С целью упрощения и уменьшения токсичности способа электролиз ведется в 0,1 М калий-фосфатном буферном растворе, рН 5,5-8,0, с использованием графитовых электродов, модифицированных производными тетрациано-п-хинодиметана, тетратиофульвалена и ферроцена, при потенциале 0,2-0,1 В отн, н.к.э. Измеряется анодный ток, по увеличению которого определяется концентрация тиола. Способ может быть использован для анализа сточных вод и биологических жидкостей. 9 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 G 01 N 27/333

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПЙСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 4

ЬЭ

00 3

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4811081/25 (22) 06.04.90 (46) 23.04.92, Бюл. N 15 (71) Институт биохимии AH ЛитССР (72) Ю.Ю.Кулис. А,А.Друнгилене и Г,Ю,Балтакис (53) 543,257(088.8) (56) ЖАХ, 1983, т. 38. N 7, с. 1283.

Goodson Н, et al. In. Methods in

enzymology. Ed. by Mosboen К., New 1огК

San FrancIsco, London, Academic Press, 1976, ч. 44, р. 647. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИОЛОВ

Изобретение относится к электрическим способам анализа. конкретно к усовершенст-. вованию способа определения концентрации тиолов, соединений содержащих SH группу, и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве или других областях народного хозяйства для аналитических целей.

Тиолы — класс органических соединений, содержащих при атоме углерода группу

-SH (сульфгидрильную или меркаптогруппу). К тиоловым соединениям относятся и две аминокислоты — L-цистеин и глутатион, которые встречаются во всех животных тканях и играют важную роль в биохимии клетки. Некоторые тиолы, как например

2,3-димеркаптопропанол. находят применение в медицине как антидоты при отравлениях мышьяком, ртутью и при других интоксикациях, а также при аритмиях сердца, гепатоце Ы 1728771 А1 (57) Изобретение относится к электрохимическим способам анализа тиолов (соединений общей формулы PSH) путем электролиза исследуемой пробы. С целью упрощения и уменьшения токсичности способа электролиз ведется в 0,1 М калий-фосфатном буферном растворе, рН 5,5-8,0, с использованием графитовых электродов, модифицированных производными тетрациано-п-хинодиметана, тетратиофульвалена и ферроцена, при потенциале 0,2-0.1 В отн, н.к.э, Измеряется анодный ток, по увеличению которого определяется концентрация тиола. Способ может быть использован для анализа сточных вод и биологических жидкостей, 9 табл. ребральной дистрофии. Алифатические амины (2-меркаптоэтиламин) являются признанными радиозащитными агентами. Некоторые меркаптаны используют также в качестве пестицидов, в производстве полимеров и в других областях народного хозяйства. Поэтому определение тиолов важно не только в медицине, но и в сельском хозяйстве, мониторинге окружающей среды.

Известен гальваностатический способ определения тиохолина, Определение выполняется в 0,08 Ч трис-HCI буферном растворе, рН 7,4 с использованием сетчатого платинового анода и катода диаметром 1 см, предварительно подготовленный по спецметодике (кипячение в растворе НИОз, выдерживание в 3%-ном HzPtCls и 0,03%-ном ацетате свинца при потенциале 25 В 5 мин, Получаются оба одинаковые электроды платинированной пластины. После первого из1728771 мерения анод покрывается каким-то материалом, Через них пропускается постоянный ток величиной 2 мкА (снабжение током происходит от батареии 9 В) и определяется падение потенциала на аноде при наличии в растворе тиохолина, Концентрация тиола определяется по калибровочной кривой.

Природа разности потенциала неясна. Он может определяться как редокс-превращением тиолового соединения, так и поляризацией анода из-за образования поверхностных соединений типа сульфидов платины.

Недостатком этого метода является то, что в нем используются драгоценные металлы (платина), требуются специальные реагенты, часть которых ядовита и агресивна (НКОз. H2PtClo, ацетат свинца). С использованием этой системы возможно определение тиоловых соединений лишь в чистых буферных растворах, в которых отсутствуют другие электрогенные соединения.

Наиболее близким к предлагаемому является амперометрический способ определения тиолов в боратном буферном растворе, рН 8,2-8,6 с использованием амальгамированного серебряного электрода. Амальгамированный серебряный электрод представляет собой серебряную проволоку, впаянную или вставленную с помощью эпоксидной смолы в стекло. Для получения амальгамы серебра торец электрода шлифуется до зеркальной поверхности и опускается на 2 мин в металлическую ртуть. B электрохимическую ячейку с 5 мл буферного раствора неизвестной концентрации тиола вводится амальгамированный серебряный и насыщенный каломельный электроды. В. течение 20 мин удаляют кислород и проводят электролиз раствора при потенциале — 0,55 В отн. н,к.э. Концентрацию находят по градуировочному графику.

В реакции тиохолина со ртутью образуются меркаптиды типа Hgg(SR)z, где

R=CHz-ÑHð-N (СНз)з, которые восстанавливаются на электроде при потенциале—

0,55 В (отн, н.к.э):

Hgz(SR)z+ 2Н+ 2е — - 2ВЯН+2Н9 .

Предельный катодный ток пропорционален концентрации тиола.

Чувствительность ртутно-серебряного электрода 0,011 А/М.

Недостатком способа является то, что он очень токсичен, так как включает использование металлической ртути, очень летучего и ядовитого металла, использование которого требует специально подготовленных и оборудованных помещений. Кроме того, метод неселективен, так как определение проводится при потенциале — 0,55 В отн. н,к.э., при котором осуществляется превращение многих примесных соединений, находящихся в реальных растворах— кислорода, ионов тяжелых металлов (Pb, Ni), хиноновых и нитросоединений и др, Способ занимает много времени, так как перед каждым определением надо удалять кислород, который находится во всех водных растворах, Целью изобретения является упрощение и уменьшение токсичности процесса определения тиолов.

Сущность способа объясняется следующей схемой, Адсорбированный на графитовом электроде модификатор М«реагирует с тиолами. Восстановленная форма модификатора

Mgpc окисляется электрохимически при потенциалах их редокс-превращения;

М«+ 2RSH — Мвос+ (RS)2+2H

Меос-2е — «Mpx.

Способ реализуется с использованием вращающийся графитовый электрод, электродом сравнения служит насыщенный каломельный электрод, вспомогательным — Pt пластинка) определяется остаточный ток. В раствор вводится 50 мкл раствора тиола. В течение 30 с устанавливается новый стаци50 онарный уровень анодного тока, по изменению которого определяется концентрация тиола.

Зависимость тока электрода от концентрации тиола приведена в табл,1.

Потенциал Е=0,15 В отн. н.к,э., скорость вращения электрода в = 325 об/мин.

Как видно из табл,1. калибровочные кривые обладают линейной характеристикой до 0,6-0,7 мМ (L-цистеин. глутатион.

55 графитовых электродов, изготовленных из стержней (диаметром 5,9 мм) спектрально чистого графита. К одному концу стержня длиной 3-6 мм при помощи серебряного эпок25 сидного клея приклеивается медная проволока, другой конец шлифуется наждачной бумагой (250 мкм) и на нем адсорбируется модификатор. Электроды впрессовываются в тефлоновый корпус.

30 Пример 1. Определение тиолов;

L-цистеина, глутатиона, меркаптоэтиламина и дитиотриэтбла с использованием графитового электрода, модифицированного тетрациано-и-хинодиметаном (ТЦХМ).

35 Электрод модифицируется путем нанесения на поверхность 40 мкл раствора

ТЦХМ в толуоле (6 мг/мл). Растворитель упаривается в воздухе в течение 2 ч, Электрод погружается в термостатированную при

40 25 С стеклянную ячейку с 20 мл 0,1 M калийфосфатного буферного раствора, рН 7,0, и с помощью полярографа "ОН 105" по 3-электродной схеме (B качестве рабочего электрода используется модифицированный

1728771 меркаптоэтанол, меркаптоэтиламин) и 0,25 мМ (дитиотриэтол). При больших концентрациях калибровочные кривые загибаются.

Стандартные отклонения в линейных участках калибровочных кривых составляют 0,23 мкА для L-цистеина, 0,28 мкА для глутатиона, 0,27 мкА для меркаптоэтанола, 0,24 мкА для дитиотриэтола и 0,36 мкА для меркаптоэтиламина. Чувствительность, т,е, тангенс угла наклона прямых, составляет 0,034; 0,014;

0,030; 0,023 и 0,042 А/М для L-цистеина, меркаптоэтанола, дитиотриэтола, глутатиона и меркаптоэтиламина соответственно(чувствительность по известному способу 0,011 А/M).

Пример 2. Электрод изготавливается как в примере t, Проводится калибровка электрода по отношению к L-цистеину и глутатиону при разных потенциалах электрода (табл.2). Концентрации: L-цистеина 0,25 мМ, глутатиона 0,4 мМ. Другие условия как в примере 1;

Как видно из табл.2, в интервале от 0,3 до-0,1 В практически можно r.ðîâåcòè измерения, но оптимальные условия проведения измерений обеспечиваются при потенциале 0,15-0,075 В отн. н.к.э., поскольку отношение тока электрода к остаточному току

S/N наибольшее при этих значениях потенциала, Ниже указанного предела (т.е, — 0,2 В) не наблюдается окисление тиолов, а при потенциале более 0,2 В значительно возрастает остаточный ток, обусловленный побочными электрохимическими превращениями на рабочем электроде.

Пример 3, Электрод изготавливается как в примере 1. Проводится калибровка электрода пв отношению к L-цистеину, глутатиону и дитиотриэтолу при разных рН во всем интервале рН калий-фосфатного буферного раствора (табл.3) .Концентрации: 1цистеина 0,15 мМ, глутатиона и дитиотриэтола 0,10 мМ. Потенциал электрода

0 15 В отн. н.к.э. Другие условия как в примере 1.

Как видно из табл.3, при рН 5,5-8.0 проходит окисление тиолов, поэтому в данном интервале способ может быть осуществлен, Однако с переходом из кислых сред к нейтральным и слабощелочным увеличивается ток, Следовательно, наибольшая чувствительность определений обеспечивается при р Н 7,25-8,0.

Пример 4. Электрод изготавливается как в примере 1. Определяется зависимость тока электрода от скорости вращения электрода при потенциале 0,15 В (табл.4). Другие условия как в примере 1, Как видно из табл, 4, при повышении скорости вращения электрода стационарный ток увеличивается незначительно. Поэ(ТТФ).

20 На графитовый электрод- диаметром

5,9 мМ наносится 40 мкл раствора ТТФ в толуоле (34 мг/мл). Растворитель упаривается в воздухе в течение 2 ч, электрод norpy25

35

45

55

15 тому во всех исследованиях использована достаточная скорость вращения 325 об/мин.

Пример 5, Определение стабильности электрода во времени. Электрод изготавливается как в примере 1. В течение 2 мес измеряется величина тока в присутствии 0,5 мМ L-цистеина. Условия определения как в примере 1, Результаты

О зависимости тока от продолжительности сохранения электрода представлены в табл,5, Из табл,5 видно, что модифицированный ТЦХМ электрод сохраняет работоспособность в течение не менее 2 мес. За это время ток падает только на 20

Пример 6. Определение тиолов с использованием графитового электрода, модифицированного тетратиофульваленом жается в 20 мл 0,1 M калий-фосфатного раствора, рН 70,0, и определяется ток. В раствор вводится 50 мкл раствора.тиола в том же буферном растворе. В течение 30 с устанавливается новый стационарный уровень тока электрода.

Зависимость тока электрода от концентрации тиола приведена в табл.6, Е=0,1 В отн, н.к.э. (только в случае L-цистеина 0,15 В), в =325 об/мин, t= 25 С.

Как видно из табл.6, калибровочные кривые обладают линейной характеристикой до 0,5-0,6 мМ (1=цистеин, глутатион, меркаптоэтанол и меркаптоэтиламин) и до

0,25 MM (дитиотриэтол). При больших концентрациях калибровочные кривые загибаются, Стандартные отклонения в линейном участке калибровочных кривых составляют

0,36 мкА для 1=цистеина, 0,05 мкА для меркаптоэтиламина, 0,004 мкА для глутатиона, 0,003 мкА для меркаптоэтанола и 0,34 мкА для дитиотриэтола, a чувствительность составляет 0,034; 0,001; 0,003; 0,020 и 0,005

А/М для L-цистеина, глутатиона, маркаптоэтанола, дитиоэтола и меркаптоэтиламина соответственно.

Пример 7. Электрод изготавливается как в примере 6. Проводится калибровка электрода по отношению к L-цистеину и глутатиону при разных потенциалах электрода (табл,7), Концентрация L-цистеина 0,5 мМ, а глутатиона 0,1 ММ, Другие. условия как в примере 6, Как видно из табл.7, и остаточный ток, и ток электрода значительно уменьшаются при изменении потенциала от+0,2 до -0,1 B

1728771

Таблица 1

Дитиотриэтол.

Мерка птоэтанол

Меркаптоэтиламин

Глутатион

I=цистеи н

I,ìêÀ мМ

1,мкА

I,мкА

l,ìêÀ

I,мкд

3,96

7,56

11,16

14,64

18,00

21,00

23,64

26,16

28,32

30,36

31,32

33,48

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

2,28

4.68

7,32

9,96

12,12

14,28

16,2

18,2

19,92

21,96

23,76

25,68

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

1,92

3,12

4,56

6,24

7,20

9,36

10,44

11,40

12,00

12,96

13,92

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0;30

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65

2,04

3,60

5,04

6,36

7,80

9,00

10,32

11,20

12,48

13,56

14,40

15,36

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

4,32

9,12

13,44

17,52

21,84

25,92

29,52

33,36

37,44

40,80

48,00 отн. н.к.э. Наилучшее отношение $/N в области 0,15-0,05 В отн, н,к.э.

Пример 8, Электрод изготавливается как в примере 6. Проводится калибровка электрода по отношению к L - цистеину, глутатиону и дитиотриэтолу при разных рН (табл.8), Концентрация L-цистеина 0,4 мМ, глутатиона 0,9 мМ и дитиотриэтола 0,2 мМ, Е = 0,1 В отн.н,к.э.Другие условия как в примере 6.

Как видно из табл.8, чувствительность электрода значительно вырастает при переходе из кислых сред в нейтральные и щелочные.

Пример 9, Определение тиола с использованием графитового электрода, модифицированного ДМФЦ (53 мг/мл).

Растворитель упаривается в воздухе в течение 2 ч. Стационарный ток окисления тиола регистрируется как в примере 1, Зависимость тока электрода от концентрации меркаптоэтиламина в 0,1 М калий-фосфатном буферном растворе, рН 7,0, при потенциале 0,1 8 отн, н.к.э., в = 325 об/мин, t= 25 С приведена в табл.9.

Как видно из табл.9, калибровочная кривая обладает линейной характеристикой от

1 мМ, чувствительность в этом интервале

0,003 A/M, стандартное отклонение 0,03 мкА.

Преимуществом способа является упрощение определения концентрации тиолов, вступающих в реакцию с модификатором на графитовом электроде с образованием вос5 становленной формы медиатора, его последующим электрохимическим окислением и увеличением анодного тока. В отличие от известного способа исключено использование металлической ртути, что требует специ10 ально подготовленного и оборудованного помещения. Исключается также предварительное удаление кислорода перед определением, занимающее 20 мин; используемый электрод не реагирует на кислород, способ

15 более специфичен и экспрессивен.

Формула изобретения

Способ определения тиолов, включающий электропиз исследуемого вещества в

20 буферном растворе и измерение тока с последующим определением концентрации тиола, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и уменьшения токсичности, электролиз ведут в калий-фосфатном

25 буфере в интервале потенциалов от 0,3 до

-0,1 В отн. н,к,э, с использованием графитового электрода, химически модифицированного производными тетрацианохинодиметана, тетратиофульвалена или ферроцена, и. кон30 центрацию тиола определяют по увеличению анодного тока.

1728771

Таблица 2

Гл атион

S/N

S/N

I,ìêÀ

1ост, мкА

1,мкА

Таблица 3

Таблица 4

Е,В (отн.н.к.э.) 0,300

0,250

0,200

0,175

0,150

0,125

0,100

0,075

0,050

0,00.0

-0,100

-0.2! ост, мкА

0,56

0,36

0,24

0,12

0,03

0,001

0,001

-0,03

-0,08

-0,15

-0,24

-0,05

L - истеин

8,76

9,36

6,96

7,32, 9,12

8,16

6,24

5,88

4,80

3,48

0,84

15,6

26,0

29,0

61,0

304

196

23,2

3,5

0,72

0,42

0,18

0,10

0,001

0,001

0,001

0,01

-0,10

-0,21

-0,30

-1,10

8,40

8,80

7,0&

8,76

9,24 9,60

9.,24

7,20

5,28

2,52

0,6

11,7

20,9

39,3

87,6

52,8

12

1728771

Таблица 5

Таблица 6

Меркаптоэтанол

Дитиотризтол

Глутатион

Меркаптоэтиламин

L- цистеин

1, мкд мМ

1, мкд

i, мкд

1, мкА

I, мкА

Таблица 7

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

4,0

7,2

10.8

14,8

18,0

20,8

23,6

26,0

28,4

30,0

32,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

0,144

0,264

0,396

0,528

0.648

0,744

0,840

0,936

1,02

1,10

1,18

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

0,42

0,79

1,12

1,45

1,70

2,03

2,30

2,52

2,70

2.87

0,05

0,10

0,15

0,20

0.25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,88

2,70

3,32

4,24

5,16

5,80

6,24

6,72

7,12

7,52 . 7,84

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9 t,0

1,1

0,60

1,08

1,52

2,00

2.44

2,76

3.12

3,44

3,76

4,04

4,32

1728771

Таблица 8

Таблица 9

0,2

1.8

1,4

0,4

0,6

1,0

0,8

1,2

4,46 4,82

I, мкА

0,56

1,93 2,53

1,25

3,17

3,59 4,07

Корректор Т.Малец. Редактор В.Петраш

Заказ 1404 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Меркаптоэтиламин, мМ

Составитель Ю.Кулис

Техред M.Ìîðãåíòàë