Способ определения кортикостероидов в плазме крови

 

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в физиологии. Цель изобретения - сокращение объема плазмы за счет повышения чувствительности способа при одновременном повышении точности Способ включает экстракцию кортикостероидов из 0,1 мл плазмы хлористым метиленом, замораживание плазмы с метиленхлоридным экстрактом и последующее сливание экстракта Затем добавляют к экстракту флюоресцентный реактив (смесь абсолютный этиловый спирт-серная кислота в отношении 3:7) и измеряют флюоресценцию Изобретение позволяет уменьшить минимально определяемое количество кортикостероидов в 15 раз

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)л G 01 N 33/74

1 -.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

VIO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

О

Од

Ю (21) 4624168/14 (22) 21.12.88 (46) 30,12.91. Бюл. ¹ 48 (71) Институт физиологии им, И.П. Павлова (72) Ю.Г, Балашов (53) 612.015(088.8) (56) Панов А.Н. Шамепина В.Г. Проблемы эндокринологии, 1968, т,14, N 2, с.75 — 77. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОРТИКОСТЕРОИДОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ (57) Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в физиологии.

Цель изобретения — сокращение объема

Изобретение относится к биохимии, может быть использовано в физиологии и позволяет определять содержание кортикостероидов в крови, свидетельствующее об активности гипофизарно-адренокортикальной системы.

Цель изобретения — сокращение объема плазмы за счет повышения чувствительно1сти способа при одновременном повышении точности, Способ осуществляется следующим об-. разом, В пробирки объемом 4,мл помещают 0,1 мл исследуемой жидкости (стандарт, контроль, плазма крови) и добавляют 1,5 мл хлористого метилена, Пробирки встряхивают на лабораторной качалке в течение 3 мин и замораживают в течение 20 мин при -20 С в холодильнике или в течение 1 — 2 мин с помощью охлаждающей смеси этиловый спирт — углекислота, при этом холестерин и другие липиды "вымораживаются" с водой.

Метиленхлоридный экстракт сливают с за„„Я „„1702321 А1 плазмы за счет повышения чувствительности способа при одновременном повышении точности, Способ включает экстракцию кортикостероидов из 0,1 мл плазмы хлористым метиленом, замораживание плазмы с метиленхлоридным экстрактом и последующее сливание экстракта, Затем добавляют к экстракту флюоресцентный реактив (смесь абсолютный этиловый спирт — серная кислота в отношении 3:7) и измеряют флюоресценцию. Изобретение позволяет уменьшить минимально определяемое количество кортикостероидов в 15 раз. мороженного слоя в чистые пробирки и в каждую пробирку добавляют с помощью микробюретки 0,5 мл флюоресцентного реакти ва (смесь серная кислота:абсол ютн ый этиловый спирт в соотношении 7;3 приготавливается медленным приливанием кислоты в спирт при охлаждении). Пробирки встряхивают на лабораторной качалке в течение 3 мин. Верхний слой хлористого метилена отсасывают с помощью пастеровской пипетки, соединенной с водоструйным насосом. Через 1,5 ч измеряют флюоресценцию. По флюоресценции стандартов и контроля строят калибровочную кривую и находят содержание кортикостероидов в испытуемых образцах. В общей сложности, определение 50 проб занимает 3 — 4 ч.

Способ поясняется следующим примером.

Пример. Определение кортикостероида в плазме крови крысы в хроническом опыте.

1702321

Формула изобретения

Способ определения кортикостероидов в плазме крови, включающий экстракцию плазмы метиленхлоридом, обработку метиленхлоридного экстракта смесью серной кислоты и этилового спирта с последующей регистрацией флюоресценции, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью сокращения объема плазмы за счет повышения чувствительности способа при одновременном повышении точности, пробу с добавленным хлористым метиленом встряхивают, замораживают, а метиленхлоридный экстракт сливают.

Составитель Н,Гуляева

Редактор А,Маковская Техред M.Mîðãåíòàë Корректор О. Кундри к

Заказ 4541 . Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101

Иэ хвостовой вены крысы набирают

0,26 мл крови и переносят в центрифужную пробирку. Пробу центрифугируют в течение

10 мин при 3500 об/мин, Отбирают 0,1 мл плазмы в пробирку объемом 4 мл, В анало- 5 гичные пробирки наливают по 0,1 мл бидистиллированной воды (контроль) и стандартного раствора, содержащего 0,5

,мкгlмл кортикостерона (стандарт). В каж дую пробирку добавляют 1,5 мл хлористого 10 ,метилена, встряхивают в течение 3 мин и затем замораживают в течение 20 мин при

-20 С в холодильнике. Метиленхлоридный экстракт сливают с замороженного водного слоя и добавляют к нему 0,5 мл флюорес- 15 центного реактива. Пробирки встряхивают в течение 3 мин, хлористый метилен отсасывают и через 1,5 ч измеряют флюо, ресценцию стандарта, контроля и пробы при длине волны возбуждения 470 нм, флю- 20 оресценции — 530 нм, При этом флюоресценцию стандарта выставляют равной

: 100; .. Расчет содержания кортикостерона в плазме крови проводят по следующей формуле; 25

Содержание корти костерона

ЖА-д3

PCт Дк где Ст — концентрация кортикостерона в стандартном растворе; 30

Дст — флюоресценция стандартного раствора;

Д» — флюоресценция контроля;

Дл — флюоресценция пробы.

Получены результаты: Ст = 0,5 мкгlмл;

Дст = 100; Дк = 5; Дп = 64.

Содержание кортикостерона

0,5 б4 — 5

100 — 5

= 0,311 мкг/мл, Предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет снизить объем исследуемой пробы в 10 раз (т.е, может считаться микрометодом), уменьшить минимальное определяемое количество кортикостероидов в 15 раз, уменьшить количество используемых реактивов (хлористого метилена — в

5,3 раза; петролейный эфир не используется; этилового спирта и серной кислоты — в

6 — 8 раз), снизить трудоемкость определения (уменьшает количество операций и устраняет встряхивание руками), за счет чего сокращается время определения и повышается точность тестирования в 2 раза.