Способ получения протеолитических концентратов

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

НОЕ ПАТЕНТНОЕ

ССР

СС Р) АНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1 г

° ° Ъ ю

CrD

QO

QO

К) >

Изобретение относится к переработке ерментного сырья; в частности к производтву ферментных концентратов, обладаюцих протеолитической активностью, оторые могут быть использованы для выдеения высокоочищенных ферментных преаратов, таких как дезоксирибонуклеазы

ДНК-аза), рибонуклеаза (PHK-аза), трипин, химотрипсин, трипсиноген, химотрипиноген и катепсин-С, Цель изобретения — предварительное ведение в экстракт 0,02-0,2 моль/л мо4еины и использование в кэчестве животного

ы рья замороженных естествен н ым холоом до температуры минус 3 — 5 С поджелуочной железы и селезенки северного леня, использование которых позволит боее полно удовлетворить потребность биоимичес кой и медицинской

1ромышленности в протеолитических ферентах. B настоящее время из-за удаленноти регионов обитания северного оленя от ест переработки эндокринно — ферментноо сырья поджелудочная железа иселезенка не используются, следовательно получение протоконцентратов на местах убоя живоных (бойнях) позволит не только рацио„„5U„„1831882 АЗ (si>s А 61 К 35/39, А 23 L 1/31 нально использовать оленеводческую продукцию, но и высвободить для производства инсулина дополнительное количество поджелудочной железы, перерабатываемое в настоящее время для получения протеоли, тических ферментов.

Сущность способа заключается в том, что для удобства измельчения поджелудочную железу или селезенку северного оленя замораживают до температуры минус 350С, для стабилизации белковых структур при гомогенизации в сырье вводят 0,02-0,2 моль/л мочевины, экст„агирование ферментов ведут в течение 1-5 час при температуре 5 — 38 С и рн 2,3-4,5. По окончании экстракции отделяют негидролизованные остатки ткани, а экстракт лиофильно высушивают. Для очистки экстракта в некоторых случаях предусматривается высаливание балластных белков с обязательным отстаиванием экстракта, удалением осадков и лиофилизацией экстракта.

Изобретение иллюстрируется нижеприведенными примерами.

Пример 1. 1,0 кг поджелудочной железы замораживают до температуры мио нус 3 С, измельчают ее до состояния фарша, 1837882 а затем фарш гомогенизируют в.4 объемах (от массы измельченного сырья) охлажденного до минус 1 С водного раствора, содержаще-

ro 0,2 моль/л мочевины. Гомогенизацию ведут . при температуре не выше 5"С в течение 3 мин, после чего к гомогенату прибавляют 5 н. раствор серной кислоты до рН 2,3 и при постоянном перемешивании и вышеуказанной температуре проводят экстрэгирование ферментов. Через 5 час в экстракт прибавляют сульфат аммония до 0,23 насыщения и после часового перемешивания проводят формирование осадка при температуре 3 С в течение 6 час..Образовавшийся осадок „ удаляют центрифугированием при температуре не выше 5ОС, з фугат лиофильно высу-, шивают. Полученный концентрат представляет собой порошок белого цвета в котором содержится 5,4 влаги, 2,3 жира и 40,17ь белка. Содержание ДНК-азы составляет 0,08 Ед/мг; трипсин+химотрипсин

-0,8 Ед/мг, а PHK-азы -0,05 Ед/мг концен-. трата.

Пример 2. 1,0 кг поджелудочной железы замораживают до температуры минус 5 С, измельчают ее до состояния фарша, а затем фарш гомогенизируют в 4 объемзх охлажденного до 0 С водного раствора, содержащего 0,2 моль/л мочевины, Гомогенизацию ведут при температуре не выше 5ОС в течение 10 мин, после чего к гомогенату . прибавляют 5 н раствор серной кислоты до рН 3,5 и при постоянном перемешивании и вышеуказанной температуре проводят экстрагирование ферментов. Через 5 час после перемешивания экстракта в него прибавля- . ют мелкими порциями сульфат аммония до

0,23 насыщения. Формирование осадка проводят при температуре 6 C в течение 12 час. Осадок из экстракта удаляют центрифугированием при температуре не выше 5 С, а фугат лиофильно высушивают. Полученный концентрат представляет собой порошок белого цвета, в котором содержится

10,1 влаги, 4,9 жира и 65,97ь белка. Содержание ДНК-азы составляет 1,6 Едlмг, трипсин+химотрипсин —.2,1 Ед/Mt, à PHKаэы — 1,1 Ед/мг концентрата.

Пример 3. 1,0 кг селезенки замораживают до температуры минус.3 С, измельчают ее до состояния фарша, а затем фарш гомогенизируют в одном объеме охлажденного до 0ОС водного раствора содержащего

0.04 моль/л мочевины. Гомогенизацию ведут при температуре не выше 5 С в течение

3 мин, после чего в гомогенат прибавляют 5 н.раствор серной кислоты до рН 2,3 и при энергичном перемешивзнии ведут экстрагирование ДНК-азы в течение 1 часа, По истечении указанного времени экстракт отстаивают при температуре 5 С в течение 18 час, а затем из экстракта удаляют нерастворившиеся ткани путем центрифугирования.

Фугат лиофильно высушивают. Полученный концентрат представляет собой порошок бледно-розового цвета, в, котором содержится 5,8 влаги и 60,0% белка, Специфическая ДНК-азная активность 1 мг концентрата составляет 0,07 Ед.

Пример 4. 1,0 кг селезенки заморзживают до температуры минус 5"С измельчают ее до состояния фарша, а затем фарш гомогенизируют в 1 объеме охлажденного до 1 С.водного раствора, содержащего 0,04 моль/л мочевины. Гомогенизацию ведут при температуре не выше 5 Ñ в течение 10 мин, поеле чего в гомогенат прибавляют 5 н. раствор серной кислоты до рН 3,5 и при энергичном перемешивании в течение 1,5 чзс ведут экстрагирование ДНК-азы. По истечение укаэанного времени экстракт отстаивают при температуре 5 С в течение 24 час, после, чего удаляют остатки нерастворившейся ткани центрифугированием, а фугат лиофильно высушивают, Полученный концентрат представляет собой порошок бледно-розового цвета, в котором содержится

10,0 влаги и 80,0 белка. Специфическая

ДНК-азная активность 1 мг концентрата сОставляет 0,5 Ед.

Пример 5. 1,0 кг селезенки замораживэют до температуры минус 3 С, измельчают ее до состояния фарша, а затем фарш гомогенизируют в одном объеме охлажденного до 0 С водного раствора, содержащего

0,02 моль/л мочевины. Гомогенизацию ведут при температуре не выше 5ОC в течение

3 мин, после чего в гомогенат прибавляют 5 н. раствор серной кислоты. до рН 3,0 и в течение 30 мин проводят интенсивное первмешивание смеси при комнатной температуре. Остатки соединительной ткани удаляют из экстракта путем центрифугирования, а в фугат прибавляют гидроокись натрия до рН 6,0 и сульфат аммония до 0,4 насыщения. Смесь отстаивают в течение 1 чзс и удаляют из нее образовавшийся осадок путем центрифугирования. Осадок отбрасывают, а фугат лиофильно высушивают.

Полученный концентрат представляет собой порошок бледно-розового цвета, в котором содержится 4,9 влаги, 59,5$ белка и

9,7 минеральных веществ. Специфическая PHK;азная активность 1 мг концентрата составляет 0,7 Ед.

Пример 6, 1,0 кг селезенки замораживают до температуры минус 5ОС, измельчают ее до состояния фарша. з затем фарш гомогенизируют в одном объеме охлажденного до 1ОС водного раствора, содержащего

1837882,2 моль/л мочевины. Гомогенизацию ведут ри температуре не выше 5 С в течение 10 ин, после чего в гомогенат прибавляют 5 н, аствор серной кислоты до рН 5 и в течение

0 мин проводят интенсивное перемешиваие смеси при комнатной температуре. Осатки соединительной ткани удаляют иэ кстракта центрифугированием, а в фугат рибавляют гидроокись натрия до рН 8,0 и ульфат аммония до 0,4 насыщения. Смесь тстаивают в течение 2,5 час, удаляют из нее бразовавшийся осадок центрифугироваием, а фугат лиофильно высушивают. Полченный концентрат представляет собой орошок белого с розоватым оттенком цвеа, в котором содержится 9,9 влаги, 70,1 елка и 5,3 минеральных веществ. Специическая PHK-азная активность 1 мг конентрата составляет 2,0 Ед.

Пример 7. 1,0 кг селезенки замораивают до температуры минус 3 С, измельают ее до состояния фарша, а затем фарш омогенизируют в течение 3 мин в 2 объемах от массы селезенки) водного раствора, соержащего 0,02 моль/л мочевины, По истеении указанного времени в гомогенат рибавляют 5 н. раствор гидроокиси натрия о рН 7,0 и продолжают гомогенизацию в ечение 10 мин. В полученную суспензию обавляют 3,5 н,раствор серной кислоты до

Н 3,5 и при температуре 38 С и интенсивом перемешивании ведут экстрагирование атепсина-С в течение 1 час. Затем в эксракт добавляют 10 мл толуола, смесь знерично перемешивают и оставляют при

ышеуказанной температуре для отстаиваия на 20 час, при этом через каждые 3 час роводят корректирование рН, Из отстоявегося экстракта путем центрифугирования даляют нерастворившуюся часть ткани, в угат лиофильно высушивают;,Полученный онцентрат представляет собой порошок легка желтоватого цвета в котором содерится 4,9% влаги и 35,0 белка. Специфиеская катепсиновая активность составляет .18 Едlмг белка..

Пример 8, 1,0 кг селезенки замораивают до температуры минус 5 С, измельают ее до состояния фарша, а фарш омогенизируют в течение 10 мин в двух бьемах (от массы селезенки) водного расвора, содержащего 0,02 моль/л мочевины, о истечении указанного времени в гомогеат прибавляют 5, н.раствор гидроокиси нария до рН 7 0 и продолжают омогенизацию в течение 25 мин. В полченную суспензию добавляют 3,5 н. расвор соляной кислоты до рН 3,5 и при

55 температуре 38 С и интенсивном перемешивании ведут экстрагирование катепсинаС в течение 1,5 час, после чего в экстракт добавляют 10 мл толуола, смесь энергично перемешивают и оставляют при вышеуказанной температуре для отстоя на 26 час, при этом через каждые 3 час проводят корректировку рН. Из отстоявшегося экстракта удаляют нерастворившуюся часть тканей путем центрифугирования при температуре не выше 3 С. С фугата снимают образовавшуюся в результате охлаждения жировую пленку и подвергают его лиофильному высушиванию. Полученный концентрат представляет собой порошок слегка желтоватого цвета, в котором содержится 10,0 влаги и

45,5 белка. Специфическая катепсиновая активность составляет 0,5 Ед/мг белка.

Формула изобретения

1. Способ получения протеолитических концентратов, предусматривающий измельчение животного сырья, экстракцию ферментов кислым. раствором при рН 2,34,5, отстаивание экстракта, удаление йз него осадка и лиофилизацию экстракта, о т л ич а ю щ и и с.я тем, что в качестве животного сырья используют поджелудочные железы или селезенку северного оленя, при этом перед экстракцией в сырье вводят 0,02-0,2 моль/л мочевины.

2. Способ по п.1, о тл и ч а ю шийся тем, что при использовании в качестве сырья поджелудочной железы северного оленя перед отстаиванием в экстракт вводят сульфат аммония до 0,23 насыщения.

3, Способ по п.1, о тл и ч а ю шийся тем, что при использовании в качестве сырья селезенки северного оленя с целью получения протеолитического концентрата, обладающего дополнительно рибонуклеазной активностью, экстракцию ведут при комнатной температуре, из экстракта удаляют нерастворившиеся ткани и затем вводят гидроокись натрия.до значений рН 6,0-8,0 и сульфат аммония до 0,4 насыщения, образовавшийся в процессе отстраивания осадок удаляют, 4., Способ по п.1, отличающийся тем, что при использовании в качестве сырья селезенки северного оленя с целью получения протеолитического концентрата, обладающего дополнительно катепсиновой активностью, после введения в сырье мочевины в смесь вводят гидроокись натрия до рН 7,0, экстракцию и отстаивание экстракта ведут при 38 С, а перед отстаиванием в экстракт вводят толуол.