Способ диагностики хронических поражений печени

 

Использование: медицина, гастроэнтерология . Сущность изобретения: определяют активность антиоксидантных ферментов: супероксиддиемутаэы, каталазы и НАДФ-Н-пероксидазы, рассчитывают отношение каталаза/НАДФ Н-пероксидаза. Полученное отношение установлено для различных нозологических форм диффузных заболеваний печени. Способ позволяет диагносциррвать при отношении: каталаза /РАДФ-Н-пероксидаза. равном 0,404 10 жировую дистрофию печени, 0,311 -10J - хронический активный гепатит, 0,222 -103- цирроз печени и 0,196- 103 - первичный билиарный цирроз, а фиброз печени диагносцируют при отношении 0,303 -103 и при одновременном снижении активности СОД. 1 табл.

союз соВетских

СОЦИАЛИС ГИ 1ЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (Я)s G 01 N 33/48

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4891890/14 (22) 18.12.90 (46) 15,04,93, Бюл, М 14 (71) Центральный научно-исследовательский институт гастрознтерологии (72) А. С. Логинов, Б, Н. Матюшин, В. Д.

Ткачев и Г, Н, Якимчук (56) Логинов А. С., Аруин Л. И, Клиническая морфология печени. M. Медицина, 1985. (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕ-.

СКИХ ПОРАЖЕНИЙ ПЕЧЕНИ (57) Использование: медицина, гастроэнтерология. Сущность изобретения: определяют активность антиоксидантных ферменИзобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии, может быть использовано для диагностики диффузных хронических заболеваний печени (жировая дистрофия, хронический активный гепатит, фиброз, цирроз и первичный билиарный цирроз) на основе объективной оценки в печени функционального статуса энэимов антиоксидантной защиты (супероксиддисмутаза-каталаза-НАДФ Н-пероксидаза) как сопряженной системы, контролирующей скорость реакций свободнорадикального окисления, способствующих развитию патологического процесса.

Целью изобретения является повышение точности диагностики хронических диф-. фузных поражений печени, при значительном сокращении времени выполнения анализа и получении объективных. ЯЦ„„180у384 А1 тов: супероксиддиемутаэы, каталаэы и

НАДФ Н-пероксидазы, рассчитывают отношение каталаза/НАДФ Н-пероксидаэа, Полученное отношение установлено для различных нозологических форм диффузных заболеваний печени. Способ позволяет диагносцировать при отношении: каталазэ

/РАДФ Н-пероксидаза, равном 0,404 10 жировую дистрофию печени, 0,311 10" хронический активный гепатит, 0,222 10 цирроз печени и 0,196 10 — первичный

3 билиарный цирроз, а фиброэ печени диагносцируют при отношении 0,303 10 и при

3 одновременном снижении активности СОД.

1 табл. данных при исследовании минимального количества биоптатэ (относительно морфологического анализа) на основе определения в части гепатобиоптата антиоксидантных энэимов, активность которых тесно связана с органной патологией на уровне свободнорадикальных процессов.

Поставленная цель достигается тем, что в части биоптата печени (10 — 15 мг), взятого для морфологического анализа, определяют активность супероксиддисмутаэы (СОД), катэлазы и НАДФ Н-пероксидаэы, Из биопсийного материала в условиях охлаждения готовят гомогенат (механическое растирание в стеклянном гомогенизаторе в течение

1 мин из расчета 10 мг ткани на 0,6 мл 1.157; хлорида калия), который центрифугируют 15 мин при 4 С и 10000д, Для анализа используют супернатант (микросомно-цитозоль1809384 ная фракция), который держат на холоде (при длительном хранении замораживают) до начала исследования, Активность СОД определяют по ингибированию скорости восстановления нитротетразолия голубого (НТГ) в неэнзиматической системе фаназинмемасульфата (ФМС) и НАДФ Н. Среда инкубации общим объемом 3 мл имеет следующий состав: 0,1

M фосфатный буфер рН 7,8; 0,33 мМ ЭДТА;

0,41 мМ НТГ,0,01 мМ ФМС и 0,8 мМ НАД.Н, В опытную пробу вносят также супернатант (примерно 0,1 мл), предварительно полученный из биоптата. Реакция запускается

НАД.H и регистрируется спектрофотометрически по приросту экстинкции в течение

5 мин при 540 нм, За единицу активности

СОД принимают количество фермента, необходимого для 50 Д ингибирования восстановления НТГ в условиях определения и выражают в усл, ед на 1 мг белка.

Об активности каталазы судят по убыли перекиси водорода (мкмоль/мин) на 1 мг белка при 240 нм в течение 5 мин. Для проведения реакции используют среду инкубации следующего состава: 50 мМ калий-фосфатный буфер рН 7,4; 0,1 MM ЗДТА; 10 мМ HzOz, В опытную пробу добавляют также супернатант (0,05 мл).

НАДФ Н вЂ” пероксидазную реакцию 30 проводят в среде инкубации, в которой донор водорода глутатион заменен на

НАДФ Н; 0,25 M фосфатный буфер рН 7,4; . 0,1 мМ ЗДТА; 0,05 M азид натрия; 0,05 мМ .НАДФ Н, В кювету спектрофотомера вно- 35 сят также 0,1 мл микросомно-цитозольной фракции. Об энзиматической активности судят по убыли НАДФ Н в мкмоль/мин на 1 мг белка, После проведения анализа и получения 40 конкретных значений находят процент снижения энзиматической активности СОД и каталазы относительно соответствующих . показателей при жировой дистрофии печени принятых за 100>, Далее рассчитывают 45 показатель отношения каталаза/НАДФ Нпероксидаза, который сравнивают с диапазоном значений, установленных для различных нозологических форм диффузных заболеваний печени(0,404 10 при жи- 50 ровой дистрофии печени, 0,311 . 10 при хроническом активном гепатите, 0,303 10 при фиброэе, 0,222 10 при циррозе и

0,196 10 при первичном билиарном цирpose), 55

Полученные результаты были тщательно проанализированы, статистически обработаны, подвергнуты корреляционному анализу и сопоставлены с данными клинико-биохимического, инструментального и морфологического исследования, Способ был апробирован на биопсийном материале

120 больных различными гастроэнтерологическими заболеваниями (см. таблицу).

Пример 1. Больной Ф., 38 лет. В части биоптата, получейного с диагностической целью спектрофотометрическим методом определяют активность СОД, каталазы и

НАДФ Н-пероксидаэы и рассчитывают показатель отношения каталаза/НАДФ Н-пероксидаза. Полученные при исследовании величины СОД (20,7), каталаэы (82,3)

НАДФ Н-пероксидаэы (0,204) и коэффициент каталаза/НАДФ *Н-пероксидаза (0,404 10з) сравнивают с диапазоном соответствующих значений, установленных для различных нозологических форм диффузных заболеваний печени. Найденные значения находятся в пределах варьирования показателей, установленных для жировой дистрофии печени.

Диагносцирована жировая дистрофия печени. llo данным морфологического анализа сделано заключение об умеренно выраженной жировой дистрофии (портальные тракты обычного вида, группы гепатоцитов с вакуолизированной цитоплаэмой, в некоторых гепатоцитах ядра содержат вакуоли), По предложенному способу диагностики и морфологическому исследованию верифицирован идентичный диагноз, Вместе с тем, следует отметить, что заключение о диагнозе по предложенному способу диагностики сделано в течение двух часов с момента проведения биопсии и затрачено 10 мг ткани, что во много раз (около 50) сокращает время исследования и требует меньше биопсийного материала.

Пример 2. Больная К„ 32 лет. В материале пункционной биопсии с помощью микрометодов исследования определяют активность энзимов антиоксидантной защиты гепатоцита. Найденные значения для СОД, каталаэы, НАДФ Н-пероксидазы и коэффициента каталаза/ пероксидаза. равные соответственно 15,8; 71,5;

0,229 и 0,312 .10 сопоставляют с аналогичными параметрами, выявленными для разных форм хронических болезней печени, Установлено снижение активности СОД (19,4ф ) каталаэы (14 (), коэффициента каталаза/НАДФ Н-пероксидаза до0,312 10 и увеличение скорости пераксидазной реакции (11,77) относительно жировой дистрофии печени, а показатели энзиматической активности больной К. находятся в пределах доверительного интервала аналогичных показателей больных хроническим активным

1809384

Каталаза/пеоксидаза

СОД

Группа боль- Число наблюНАДФ Н-пеокси аза

Катэлаза ений(п} ных

Жировая дистрофия пе0,404 10

19,6+ 1,4

83,1 3,2

0,205 +0,020 чени

Хронический активный гепатит

Фиброз

Цирроз пече0311 IO

0,303 10

16,2 }-0,99*

10,7 +1,6***

73,8 }-2,2*

0,237+ 0,023

0,269 «-0,035

81,4 +2,3

0,222 10

15,7}-3,8*

67,7+12,6

0,305 +0,075 ни

Первичный биллиарный цирроз

14,7 }-1, 1**

0,196 10

57,9+%,8****

0,295 +0,027*

П р и м е ч а н и е, Достоверность различий дана относительно группы больных жировой дистрофии печени и обозначена:

* — Р < 0,05, ** — Р < 0,02, ***-Р < 0,01, **** -Р<0,001

Составитель Б.Матюшин

Редактор В.Фельдман Техред M.Mîðãåíòàë - Корректор И.Шулла

Заказ 1283 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская нэб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 гепатитом, На основании сравнительного анализа делается заключение о хроническом активном гепатите, По данным морфологического анализа "в препарате имеется только часть одного портального тракта, Инфильтрат в этом тракте имеет вид лимфатического фолликула", В заключении морфолога сказано: "в связи с недостаточной информативностью биоптата высказаться о характере патологического процесса не представляется возможным, можно лишь предположить наличие хронического агрессивного гепатита". Как видно из приведенного описания, морфологический диагноз сделан достаточно осторожно в отличие от показателей знзимодиагностики, что свидетельствует о более высокой точности способа и подтверждается также положительной реакцией на HBs антиген и обнаружением антител к HBs Ag. Известно, что при ХАГ не все отделы печени поражаются равномерно, При биопсии печени иногда можно получить пуктат без признаков выраженной воспалительной активности. Кроме того, на стадии ремиссии морфологически ХАГ может не отличаться от ХПГ. Нэ основе приведенного исследования доказано. что функциональный статус

СОД-каталаэы-пероксидаэы ткани печени

5 достаточно адекватно отражает выраженность патологического процесса при ХАГ, что нашло подтверждение в данном клиническом случае, Формула изобретения

10 . Способ диагностики хронических поражений печени путем морфологического анализа биоптата печени, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, проводят дополнительно измерение

15 активности СОД, каталазы и НАДФ Н-пероксидазы, расчет отношения каталазы/НАДcD Н-пероксидазы и при его значении 0,404 10 диагносцируют жировую дистрофию печени, 0,311 10 — хрониз

20 ческий активный гепатит, 0,222 10 цирроз печени и 0„196 10 — первичный з биллиарный цирроз, а фиброз печени диагносцируют при отношении 0,303 10 и одновременном снижении активности СОД.