Способ оценки действия лекарственных веществ на развитие помутнения хрусталика

 

Использование: в медицине, в медицинской биохимии, фармакологии и офтальмологий . Сущность изобретения: проводят измерение скорости выхода белка из хрусталика крысы, помещенного в физиологический раствор при 10-30° С в течение не более 6 ч в сравнении с контролем и при увеличении скорости выхода белка из хрусталика судят о катаральном, а при снижении - об антикатаральном .действиях лекарственного вещества. Предлагаемое изобретение позволяет увеличить чувствительность , точность способа. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 G 01 N 33/48

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4890528/14 (22) 14,11.90 (46) 07.04.93, Бюл. № 13 (71) Совместное Советско-Западногерманское предприятие "Константа" (72) В.Е.Формазюк (56) Авторское свидетельство СССР

¹ 1543995; кл, 6 01 N 33/48, 1989, (54) СПОСОБ ОЦЕНКИ ДЕЙСТВИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ HA РАЗВИТИЕ ПОМУТНЕНИЯ ХРУСТАЛИКА (57) Использование: в медицине, в медицинской биохимии, фармакологии и офтальмоСпособ относится к медицине. в частности к медицинской биохимии, фармакологии и офтальмологии, Целью изобретения является повышение чувствительности, точности и специфичности способа, уменьшение расхода испытуемого вещества, расширение температурного диапазона для проведения исследований и возрастного диапазона испытуемых крыс.

Поставленная цель достигается тем, что у крыс извлекают хрусталик, помещают его в физиологический раствор с испытуемым веществом и по сравнению скорости выхода белка из хрусталика в опыте и контроле оценивают катарактогенный и антикатарак-. тальный эффект испытуемого вещества, В качестве контроля используют второй хрусталик той же крысы, который инкубируют в том же растворе без внесения испытуемого вещества, Если в опыте по сравнению с контролем выход белка иэ линзы замедляется, то испытуемое вещество относят к группе антикатаральных и, наоборот. ускорение по„, Ы,, 1807403 А1 логии. Сущность изобретения: проводят измерение скорости выхода белка из хрусталика крысы, помещенного в физиологический раствор при 10-30 С в течение не более 6 ч в сравнении с контролем и при увеличении скорости выхода белка из хрусталика судят о катаральном, а при снижении — об антикатаральном,действиях лекарственного вещества, Предлагаемое изобретение позволяет увеличить чувствительность, точность способа. 1 табл, тери белка свидетельствует о каратактогенном эффекте.

Отличительным признаком предлагаемого изобретения является измерение скорости выхода белка иэ хрусталика в среду CO инкубации — в физиологический раствор.

Этот признак является существенным, так как позволяет преодолеть все перечислен- ф, ные недостатки известного способа, Идея нового изобретения заключается в том, что согласно нашим неопубликованным данным видимому на глаз помутнению хрусталика — KBTBpBKTe — H.BMTpo и ин вива предшествует потеря линзой белков, причем, оказалось, что известные антикатарактальные лекарственные средства даже в малых дозах блокируют выход белка в среду инкубации. Мы использовали это явление для разработки нового способа оценки действия вещества на развитие помутнения линзы.

Способ поясняется следующими примерами, Для демонстрации осуществления способа использовали уже известные анти1807403

30

35 используются 5 — 6-недельные крысы и измерение проводят при другой температуре.

Таким образом, по сравнению с контролем сэнкаталин, конечная концентрация которого составляла 0,01 мМ, согласно предлагаемому способу эффективно задер45 живает выход белка из хрусталика, хотя согласно известному способу-прототипу при данных условиях измерения проводить нельзя. Следовательно, предлагаемый способ более чувствительный по сравнению с известным (так как использовалась малая и концентрация сэнкаталина), более специфичен по сравнению с известным. Налицо

8 также уменьшение расхода антикатарактального препарата (согласно способу-про- 55 тотипу необходимо использовать около 0,2 е мМ сэнкаталина), расширение температурного диапазона (сравните — 10" С в новом способе и+ 14 С вЂ” в прототипе) и использование двухмесячных крыс (сравните — 5-6недельных крыс в способе-прпгогипе), катарактальные вещества: глазные капли—

Сэнкаталин фирмы "Такеда кемикая индустриес" (Япония), вита-йодюроль фирмы "Лаборатория Г. Фор" (Франция) и квинкас фирмы "Алкон" (США).

Пример 1. У пятинедельной крысы после декапитации удаляли хрусталик глаза, помещали в физиологический раствор при температуре + 14 С с сэнкаталином, конечная концентрация которого оставляла

0,01 мМ, В контроле находился в физиологическом растворе второй хрусталик той же крысы без лекарственного вещества. Затем спустя 2 ч от начала инкубации. оценивали содержание белка по Лоури в среде инкубации — физиологическом растворе и время визуально контролируемого наступления помутнения, Содержание белка в опыте в результате трех определений составляло 56 - 13 мкг/мл, в контроле — 119 +. 23 мкг/мл, время контролируемого наступления помутнения (способ-прототип) в опыте и B контроле не отмечались и составляло 21 минуту, Таким образом по сравнению с контролем сэнкаталин, конечная концентрация которого составляла 0,01 мМ, согласно предлагаемому способу эффективно задерживает выход белка из хрусталика, хотя согласно известному способу-прототипу помутнение! п vitro идет одинакового в опыте и в контроле. Следовательно, предлагаемый способ более чувствительный по сравнению с известным (так как использовалась малая концентрация сэнкаталина), более специфичен по сравнению с известным. Калицотакжеуменьшение расхода анти ката рактально го и репарата (согласно способу-прототипу необходимо использовать около 0,2 мМ сэнкаталина), Пример 2, У двухмесячной крысы после декапитации удаляли хрусталик глаза, помещали в физиологический раствор при температуре + 30 С с сэнкаталином, конечная концентрация которого составляла 0,01 мМ, В контроле находился в физиологическом растворе второй хрусталик той же крысы без лекарственного вещества. Затем спустя 2 часа от начала инкубации оценивали содержание белка по Лоури в среде инкубации — физиологическом растворе и время визуально контролируемого наступления помутнения. Содержание белка в опыте в ре зультате трех определений составляло 97 + мкг/мл, в контроле — 199 ++ мкг/мл, использо вать визуальный контроль наступления по мутнения (способ-прототип) в этом случа нельзя, так как не используются 5-6-недель ные.крысы и измерение проводят при дру гой температуре.

Таким образом, по сравнению с контролем сэнкаталин, конечная концентрация которого составляла 0,01 мМ, согласно предлагаемому способу эффективно задерживает выход белка на хрусталик, хотя согласно известному способу-прототипу при данных условиях измерения проводить нельзя, Следовательно, предлагаемый способ более чувствительный по сравнению с

10 известным (так как использовалась малая .концентрация сэнкаталина), более специфичен по сравнению с известным. Налицо также уменьшение расхода антикатарактального препарата (согласно способу-прототипу необходимо использовать около 0,2 мМ сэнкаталина), расширение температурного диапазона (сравните + 30 С в новом способе и+ 16" С вЂ” в прототипе) и испольэование двухмесячных крыс (сравните — 5 — 6недельных крыс в способе-прототипе).

Пример 3, В двухмесячной крысы после декапитации удаляли хрусталик глаза, помещали в физиологический раствор при температуре + 10 С с сэнкаталином, конечная концентрация которого составляла 0,01 MM. В контроле находился в физиологическом растворе второй хрусталик той же крысы без лекарственного вещества, Затем спустя 2 часа от начала инкубации оценивали содержание белка по Лоури в среде инкубации — физиологическом растворе и время визуально контролируемого наступления помутнения. Содержание белка в опыте в результате трех определений составляло 127 ч мкг/мл, в контроле — 304 +.

45 мкг/мл, использовать. визуальный контроль наступления помутнения (способ-прототип) в этом случае нельзя, так как не

1807403

Пример 4, У шестинедельной крысы после декапитации удаляли хрусталик гла- за, помещали в физиологический раствор при температуре + 16 С с витайодуролем, конечная концентрация которого составляла,1 от объема среды инкубации. В контроле находился хрусталик той же крысы без лекарственного вещества. Затем спустя 1 час от начала инкубации оценивали содержание белка по Лоури в среде инкубации— в физиологическом растворе — и время визуально контролируемого наступления помутнения. Содержание белка в опыте в, результате трех определений составляло

156 +. 35 мкг/мл, в контроле — 119 + 23 мкгlмл; время визуально контролируемого наступления помутнения (способ-прототип) в опыте составляло 29 минут, в контроле—

23 минуты (при точности визуальной фиксации помутнения — +. 1 мин).

Таким образом, по сравнению с контролем витайодуроль, конечная концейтрация которого составляла 1 % от объема среды инкубацйи, согласно предлагаемому способу не задерживает выход белка из хрусталика, хотя эффективно задерживая согласно известному способу-прототипу помутнение

in vttro. С другой стороны, из литературы известно, что вйтайодуроль менее эффективен по сравнению с другими известными антикатарактальными препаратами более того, сейчас в ряде этот препарат исключен из фармацевтического реестра, Следовательно, предлагаемый способ более специфичен по сравнению с известным, Пример 5, У крысы, возраст которой составлял год со дня рождения, после декапитации удаляли хрусталик глаза, помещали в физиологический раствор при температуре+ 10О С с квинаксом, конечная концентрация которого составляла 0,01 мМ; В контроле находился второй хрусталик той же крысы в физиологическом растворе без лекарственного вещества.

Затем спустя 2 ч от начала инкубации оценивали содержание белка по Лоури в среде инкубации — в физиологическом растворе — и время визуально контролируемого наступления помутнения (способпрототип). Содержание белка в опыте в результате трех определений составляло

84 +. 34 мкгlмл, в контроле — 123 +. 27 мкг/мл, время визуально контролируемого наступления помутнения в опыте и в контроле было одинаковым и составляло

19 мин.

Следовательно, по сравнению с контролем квинакс в дозе 0,01 MM статически

15 достоверно не задерживает выход белка, определить его антикатарактальный эффект с помощью известного способа-прототипа визуально в такой малой дозе также невозможно, Обращает на себя внимание тот факт, что сэнкаталин в тех же дозах (пример

1) задерживает потерю линзой белка. Следовательно, сэнкаталин — более эффективное антикатарактальное средство по сравнению с квинаксом, что получено подтверждение в ряде работ

Таким образом, по сравнению с известным способом-прототипом j2) новый способ обладает большей специфичностью, более чувствительный (так как ис-. пользовалась малая концентрация квинакса и сэнкаталина). Налицо также уменьшение расхода антикатарактального препарата (согласно способу-прототипу

20 необходимо использовать около 0,2 мМ сэнкаталина), расширение температурного диапазона (сравните + 10 С в новом способе и+ 14 С вЂ” в прототипе) и использование крыс 1-годичного возрасте (срав25 ните 5 — 6-недельных крыс в способе-прототипе).

П р.и м е р 6. У шестинедельных крыс после декапитации удаляли хрусталик глаза, помещали в физиологический раствор .

30. при температуре+ 16О С с квинаксом, конечная концентрация которого составляла

0,1 мМ. В контроле находился второй хрусталик той же крысы в физиологическом растворе без лекарственного вещества.

35 Затем спустя 30 мин от начала инкубации оценивали содержание белка по Лоури в среде инкубации — в физиологическом растворе — и время визуально контролируемого наступления помутнения. Содержание

40 белка в опыте в результате трех определений составляло 20 + 15 мкг/мл, в контроле — 161 +-20 мкгlмл, время визуально контролируемого наступления помутнения (способ-прототип) в опыте и в контроле

45, было почти одинаковым. и составляло 18 мин для опыта и контроля соответственно.

Таким образом, по сравнению с контролем квинакс в дозе 0,1 мМ явно задерживает выход белка, определить его

50 антикатарактальный эффект с помощью известного способа-прототипа визуально в такой дозе невозможно из-за интенсивной прокрашиваемости линзы в опыте. С, другой стороны, по сравнению с примером

55 5 все же доказан антикатарактальный эффект квинакса, Следовательно, предлагаемый способ более точный по сравнению с известным.

1807403

Замечательно также то, что с его по- Отдельно следует остановится на воспмощью можно проводить оценку антиката- роизводимости предлагаемого способа. 8 рактального действия вещества в малых таблицеприведены средниезначенияиукадозах, что невозможно в случае прототипа зели ошибку в определении. скорости выхо(пример1), Наконец,c помощьюновогоспо- 5 да белка выхода белка в присутствии 0,01 собаможнопроводитьоценкуантикатарак- мМ сэнкаталина (опыт) и без какого-либо тальной эффективности различных лекарственного препарата (контроль) при веществ, осуществлять подбор лечебной до- инкубации в физиологическом растворе при зы (примеры 5 и 6)... ......:.. " + 16 С хрусталика шестинедельных крыс.

В качестве катарактального вещества 10 . Скорость выхода белка(мкг/мл в1млза нами был использован пипольфен, который 1-й ч ин«убации) при инкубации в физиолосогласно данным работы может обладать . гическом растворе при+ 16О С хрусталиков катарактогенным эффектом..:...: .: шестинедельных крыс.

tl р и м е р 7. У шестинедельных крыс .. Из представленной таблицы можно лег"после декапитацйй удаляли -хрусталик гла- 15 коубедиться, что прйтестировании сэнкатаза, помещали в физиологический раствор - лина при низкой дозе максимальный . при температуре+ 14ОС с пийольфеном, ко- разброс для разйых животных одного и того нечная концентрация которого состайляла же возраста не превышает 10 j. Это позво-

0;1 мм. В контроле находился второй хну- -"" лйт практически использовать бдну крысу сталик той -же крысы в физиологическом 20 для определения катарактального или; наорастворе без лекарственного вещества, За- борот, антикатарактальногр эффекта у тес= тем спустя 30 минут от начала инкубации" тируемого вещества, Предлагаемый способ оценивали содержание белка по Лоури в .: . Оценки действия вещества на развитие касреде инкубации — в физиологическом рас- " - таракты можйо уже сегодня примейить в творе — " и времМ визуально кОНтРолйруемого 25 фармакОлогических лабораториях и инсти: наСтупления помутнения, Содержание бел- тутах, где проводится активный поиск новых ка в опыте. в результате трех определений консервативных методов лечения помутнесоставляло 125 +- 39 мкг/мл, в контроле - 55 нйя хрусталика у человека и животйых, Опи 31мкг/мл,вреМявизуальноконтролируе- санный способ может также оказаться

"мого. наступления йоМутнения (ойособ-йро- . 30 полезным при выявлении катарактогенных тОтип).в .Опыте и в контроле былО ;: лекарств. одйнаковымисоСтавлялооколо16мин; .: - Форму.ла изобрете.ния

Таким образоМ, по сравнениюi контро- .:. . Способ оценки действия лекарственных

:лем пипольфен в дозе 0,1 мМ явно ускоряет веществ на развитие помутнения хрустали: выход. белка, определить его- антикатарак- 35 ка йутем извлечения хрусталика крыс, поме твльйый эффект с пьмощью йзвестйогоспо--,,- щения его в физиологический раствор с

:соба-йрбтотйпа визуально в такой дозе : (исследуемым)лекарственным веществом, . невозможно, :::. :::: .....:: .:. - о т л и ч а Ю 4"и и с si тем, что, с целью

Следовательно, йредлагаемый способ., повышения чувствйтельности и точности более чувствителен йо сравнению с извест- 40 способа, проводят измерение скорости вы". йьнй -. : ::::,:.:: "."":":,"; . хОда белка из хрусталика при 10 — 30 С в

Метод оценки содержанйя белка по Ло- течейие не более 6 ч, с последующим сравури можНо заменить на любой дрУгой спо-: Нением с контролем и при увеличении скособ определения белка, например, на ростй выхода белка из хрусталика судят о флуоресцентный (по флуоресценции трип- 45 катарактальном, а при снижении — o6 антитбфанилов или с использованием флуарес- катарактальном действии лекарственного центнйх меток).. вещества.

1807403

Составитель В.Формазюк

Техред М.Моргентал Корректор М.Керецман

Редактор С. Кулакова

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул,Гагарина, 101

Заказ 1377 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5