Способ определения адреналина
Изобретение относится к физико-химическим методам анализа моноаминов и может быть использовано для клинического и токсилогического анализов в медицине и фармакологии. Цель изобретения - повышение чувствительности способа. Способ включает в себя следующие операции: к анализируемой пробе добавляют нитрит натрия и соляную кислоту концентрации 0,1- 0,2М, продувают воздухом не менее 20 мин, далее вносят серотонин и инкубируют в присутствии биокатализатора с моноаминоксидазной активностью до полного дезаминирования серотонина с последующим потенциометрическим определением выделившегося аммиака. Предел обнаружения адреналина 1 моль/л, что а 2 раза ниже, чем по известному способу.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (5ц s G 01 N 33/74
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
1 (21) 4620084/14 (22) 12.12.88 (46) 23,08.92. Бюл. N. 31 (71) Латвийский государственный университет им. П.Стучки (72) Б.А.Гринберг, Е.В.Никольская, Д.Ю.Балцере О.В.Ягодина и Л,П.Кузнецова (56) Авторское свидетельство СССР по заявке N- 4460126/30-14, кл. 6 01 N 33/74, 14.07.88. (54) СГ!ОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДРЕНАЛИНА (57) Изобретение относится к физико-химическим методам анализа моноаминов и может быть использовано для клинического и
Изобретение относится к физико-химическим методам анализа моноаминов и может быть использовано для клинического и токсикологического анализов в медицине и фа рмакологии. l
Кель изобретения — повышение чувствительности способа.
Способ осуществляется следующим образом.
К исследуемой пробе, содержащей адреналин, добавляют соляную кислоту до конечной концентрации 0,1-0,2 М, затем нитрит натрия до конечной концентрацйй
0,1-0,2 М. Чсрез 20 мий реакционную смесь продувают воздухом в течение не менее 20 мин.
П олучен ную пробу, содержащую нитрозо. амин адреналина, добавляют к биоспецифическому катализатору с моноаминоксидазной
«.,!Ж, 1756825 А1 токсилогического анализов в медицине и фармакологии. Цель изобретения — повышение чувствительности способа, Способ включает в себя следующие операции: к анализируемой пробе добавляют нитрит натрия и соляную кислоту концентрации 0,10,2М, продувают воздухом не менее 20 мин, далее вносят серотонин и инкубируют в присутствии биокаталиэатора с моноаминоксидэзной активностью до полного дезаминирования серотонийа с последующим потенциометрическим определением выделившегося аммиака. Предел обнаружения адреналина 1 .10 моль/л, что в 2 раза ниже, чем по известному способу. (MAO) активностью и термостатируют. пропуская через ячейку кислород, затем в реакционную смесь добавляют серотонин (5 10
М) и измеряют время падейия рН на 20 мВ в присутствии и в отсутствии серотонина. По градуировочной зависимости с использованием метода стандартных добавочных проб определяют содержание адреналина в последуемой пробе, исходя из формул
V/Vlx 1= Kjlx) (1)
V/Чп-1= Kfl x+а); C2)
Ч/Viz-1=ф„+2а), (3) где Ч вЂ” скорость ферментативной реакции в отсутствии серотонина (холостой опыт);
Vi — скорость ферментативной реакции в присутствии серотонина (ингибитора):
Чп, Vj2 — скорости ферментативных реакций в присутствии различных количеств добавленного серотонина.
1756825
К вЂ” константа;
I< — концентрацил адреналина в исследуемом растворе; а — стандартная концентрация адренаг лина в добавленной пробе, Пример 1. Для построенил градуировочнай зависимости 8.24 мг адреналина растворяют в 4,5 мл О, 1 í. HCi, затем добавляют 31 мг йаМ02. Через 20 мин реакционную смесь продува1от воздухом в течение 20 10 мин. Получают 4,5 мл 0,01 моль/л нитроэоамина адреналина, который используют в дальнейших определениях в концентрациях
4,5 1О 7 моль/л — 7,2 .10 " моль/л.
0,5 г биоспецифического катализатора с 15
МА0-активностью помещают между мембранами ячейки (1) и промывают 0,01 моль/л раствором боратного буфера (рН 7.6) и бидистиллированной водой. Ячейку помещают в сосуд для измерений с газовыM 20 зазором, добавляют 1,8 мл 0,1 моль/л боратного буфера рН 9,0, 2 мл стандартного раствора нитрозоамина адреналина концентрацией 4 5 10 . 9 10, 1,8 10 б, 3,6х х10, 7.2 10 моль/л, или 1,8 мл HzO. 25
-6
Измерительный сосуд закрывают, помещают в термастат при 25ОС, включают магнитную мешалку и пропускают Oz без
СО2 до установления постоянного значенил потенциала на потенциометре (около 10 30 мин). Далее поток Oz перекрывают, в реакционную смесь добавляют 0,2 мл сератонина в концентрации 1 10 моль/n (в смеси
5. 10 5 моль/л), герметически закрывают со35 суд и измеряют время падения рН от 7,05 до 3 э
7,38 (на 20 мВ) в присутствии ингибитара нитрозаамина адреналина и в его отсутствии. Рассчитывают отношение V/Чп и строят градуировочную зависимость, 40
Пример 2. К 1,5 мл 1 10 моль/л
-5 раствора адреналина добавляют 4,5 мл
0.137 М соляной кислоты (концентрации в пробе 0,1 моль/л), затем добавляют 42 мг нитрита натрия (концентрация в пробе 0,1 45 моль/л). Через 20 мин реакционную смесь продувают воздухом в течение 20 мин. Получают 6 мл 2,5 10 б моль/л нитрозоамина адреналина. который делят на 2 порции, и определение активности УАО проводит 50 аналогично примеру 1, только в реакционную смесь вводят 0,2 мл серотина в концентрации 1 10 моль/л (в смеси 5,10 моль/л).
По градуировочному графику находят концентрацию адреналина в пробе, т.е. 55
1,25 10 моль/л, но при определении активности МАО происходило разбавление . начальной пробы в 8 раз, следовательно, 5 .исходная концентрация 1 10 моль/л.
Пример Э. К 1 5 М 1 10 моль/л раствора адреналина добавляют 4,5 мл 0,7, M НС! (концентрацил в пробе О,"5 моль/л), затем добавлл1от 62 мг йай02 (концентрацил в пробе 0,15 моль/л). Через 20 мин реакционную смесь продувают воздухом в течение 20 мин. Получают б мл 2,5 10 моль/л нитрозоамина адреналина, который делят по 2 мл на порции и далее определение ведут аналогично примеру 1), только используют 0,1 мл 1 10 моль/л раствора
-5 сератонина (в пробе концентрацил 1 "IO моль/л).
По градуировочному графику находят концентрацию адреналина в пробе, т.е.
1,25 10 моль/л, но при определении активности MAO происходило разбавление начальной пробы в 2 раза, следовательно„ исходная концентрация составляет 2,5 10 моль/л.
П ри ме р4. К15мл1.10 моль/л раствора адреналина добавляют 4,5 мл
0,275 M HCI (концентрация в пробе 0,2 моль/л), затем добавляют 84 мг NaN02(концентрация в пробе 0,2 моль/л). Через 20 мин реакционную смесь продувают воздухом в течение 30 мин, Получают 6 мл 2,5 10 б моль/л нитрозоамина адреналина, который делят по 2 мл на порции и определение активности MAO проводят аналогично примеру 1.
По градуировочному графику находит концентаацию адреналина в пробе, т.е.
1,25 10 моль/л, но при определении активности MAO происходило разбавление начальной пробы в 2 раза, следовательно, -6 исходная концентрация 2,5 10 моль/л.
Пример 5. Для анализа биологической пробы (плазма крови крысы) ее делят на три части, где к первой части ничего не добавляют, к второй части добавляют адреналина концентрацией 1 .10 моль/л (концентра-б ция в пробе 5 10 моль/n) и к третьей части добавляют адреналина 2 10 моль/л (концентрация в пробе 1 10 моль/n).
Далее во все три пробы добавляют 0,5 r .
NBNO2 и 0.1 мл 2M HCI и пропускают через раствор воздух в течение 20 мин длл удаления окислов азота. В реакционну1о смесь добавллют 2 мл 0,1 моль/л боратного буфера рН 9,0 и 1,8 мл подготовленной пробы без
-7 добавки и с добавкой адреналина 5 10 и i 10 моль/л, далее проводлт все операции аналогична примеру 1.
Концентрацию адреналина рассчитывают по формулам (1)-(3). Обнаружена, что плазме крови крысы концентрация адреналина 5 10 моль/л.
-9 1756825
Составитель H. Гуляева
Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор И. Муска
Редактор 8. Данко
Заказ 3085 Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5.
Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101
Пример 6. Для анализа биологической пробы — крови человека — необходимо анализируемую пробу разделить на три части, где к первой ничего не добавляют, к второй части добавляют адреналин в концентрации 5
1 10 моль/л(концентрация в пробе 5 10 моль/л) и к третьей части добавляют адрвналин в концентрацию 2 10 6 моль/л (концентрация в пробе 1 10 моль/л). Далее определение ведут аналогично примеру 5. "10
Концентрацию адреналина в крови рассчитывают по формулам (1)-(3). Обнаружено, что в крови куон ентрация адреналина составляет 2,55 10 моль/л.
Пример 7. Аналогично, как в примере 15
5. определяют адреналин в экстракте мышцы крысы. Концентрацию адреналина также рассчитывают по формулам (1)-(3). Обнаружено, что в экстракте мышцы крысы содержится 2. 10 моль/л адреналина. 20
Пример 8. Для анализа биологической пробы-экстракта мышцы кролика — необходимо анализируемую пробу разделить на три части, где к первой части ничего не добавляют, к второй части добавляют адрена- 25 лин в концентрации 1 10 б моль/л (концентрация в пробе 5 10 моль/л) и к третьей части — адреналин в. концентрации
2 10 моль/л(концентрация впробе1 106 моль/л). 30
Далее определение ведут аналогично примеру 5, Концентрацию адреналина рассчитывают по формулам (1)-(3). Найдено, что в экстракте мышцы кролика концентрация адреналина составляет 1,65 10 .
Известным способом концентрацию адреналина в экстракте мышцы кролика определить невозможно.
По сравнению с известным использование предлагаемого способа позволяет по-,, высить чувствительность определения адреналина в биологических обьектах в 2 раза, Предел обнаружения адреналина в заявляемом способе составляет 1 10 моль/л, по известному способу предел обнаружения равен 2 10 М, Формула изобретения
Способ определения адреналина, включающий добавление в йсследуемую пробу серотонина, дезаминирование с использованием биоспецифического катализатора с моноаминоксидазной активностью и потенциометрическую регистрацию аммиака, о тлича ющийсятем,что,сцельюповышения чувствительности способа, перед введением в пробу серотонина в нее добавляют соляную кислоту и нитрит натрия в конечной концентрации О, t-0,2 м для каждой добавки, затем пробы продувают воздухом в течение не менее 20 мин.
