Кристаллическая -форма кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-n- [4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамида, способ ее получения (варианты) и фармацевтическая композиция

 

Изобретение относится к новой кристаллической β-форме кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамида формулы I, которая предназначена для получения фармацевтической композиции для лечения или диагностики опухолевых заболеваний. Кристаллическая β-форма указанной соли включает по меньшей мере 90 мас.% кристаллов, имеющих β-модификацию, причем кристаллы, имеющие β-модификацию, являются негигроскопичными и остаются практически безводными в стеклянной климатической камере при 25^oС и при относительной влажности до 93% включительно. Предпочтительно кристаллическая β-форма включает по меньшей мере 95 или 99 мас.% кристаллов, имеющих β-модификацию, которая остается безводной при относительной влажности 93% и при 25^oС. При этом кристаллическая β-форма обычно включает по меньшей мере 99 мас. % кристаллов, имеющих β-модификацию и температуру плавления ниже 225^oС, предпочтительно температуру плавления, определяемую как начало плавления на термограмме, полученной с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии, 217^oС. Кристаллическая β-форма отличается наличием на рентгенограмме, полученной рентгенодифракционным анализом, пика при угле преломления 2Θ = 20^o, при этом этот пик имеет относительную интенсивность линии, равную 65%, по сравнению с наиболее интенсивной линией на рентгенограмме. При этом обычно относительная интенсивность линий при следующих углах преломления 2Θ (относительные интенсивности линий в% даны в скобках): 9,7^o (40); 13,9^o (26); 14,7^o (23); 17,5^o (57); 18,2^o (90); 20,0^o (65); 20,6^o (76); 21,1^o (100); 22,1^o (89); 22,7^o (38); 23,8^o (44); 29,8^o (23) и 30,8^o (20), составляет 20% или более по сравнению с наиболее интенсивной линией на рентгенограмме. Способы получения кристаллов β-модификации заключаются в том, что осуществляют разложение другой кристаллической формы кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I с помощью подходящего полярного растворителя в суспензии при 20 - 50^oС или растворяют другую кристаллическую форму или аморфный исходный продукт кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I в полярном растворителе при приемлемой температуре, находящейся в диапазоне от 25^oС до температуры дефлегмации реакционной смеси, а затем инициируют кристаллизацию, добавляя небольшое количество кристаллов β-модификации в качестве затравочного кристалла при 20 - 70^oС. 2 с. и 10 з.п.ф-лы, 1 табл., 3 ил.

Изобретение относится к кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамида в форме, представляющей собой определенную кристаллическую форму, к способам ее получения, к фармацевтическим композициям, включающим эту кристаллическую форму, и к их применению в методах диагностики или предпочтительно для терапевтического лечения теплокровных животных, главным образом людей, или к их применению для изготовления фармацевтических препаратов, предназначенных для применения в методах диагностики или предпочтительно для терапевтического лечения теплокровных животных, главным образом людей.

Получение 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамида и его применение главным образом в качестве противоопухолевого агента, описано в примере 21 заявки ЕР-А 0564409, опубликованной 6 октября 1993 г., и эквивалентных заявках во многих других странах. Это соединение приведено в этих заявках в качестве примера только в свободной форме (но не в форме соли).

При создании настоящего изобретения неожиданно было установлено, что в определенных условиях может быть получена кристаллическая форма, которая представляет собой метансульфонат этого соединения и которая обозначена в настоящем описании как кристаллическая β-форма и обладает очень ценными свойствами.

Ниже изобретение более подробно рассмотрено со ссылкой на прилагаемые чертежи и другие материалы.

На фиг.1 представлена рентгенограмма для кристаллической α-формы кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I.

На фиг.2 представлена рентгенограмма для кристаллической β-формы кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, которая является практически свободной от α-формы в пределах указанного ограничения.

На фиг.3 показаны кристаллы кристаллической α-формы (вверху) и кристаллической β-формы (внизу) метансульфоната 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамида (т.е. кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I).

На обеих рентгенограммах, полученных рентгенодифракционным анализом, на горизонтальной оси (ось х) отложен угол преломления 2Θ, а на вертикальной оси (ось y) отложена относительная интенсивность линий (интенсивность пика, скорректированная с учетом фона). Рентгенограммы получают следующим путем: сначала картину дифракции рентгеновских лучей регистрируют на пленку с использованием камеры Guinier (модель Enraf-Nonius FR 552) и пленки Guinier 258-94с и с использованием медного радиоактивного источника (радиация Кα1, длина волны Оптическая плотность линий на пленке пропорциональна интенсивности света. Затем пленку сканируют с использованием сканера со строчной разверткой (типа LS 18, Johansson, , Щвеция) и с программным обеспечением SCANPI.

Как показано на фиг.2, линии, относительная интенсивность которых составляет 20 или более, соответствуют следующим углам преломления 2Θ (относительные интенсивности линий указаны в скобках): 9,7^o (40); 13,9^o (26); 14,7^o (23); 17,5^o (57); 18,2^o (90); 20,0^o (65); 20,6^o (76); 21,1^o (100); 22,1^o (89); 22,7^o (38); 23,8^o (44); 29,8^o (23) и 30,8^o (20). Из фиг.2 относительная интенсивность линии при 30,8^o кажется более высокой, чем относительная интенсивность линии при 29,8^o вследствие того, что она очень близко расположена к дополнительной линии при 31,0^o, имеющей относительную интенсивность линии 13.

Точки плавления определяют с помощью ДСК-термограммы, используя устройство типа Mettler-Toledo TA8000. ДСК (дифференциальная сканирующая калориметрия) представляет собой метод динамической дифференциальной калориметрии. С помощью этого метода температура плавления как кристаллической α-формы, так и кристаллической β-формы может быть измерена путем нагревания образцов до тех пор, пока с помощью высокочувствительных датчиков не будет выявлена термическая, т.е. эндотермическая или экзотермическая, реакция. Указанные в настоящем описании температуры плавления определяют с помощью устройства типа Mettler-Toledo TA8000, при этом температуру плавления каждого образца массой примерно от 5,5 до 6,5 мг измеряют в алюминиевом тигле с перфорированной крышкой в находящемся в покое атмосферном воздухе при скорости нагревания 10 ^oC/мин (начиная с температуры 20^oС).

Для кристаллической α-формы метансульфоната 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамида характерны игольчатые кристаллы, и она является гигроскопичной. Кристаллы этой формы недостаточно хорошо пригодны для фармацевтических композиций в виде твердых дозируемых форм из-за их физических особенностей, например их характеристики текучести являются неудовлетворительными. Однако в определенных условиях возможно получение метансульфоната 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамида в кристаллической форме, кристаллы которой не являются игольчатыми. Эта форма обозначена в настоящем описании как кристаллическая β-форма.

Преимущество кристаллической β-формы метансульфоната 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил]бензамида состоит в том, что ее характеристики текучести существенно более предпочтительны по сравнению с характеристиками кристаллической α-формы. Еще одно преимущество этой кристаллической формы заключается в том, что она является термодинамически более стабильной при температурах ниже 140^oС. И, наконец, кристаллическая β-форма является менее гигроскопичной в сравнении с кристаллической α-формой и поэтому лучше хранится и более легко поддается обработке.

Изобретение относится к кислотно-аддитивной соли соединения формулы I, имеющей форму неигольчатых кристаллов, в частности к кристаллической β-форме кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I.

В частности, изобретение относится к определенной практически чистой кристаллической форме, предпочтительно к форме, которая в настоящем описании обозначена как кристаллическая β-форма, кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамида, т.е. к метансульфонату соединения формулы I Когда в настоящем описании используется понятие "метансульфонат соединения формулы I или 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамида", то следует понимать, что имеется в виду метансульфонат формулы II В контексте настоящего описания понятие "практически чистый" обозначает, что по меньшей мере 90 мас.%, предпочтительно по меньшей мере 95 мас.% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99 мас.% кристаллов кислотно-аддитивной соли соединения формулы I присутствуют в кристаллической форме по изобретению, главным образом в кристаллической β-форме.

В контексте настоящего описания в выражении "кислотно-аддитивная соль формулы II имеет практически такую же рентгенограмму, которая указана на фиг. 2, понятие "практически" обозначает, что должны присутствовать по меньшей мере основные линии рентгенограммы, приведенной на фиг.2, т.е. те, у которых относительная интенсивность линий на 10%, особенно предпочтительно на 20%, выше по сравнению с наиболее интенсивной линией на рентгенограмме.

Изобретение также относится главным образом к тем формам кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, в которых кристаллы кристаллической формы по изобретению, главным образом кристаллической β-формы, присутствуют в практически чистой форме вместе с другими кристаллическими формами и/или с аморфной формой метансульфоната 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамида. Однако особенно предпочтительной является кислотно-аддитивная соль формулы II, которая присутствует в практически чистой кристаллической β-форме.

Новая кристаллическая форма, главным образом кристаллическая β-форма, обладает следующими свойствами.

Температура плавления, определенная с помощью ДСК-термограммы, кристаллической β-формы составляет 217^oС, а кристаллической α-формы составляет 226^oС (начало плавления).

На рентгенограмме кристаллической β-формы отсутствует пик кристаллической α-формы, обозначенный как (1), и только в очень незначительной степени проявляется пик, обозначенный как (3) (см. фиг.1 и 2). В отличие от этого на фиг. 2 виден новый дополнительный пик, обозначенный как (4). На фиг.2 также виден новый пик, обозначенный как (5).

На рентгенограммах также видны другие заметные отличия.

В предпочтительном варианте осуществления практически чистая кислотно-аддитивная соль метансульфоновой кислоты и соединения формулы I в кристаллической β-форме имеет рентгенограмму, приведенную на фиг.2.

(I) Предпочтительной является кристаллическая форма кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, которая не имеет пика, обозначенного как (1) на рентгенограмме, приведенной на фиг.1, и эта кристаллическая форма предпочтительно присутствует в виде практически чистой формы.

(II) Также предпочтительной является кристаллическая форма кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, которая остается безводной при относительной влажности 93% и при температуре 25^oС, и эта кристаллическая форма предпочтительно присутствует в виде практически чистой формы.

(III) Изобретение предпочтительно относится к кристаллической β-форме кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, которая отличается наличием кристаллов, имеющих форму, приведенную ниже на фиг. 3, главным образом к кристаллической β-форме в виде практически чистой формы.

(IV) Более предпочтительной является кристаллическая β-форма кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, которая имеет температуру плавления менее 225^oС, главным образом температуру плавления, составляющую от 217 до 225^oС.

(V) Также более предпочтительной является кристаллическая β-форма кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, которая имеет температуру плавления 217^oС, обозначенную как точка начала плавления на ДСК-термограмме.

(VI) Также более предпочтительной является кристаллическая β-форма кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, у которой на рентгенограмме имеется пик, обозначенный как (4) на фиг.2.

(VII) Также более предпочтительной является кристаллическая β-форма кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, у которой на рентгенограмме имеется пик, обозначенный как (5) на фиг.2.

(VIII) Еще более предпочтительной является кристаллическая β-форма кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, которая имеет рентгенограмму типа той, которая приведена на фиг.2, главным образом рентгенограмму, на которой относительные интенсивности пиков каждого пика не отклоняются более чем на 10% от относительных интенсивностей пиков на рентгенограмме, показанной на фиг. 2, главным образом рентгенограмму, идентичную таковой, показанной на фиг.2.

(IX) Наиболее предпочтительной является кристаллическая β-форма кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, для которой характерны два из свойств, описанных в разделах с (I) по (VIII), наиболее предпочтительны три из свойств, указанных в этих разделах, особенно предпочтительны все свойства и наиболее предпочтительны те свойства, которые определены как предпочтительные.

Таким образом, наиболее предпочтительной является кристаллическая форма, указанная в одном из разделов (I)-(IХ) в виде практически чистой формы.

Особенно предпочтительной формой является кристаллическая β-форма кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, получаемая по описанной в примерах методике.

Во всех случаях форму кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, включающую соответствующую описанную выше кристаллическую форму, также следует рассматривать как объект изобретения в широком смысле.

Кристаллическую β-форму (предпочтительно практически чистую) получают путем а) разложения другой кристаллической формы, в частности кристаллической α-формы, или аморфного исходного продукта кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I с помощью приемлемого полярного растворителя, предпочтительно спирта, особенно предпочтительно метанола, или также кетона (предпочтительно в смеси с водой, например в смеси вода/ацетон), как правило, ацетона, N,N-ди(низш.)алкил-(низш. )алканкарбоксамида, как правило, N,N-диметилформамида или -ацетамида, или гидрофильного простого эфира, как правило, диоксана, предпочтительно в присутствии некоторого количества воды, или их смесей, в суспензии при приемлемой температуре, предпочтительно при температуре от 20 до 50^oС, например при температуре примерно 25^oС, или б) растворения другой кристаллической формы, в частности кристаллической α-формы, или аморфного исходного продукта кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I с помощью приемлемого полярного растворителя, предпочтительно такого как спирт, как правило, метанол или этанол, кетон (предпочтительно в смеси с водой, например с помощью смеси вода/ацетон), как правило, ацетона, N,N-ди(низш.)алкил-(низш. )алканкарбоксамида, как правило, N,N-диметилформамида или -ацетамида, или гидрофильного простого эфира, как правило, диоксана, или их смеси, предпочтительно в присутствии некоторого количества воды, при приемлемой температуре, прежде всего после нагревания растворителя или при нагревании во время процесса растворения, в обоих случаях предпочтительно до температуры в диапазоне от 25^oС до температуры дефлегмации реакционной смеси, а затем инициации кристаллизации путем добавления небольшого количества кристаллической β-формы в качестве затравочного кристалла при приемлемой температуре, например при температуре от 0 до 70^oС, предпочтительно при температуре от 20 до 70^oС.

Выделенное вещество, т. е. кристаллическая α-форма кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамида, может быть получено, например, осаждением соли из раствора в растворителе, отличном от спирта, таком как метанол, и без добавления затравочного кристалла кристаллической β-формы.

Вышеуказанные условия избирательного получения индивидуальных кристаллических форм не имеют решающего значения. Обычно можно, например, изменять такие параметры, как массовое соотношение кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I в растворителе. Также можно изменять время, необходимое для получения кристаллической β-формы, в частности, при одновременной регулировке температур.

Одним из основных преимуществ кристаллической β-формы является ее более компактная кристаллическая форма, что приводит к существенно более благоприятным свойствам текучести и вследствие этого к более высокой технологичности кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I в кристаллической β-форме по сравнению с кристаллической α-формой, например, при изготовлении фармацевтических композиций.

Следует отметить, что кристаллическая α-форма кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I является метастабильной при комнатной температуре. Однако кристаллическая β-форма кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I представляет собой при комнатной температуре термодинамически стабильную форму. Таким образом, можно ожидать большей стабильности этой формы.

И, наконец, кристаллическая β-форма кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I является менее гигроскопичной, чем ее кристаллическая α-форма, что можно видеть из приведенной таблицы (см. в конце описания).

При оценке гигроскопичности кристаллических форм, которую проводили в стеклянной климатической камере при 25^oС и при приведенных в таблице уровнях влажности, определяя точку, при которой достигается равновесие (не происходит дальнейшая адсорбция), были обнаружены следующие уровни содержания воды (конечное содержание воды в % в пересчете на массу сухого продукта) (см. таблицу).

Видно, что при 25^oС кристаллическая α-форма является гигроскопичной и быстро впитывает воду, в результате чего при относительной влажности 93% образец в определенной степени присутствует в аморфной форме, в то время как кристаллическая β-форма в этих условиях остается безводной. Обе кристаллические формы разжижаются при относительной влажности 97%, но это происходит существенно быстрее с кристаллической α-формой, чем с кристаллической β-формой.

Более низкая гигроскопичность является дополнительным преимуществом при обработке и хранении кислотно-аддитивной соли в кристаллической β-форме.

Кислотно-аддитивная соль метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, которую предпочтительно применяют в кристаллической β-форме (далее в контексте настоящего описания под кислотно-аддитивной солью метансульфоновой кислоты всегда понимают кристаллическую β-форму), а также 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамид в свободной форме обладают ценными фармакологическими свойствами и могут, например, применяться в качестве противоопухолевого агента, агента для лечения атеросклероза, агента для лечения рестеноза, для предупреждения связанных с трансплантацией нарушений, таких как облитеративный бронхолитиаз, и/или для предупреждения заражения клеток теплокровных животных определенными бактериями, такими как Porphyromonas gingivalis.

Уже давно известно, что фосфорилирование протеинов является основной стадией в дифференцировании и делении клеток. Фосфорилирование катализируется протеинкиназами, которые подразделяются на серин/треонин- и тирозинкиназы. Тирозинкиназы включают тирозинкиназный рецептор PDGF (тромбоцитарный фактор роста).

PDGF (тромбоцитарный фактор роста) представляет собой очень широко распространенный фактор роста, который играет важную роль как в обеспечении нормального роста клеток, так и в патологической пролиферации клеток, которая выявлена при канцерогенезе и при заболеваниях клеток гладкой мускулатуры кровеносных сосудов, например при атеросклерозе и тромбозе.

Ингибирование активности стимулируемого PDGF тирозинкиназного рецептора in vitro оценивают в отношении иммунных комплексов рецептора PDGF на 3Т3-клетках мышей линии BALB/c согласно методу, описанному Е. Andrejauskas-Buchdunger и U. Regenass в Cancer Research, 52, 5353-5358 (1992). Описанное ранее более подробно соединение формулы I и главным образом его кристаллическая β-форма ингибируют фосфорилирование зависящего от PDGF внеклеточного рецептора. Ингибирование тирозинкиназного рецептора PDGF оценивают с помощью микротитрационного метода ELISA (ср. Trinks и др. , J. Med. Chem., 37, 1015-1027 (1994)). 4-(4-Метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил]бензамид и соответствующий ему метансульфонат ингибируют активность тирозинкиназного рецептора PDGF, при этом значение IC₅₀ (концентрация, при которой активность ингибируется на 50% по сравнению с контролем) составляет примерно 120 нМ и примерно 100 нМ соответственно.

Способность ингибировать PDGF делает соединение формулы I пригодным также для лечения связанных с опухолями заболеваний, таких как глиомы, саркомы, опухоли предстательной железы и опухоли толстой кишки, молочной железы и яичника.

Кислотно-аддитивная соль метансульфоновой кислоты и соединения формулы I также ингибирует происходящие в клетках процессы, связанные с так называемым фактором стволовых клеток (SCF, который также называют c-kit-лигандом или "жестким" фактором), такие как автофосфорилирование рецептора SCF (kit) или стимулируемую SCF активацию МАРК-киназы (активируемая митогеном протеинкиназа).

Таким образом, кислотно-аддитивная соль метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, главным образом в виде ее кристаллической β-формы, также ингибирует автофосфорилирование рецептора SCF (а также c-kit, протоонкоген). Клетки МO7е представляют собой линию клеток промегакариотической лейкемии человека, пролиферация которых зависит от SCF. Они были получены от Grover Bagby, Oregon Health Science University, США. Клетки культивируют в среде RPMI 1649, дополненной 10%-ной фетальной бычьей сывороткой (ФБС) и 2,5 нг/мл GC-CMF. GM-SCF и SCF имеются в продаже. Получают бессывороточные клетки МO7е и инкубируют в течение 90 мин при 37^oС с тестируемым веществом перед стимулированием рекомбинантным SCF в течение 10 мин при 37^oС. Идентичные количества клеточных лизатов анализируют Вестерн-блоттингом, используя антитела к фосфотирозину (Buchdunger и др., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 92, 2558-2562 (1995)). Иммунологически меченные протеины выявляют с помощью ECL-системы для Вестерн-блоттинга фирмы Amersham (фирма Amersham, Великобритания). Соединение формулы I, прежде всего кристаллическая форма метансульфоната формулы II, ингибирует автофосфорилирование рецептора SCF в диапазоне микромолярных концентраций.

С точки зрения описанных свойств кислотно-аддитивная соль метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, прежде всего ее кристаллическая β-форма, может применяться не только в качестве ингибирующего рост опухоли соединения, например, при мелкоклеточном раке легкого, но и в качестве агента для лечения незлокачественных пролиферативных нарушений, таких как атеросклероз, тромбоз, псориаз, склеродермия и фиброз, а также для защиты стволовых клеток, например для предотвращения гемотоксического действия химиотерапевтических агентов, таких как 5-флурурацил, и для лечения астмы. Ее особенно можно рекомендовать для лечения заболеваний, чувствительных к ингибированию киназного рецептора PDGF.

Кроме того, кислотно-аддитивная соль метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, прежде всего ее кристаллическая β-форма С, предупреждает развитие множественной устойчивости к лекарствам при лечении рака с помощью других химиотерапевтических агентов или устраняет уже существующую устойчивость к другим химиотерапевтическим агентам. Помимо уже указанного ранее действия кислотно-аддитивная соль метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, прежде всего ее кристаллическая β-форма, может с успехом применяться в сочетании c другими противоопухолевыми агентами.

4-(4-Метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил]бензамид и его метансульфонат также ингибируют аbI-киназу, в частности v-abI-киназу. Ингибирование v-abI-тирозинкиназы оценивают по методам, описанным у N. Lydon и др., Oncogene Research, 5, 161-173 (1990), и у J. F. Geissler и др., Cancer Research, 52, 4492-4498 (1992). Согласно этим методам в качестве субстратов используют [Val⁵]-ангиотензин II и [γ^-32P]-АТФ. Установлено, что значение IC₅₀ для 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамида составляет 38 нМ.

Аналогично этому соль соединения формулы I также обладает способностью ингибировать BCR-аbI-киназу (см. Nature Medicine, 2, 561-566 (1996)) и вследствие этого пригодна для лечения BCR-аbI-позитивного рака и связанных с опухолью заболеваний, таких как лейкозы (прежде всего хронический миелоидный лейкоз и острый лимфобластный лейкоз, для которых, в частности, характерны апоптозные механизмы действия), а также обладает активностью в отношении подгруппы лейкозных стволовых клеток и обладает потенциальной активностью в отношении очистки этих клеток in vitro после удаления указанных клеток (например, удаления костного мозга) и повторной имплантации клеток после того, как они были очищены от раковых клеток (например, повторная имплантация очищенных клеток костного мозга).

Кроме того, кислотно-аддитивная соль метансульфоновой кислоты и соединения формулы I может эффективно использоваться при лечении нарушений, возникших в результате трансплантации, например аллогенной трансплантации, главным образом при отторжении ткани, в частности при облитеративном бронхолитиазе (ОБ), т.е. хроническом отторжении аллогенных трансплантатов легкого. В отличие от пациентов, у которых отсутствует ОБ, у пациентов, страдающих ОБ, в жидкостях бронхоальвеолярного лаважа часто обнаруживается повышенная концентрация PDGF. Если метансульфонат 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамида, главным образом в кристаллической β-форме, внутрибрюшинно вводят крысам, имеющим трахеальные аллогенные трансплантаты, например, в дозе 50 мг/кг, то после взятия через 10 и 30 дней 10 трансплантатов из каждой группы для морфометрического анализа возможных эпителиальных повреждений и окклюзии дыхательных путей и исследования активности с помощью иммуногистохимических методов можно обнаружить, что хотя кислотно-аддитивная соль метансульфоновой кислоты и соединения формулы I и не проявляет выраженной активности в отношении эпителиального некроза или инфильтрации воспалительных клеток, тем не менее она обладает способностью заметно уменьшать фибропролиферацию и окклюзию полости по сравнению с контролем. При применении с другими иммуномодулирующими и противовоспалительными веществами, например при использовании в сочетании с циклоспорином, рапамицином или аскомицином либо с их аналогами, обладающими иммунодепрессивной активностью, например с циклоспорином А (ЦсА), циклоспорином G, FK-506, рапамицином или с аналогичными соединениями, с кортикостероидами, циклофосфамидом, азатиоприном, метотрексатом, брехвинаром, лефлуномидом, мизорибином, микофеноловой кислотой, мофетилом микофенолята, 15-дезоксиспергуалином, иммунодепрессантными антителами, в частности с моноклональными антителами к рецепторам лейкоцитов, например МНС (главный комплекс гистосовместимости), CD2, CD3, CD4, CD7, CD25, CD28, В7, CD45, CD58 или с их лигандами, либо с другими иммуномодуляторными соединениями, такими как CTLA4Ig, возможно достижение синергетического эффекта. Если, например, объединяют CsA (1 мг/кг, подкожно) с кислотно-аддитивной солью соединения формулы I (50 мг/кг), возможно проявление синергетического действия.

Кислотно-аддитивная соль метансульфоновой кислоты и соединения формулы I также обладает эффективностью в отношении болезней, связанных с миграцией и пролиферацией клеток гладкой мускулатуры сосудов (в которых часто также определенную роль играют PDGF и рецептор PDGF), таких как рестеноз и атеросклероз. Эти воздействия и их влияние на пролиферацию или миграцию клеток гладкой мускулатуры сосудов могут быть продемонстрированы in vitro и in vivo при введении кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, а также при исследовании in vivo ее воздействия на утолщение внутренней оболочки сосудов после механического повреждения.

В опытах in vitro кислотно-аддитивную соль метансульфоновой кислоты и соединения формулы I применяют в концентрации 10 мМ в 0,1 н. НСl или ДМСО. Затем маточный раствор разбавляют средой для культуры клеток и в экспериментах используют в концентрациях от 10 до 0,1 мкМ. Для введения in vivo кислотно-аддитивную соль метансульфоновой кислоты и соединения формулы I растворяют, например, в ДМСО в концентрации 200 мг/мл и затем разбавляют из расчета 1: 20 1%-ным Твином в 0,9%-ном физиологическом растворе. После обработки ультразвуком получают прозрачный раствор. Каждый день перед введением готовят свежие маточные растворы. (Соединение формулы I для орального введения также может быть растворено просто в деионизированной воде или для парентерального введения - в 0,9%-ном физиологическом растворе). Введение проводят за 24 ч до операции. Кислотно-аддитивную соль метансульфоновой кислоты и соединения формулы I вводят крысам в виде одной дозы в 50 мг/кг в день внутрибрюшинно в течение всего периода наблюдения. Контрольные крысы получают такую же дозу субстрата. Также возможно оральное введение.

Первичные культуры клеток гладкой мускулатуры аорты выделяют из аорты 9-11-дневных крыс линии DA (AG-B4, RT1a), используя модификацию метода, описанного Thyberg и др. (см. Differentiation, 25, 156-167 (1983)). Аорту открывают с помощью продольного разреза и осторожно удаляют эндотелий. Отделяют адвентицию и среднюю оболочку и последнюю разлагают с помощью 0,1%-ной коллагеназы и ДНКазы в забуференном фосфатом физиологическом растворе в течение 30 мин при 37^oС. Клетки центрифугируют, суспендируют в культуральной среде и затем выращивают в пластиковых флаконах. Первичные культуры клеток используют для экспериментов после 2-6 пересевов. Субкульутры выдерживают в среде DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла), дополненной 10%-ной фетальной телячьей сывороткой, 2 ммоль/мл глутамина, 100 ммоль/мл стрептомицина и 100 ед./мл пенициллина. Для целей идентификации клеткам дают расти на стеклянных покровных стеклах и окрашивают актином SMC-α (см. ниже).

Миграцию клеток гладкой мускулатуры оценивают количественно in vitro, используя вкладыш для культуры клеток типа Transwell (фирма Costar, Cambridge, MA), верхние и нижние компартменты которого разделены поликарбонатной мембраной с размером пор 8 мкм. Клетки (100 мкл в концентрации 1 млн. клеток/мл) обрабатывают в верхнем компартменте. Через 2 ч в нижний компартмент, содержащий 0,5%-ную фетальную телячью сыворотку и 0,1%-ный бычий сывороточный альбумин, добавляют 60 нг/мл PDGF-BB или PDGF-AA (фирма Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY) и тестируемое соединение в концентрациях 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03, 0,01 и 0,003 мкМ. Для оценки зависящей от фибронектина миграции на камеры типа Transwell наносят покрытие из фибронектина в концентрации 10 мкг/мл на 24 ч и инкубируют при 4^oС (человеческий клеточный фибронектин, фирма Upstate Biotechnology Inc.). После 24-часовой миграции фильтры удаляют, фиксируют в метаноле и окрашивают гематоксилином по Майеру или эозином. Количество клеток, которые мигрировали на нижнюю сторону фильтровальной мембраны, определяют путем подсчета их количества в специальных секционных областях на фильтрах с помощью световой микроскопии при 400-кратном увеличении. Ингибирование миграции оценивают количественно в виде процента клеток относительно контроля. С целью исключить возможность токсичного действия определяют жизнеспособность клеток путем включения ³Н-тимидина в среду DMEM, дополненную 10%-ной фетальной телячьей сывороткой. Определяют ингибирование миграции, вызванной PDGF-AA и, в частности, PDGF-BB.

Экспериментальные животные. Аорту и сонную артерию самцов крыс линии Wistar (полученных из Центра лабораторных животных Университета г. Хельсинки, Финляндия) подвергают денудации. Крыс анестезируют с помощью внутрибрюшинного введения 240 мг/кг хлораля гидрата бупренорфина (фирма Temgesic, Reckitt & Coleman, Hull, Великобритания) для обезболивания во время операции и после нее. За всеми животными осуществляют уход согласно инструкциям, изложенным в "Principles of Laboratory Animal Care" ("Основы ухода за лабораторными животными") и "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" ("Руководство по уходу и использованию лабораторных животных") Национального института здоровья (NIH) (публикация NIH 86-23, переработанная в 1985 г.). Для процедуры денудации используют крыс весом 200-300 г. Эндотелий левой общей сонной артерии обнажают с помощью внутриполостного введения катетера для эмболэктомии типа 2F (фирма Baxter Healthcare Corporation, Santa Ana, CA, 27). Для отделения эндотелия катетер пропускают через полость трижды, накачивая 0,2 мл воздуха. Внешнюю поверхность сонной артерии зашивают после удаления катетера и рану закрывают. Гистологические изменения оценивают, сравнивая с сечениями средней сонной артерии через 4 дня после денудации. Эндотелий грудной аорты подвергают денудации, используя катетер-баллон Фогарти для артериальной эмболэктомии типа 2F. Для выделения эндотелия катетер вводят в грудную аорту через левую подвздошную артерию, накачивая 0,2 мл воздуха, и пропускают через полость пять раз. Затем подвздошную артерию зашивают. Образцы для оценки гистологических изменений отбирают трижды (на 3, 7 и 14 день).

Для количественной оценки пролиферации клеток используют три различных методики для мечения клеток бромдезоксиуридином (BrdU) после денудации сонной артерии крыс. При использовании этой модели пролиферация клеток средней оболочки сосуда начинается через 24 ч после денудации; клетки внутренней оболочки впервые появляются через 72-96 ч. Для количественной оценки клеток гладкой мускулатуры до появления клеток во внутренней оболочке внутривенно вводят по 0,1 мл реагента, меченного с помощью BrdU (фирма ZYMED, San Francisco, шт. Калифорния), в течение послеоперационного периода через 0-72 ч после денудации (всего 6 раз по 0,1 мл). Для количественной оценки пролиферации во время начальной волны миграции крысам вводят с 8-часовыми интервалами в период времени 72-96 ч после операции 3 х 0,1 мл меченного с помощью BrdU реагента. Для количественной оценки пролиферации в конце начальной волны миграции третьей группе крыс вводят 0,3 мл BrdU в виде ударной дозы за 3 ч до умерщвления.

Образцы для гистологического исследования фиксируют в 3%-ном растворе параформальдегида в течение 4 ч до погружения в парафин. Морфологические изменения оценивают на парафиновых срезах, окрашенных с помощью гематоксилина по Майеру/эозина. Количество клеток в различных срезах сосуда определяют при 400-кратном увеличении. С целью идентификации клеток в культуре и клеток, появившихся в новой внутренней оболочке в течение 4 дней после вызванного денудацией повреждения, проводят иммуногистохимическое окрашивание фиксированных ацетоном образцов, используя антитело к α-актину, полученное из клеток гладкой мускулатуры (фирма Bio-Makor, Rehovot, Израиль). Применяя такой же способ окраски, на фиксированных ацетоном стеклянных покровных стеклах выявляют первичные клетки гладкой мускулатуры. Срезы инкубируют с первичным антителом (разведение 1:2000), промывают и инкубируют последовательно с конъюгированным с пероксидазой кроличьим антителом к мышиному Ig и с козьим антителом к кроличьему Ig, a затем обрабатывают раствором субстрата с хромогеном 3-амино-9-этилкарбазола и перекисью водорода. Окрашенные BrdU клетки получают из парафиновых срезов, используя первичное мышиное антитело (Вu20а, фирма Dako, A/S, Дания) и набор Vectastain Elite ABC-Kit (фирма Vector Laboratories, Buriiname, CA). Срезы освобождают от парафина и обрабатывают в микроволновой печи при 500 Вт (2 x 5 мин в 0,1М цитратном буфере, рН 6), а затем обрабатывают 95%-ным формамидом в 0,15 М тринатрийцитрате в течение 45 мин при 70^oС. Разведения антитела готовят согласно инструкциям производителя. Срезы подвергают контрастному окрашиванию гематоксилином по Майеру и эозином и позитивные клетки подсчитывают отдельно во внутренней оболочке, в средней оболочке и в адвентиции.

В сонной артерии обработанных животных обнаружено значительное уменьшение количества клеток гладкой мускулатуры. В адвентиции и в средней оболочке обнаружено выраженное снижение количества клеток. После добавления кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I во внутренней оболочке, в средней оболочке и в адвентиции слегка уменьшилось абсолютное количество меченных с помощью BrdU клеток во время первых двух периодов мечения (0-72 ч и 72-96 ч), а после 93-96 ч уменьшение количества меченных клеток обнаружено во всех компартментах. Аналогично этому уменьшение количества клеток гладкой мускулатуры обнаружено у животных, аорта которых подвергалась денудации.

Таким образом, согласно этим данным кислотно-аддитивная соль метансульфоновой кислоты и соединения формулы I может ингибировать пролиферацию и главным образом миграцию клеток гладкой мускулатуры сосудов.

Кислотно-аддитивная соль метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, главным образом ее кристаллическая β-форма, также обладает способностью ингибировать ангиогенез. Это может быть продемонстрировано следующим образом. Нормальным мышам (линии С57 BL/6) подкожно имплантируют камеру, содержащую агар (0,8%) и гепарин (2 ед./мл), с добавлением фактора роста (VEGF 3 мкг/мл, PDGF 1 мкг/мл или bFGF 0,3 мкг/мл) или без них. Кислотно-аддитивную соль метансульфоновой кислоты и соединения формулы I вводят орально в дозе, которая обладает хорошей противоопухолевой активностью, установленной с использованием в качестве модели ксенотрансплантата лишенных волосяного покрова мышей. Дозирование начинают за 1 день до имплантации камер. Камеры удаляют через 5 дней. Эффективность в отношении ангиогенеза оценивают количественно, анализируя васкуляризованную ткань, выросшую вокруг имплантата, а также уровень крови в этой ткани (внешняя кровь). Уровень крови оценивают по количеству гемоглобина. Хотя сосуды не растут на агаре, агар приобретает интенсивный красный цвет, если имеет место антиангиогенное действие. Если соединение ингибирует увеличение уровня крови, индуцированное фактором роста, то, вероятно, оно может блокировать ангиогенное действие, обусловленное фактором роста. Ингибирование массы, а не объема крови, позволяет предположить воздействие на пролиферацию фибробластов. Подавление контрольной реакции позволяет предположить наличие способности ингибировать заживление раны. При применении орально в дозе 50 мг/кг один раз в день соединение формулы I ингибирует ангиогенное действие всех трех факторов роста (VEGF, PDGF, bFGF).

Следует подчеркнуть, что все вышеуказанные ингибирующие и фармакологические действия также обнаружены при использовании свободного основания, т. е. 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамида, а также других его солей. Настоящее изобретение главным образом относится к кристаллической β-форме кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, предназначенной для лечения одной из указанных болезней или для приготовления фармацевтического агента, предназначенного для лечения одной из указанных болезней.

Антипролиферативная, главным образом противоопухолевая активность кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, выявленная in vivo, была описана, например, в отношении лечения аbI-зависимых опухолей в Nature Med., 2, 561-566 (1996).

Изобретение также относится к способу лечения теплокровных животных, страдающих указанными болезнями, главным образом связанными с опухолью болезнями, согласно которому теплокровным животным, нуждающимся в таком лечении, вводят такое количество кристаллической β-формы кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, которое эффективно в отношении указанных болезней, в частности количество, обладающее антипролиферативным и главным образом ингибирующим опухоль действием. Кроме того, изобретение относится к применению кристаллической β-формы кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I для ингибирования вышеуказанных тирозинкиназ, главным образом киназного рецептора PDGF, v-аbI-киназы и/или киназного рецептора c-kit, или для изготовления фармацевтических композиций, предназначенных для лечения человека или животного, главным образом для лечения опухолей, таких как глиомы, опухоли яичника, опухоли предстательной железы, опухоли толстой кишки и опухоли легкого, главным образом такие, как мелкоклеточная карцинома легкого, и опухоли молочной железы или другие гинекологические опухоли. В зависимости от видов, возраста, индивидуального состояния, путей введения и существующей клинической картины теплокровным животным весом примерно 70 кг вводят эффективные дозы, например суточные дозы, составляющие примерно 1-2500 мг, предпочтительно 1-1000 мг, особенно предпочтительно 5-500 мг.

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим эффективное количество, в частности количество, эффективное для предупреждения или лечения одной из указанных болезней, кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I в кристаллической β-форме в сочетании с фармацевтически приемлемыми носителями, которые пригодны для местного, энтерального, например орального или ректального, или парентерального введения и могут представлять собой неорганические или органические и твердые или жидкие вещества. Для орального введения наиболее пригодны таблетки или желатиновые капсулы, содержащие действующее вещество и разбавители, например лактозу, декстрозу, сахарозу, маннит, сорбит, целлюлозу и/или глицерин, и/или замасливатели, например двуокись кремния, тальк, стеариновую кислоту или ее соли, как правило, стеарат магния или кальция, и/или полиэтиленгликоль. Таблетки также могут содержать связующие вещества, например алюмосиликат магния, крахмалы, как правило, кукурузный, пшеничный или рисовый крахмал, желатин, метилцеллюлозу, натрийкарбоксиметилцеллюлозу и/или поливинилпирролидон, и при необходимости разрыхлители, например крахмалы, агар, альгиновую кислоту или ее соль, как правило, альгинат натрия, и/или шипучие смеси или адсорбенты, красители, корригенты и подслащивающие вещества. Кроме того, фармакологически активные соединения по настоящему изобретению могут применяться в форме композиций для парентерального введения или растворов для инфузии. Такие растворы предпочтительно представляют собой изотонические водные растворы или суспензии, и их можно готовить перед употреблением, например, в случае лиофилизированных препаратов, содержащих либо одно действующее вещество, либо действующее вещество в сочетании с носителем, например с маннитом. Фармацевтические вещества могут быть подвергнуты стерилизации и/или могут содержать эксципиенты, например консерванты, стабилизаторы, смачивающие агенты и/или эмульгаторы, стабилизаторы, соли для регуляции осмотического давления и/или буферы. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению, которые при необходимости могут содержать дополнительные фармакологически активные вещества, такие как антибиотики, изготавливают по хорошо известной технологии, например с помощью обычных методов смешения, грануляции, нанесения покрытия, растворения или лиофилизации, и они содержат примерно от 1 до 100%, в частности от 1 до примерно 20% действующего вещества или действующих веществ.

Ниже изобретение проиллюстрировано на примерах, которые не ограничивают его объем. Значения R_f определяют на пластинках для ТСХ (тонкослойная хроматография), покрытых силикагелем (фирма Merck, Darmstadt, Германия). Соотношение растворителей и другого компонента в системе растворителей приведено в виде объемного соотношения (об./об.), а температуры указаны в градусах Цельсия (^oС).

Элюенты (градиенты) Градиенты для ЖХВР: 0% элюента б) в элюенте а) в течение 20 мин, затем 0%-->30% элюента б) в элюенте а) в течение 10 мин, затем 30% элюента б) в элюенте а) в течение 5 мин.

Элюент а): реагент, способствующий образованию ионных пар, и метанол (420 мл+580 мл).

Элюент б): реагент, способствующий образованию ионных пар, и метанол (40 мл+960 мл).

Реагент, способствующий образованию ионных пар: 7,5 г 1-октансульфоновой кислоты, растворенной примерно в 800 мл воды, значение рН доводят до 2,5 с помощью фосфорной кислоты и разбавляют водой до 1000 мл.

Колонка: 150 x 3,9 мм, упакованная Symmetry C18 5 мкм (фирма Waters), предварительно уравновешенная элюентом а).

Скорость потока: 1,2 мл/мин, обнаружение с помощью УФ при 267 нм.

Пример 1. Получение кристаллической β-формы метансульфоната 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил]бензамида.

Вариант 1 11 мас.%-ную суспензию метансульфоната 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамида в кристаллической α-форме разлагают в метаноле в течение 2 дней примерно при 25^oС. Кристаллы выделяют фильтрацией с использованием стеклянного фильтра с фриттой типа G4 и сушат в течение ночи при комнатной температуре на фильтровальной бумаге. Температура плавления (t_пл, с помощью ДСК) составляет 217^oС (начало плавления).

Исходный продукт - метансульфонат 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамида получают следующим путем. 98,6 г (0,2 моля) свободного 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил] бензамида (метод получения см., например, в ЕР-А 0564409) добавляют к 1,4 л этанола. К образовавшейся суспензии бежевого цвета по каплям в течение 20 мин добавляют 19,2 г (0,2 моля) метансульфоновой кислоты. Раствор кипятят с обратным холодильником в течение 20 мин и затем фильтруют при 65^oС до получения прозрачного раствора. Фильтрат упаривают на 50% и остаток отфильтровывают при 25^oС (продукт фильтрации А). Маточный раствор упаривают досуха. Этот остаток и продукт фильтрации А суспендируют в 2,2 л этанола и растворяют при температуре дефлегмации, добавляя 30 мл воды. Охлаждают в течение ночи до 25^oС, фильтруют и сушат при 65^oС до постоянной массы, получая 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил]бензамид в виде кристаллического мезилата (кристаллическая α-форма) светло-бежевого цвета.

Пример 2. Получение кристаллической β-формы метансульфоната 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил]бензамида.

Вариант 2
50,0 г (101 ммоль) 4-[(4-метил-1-пиперазинил)метил)]-N-[4-метил-3-[[4-(3-пиридинил)-2-пиримидинил] амино] фенил] бензамида суспендируют в метаноле (480 мл). Добавляют 9,71 г (101 ммоль) метансульфоновой кислоты и метанол (20 мл), нагревают до 50^oС, добавляют активированный уголь (5,0 г) и смесь кипятят с обратным холодильником в течение 30 мин, фильтруют и концентрируют упариванием. Остаток растворяют в метаноле (150 мл) и производят затравку кристаллизации с помощью метансульфоната 4-[(4-метил-1-пиперазинил)метил]-N-[4-метил-3-1[4-(3-пиридинил)-2-пиримидинил]амино]фенил]бензамида (β-модификация, несколько мг), что приводит к кристаллизации продукта. После сушки при 50 мбар и 60^oС получают β-модификацию метансульфоната 4-[(4-метил-1-пиперазинил)метил]-N-[4-метил-3-[[4-(3-пиридинил)-2-пиримидинил]амино] фенил] бензамида; R_f0,58 (метиленхлорид : этилацетат : метанол : концентрированный водный раствор гидроксида аммония в соотношении 60:10:30:2); ЖХВР: t _удерж 10,2 мин. Т.пл. (ДСК) 217^oС (начало плавления).

Пример 3. Получение кристаллической β-формы метансульфоната 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил]бензамида.

Вариант 3
670 г (1136 ммоля) метансульфоната [(4-метил-1-пиперазинил)метил]-N-[4-метил-3-[[4-(3-пиридинил)-2-пиримидинил]амино]фенил]бензамида, α-модификация, нагревают в метаноле (1680 мл). При 60^oС производят затравку кристаллизации раствора с помощью метансульфоната 4-[(4-метил-1-пиперазинил)метил]-N-[4-метил-3-[[4-(3-пиридинил)-2-пиримидинил]амино]фенил]бензамида (β-модификация, 55 мг), в результате чего начинается кристаллизация продукта. После сушки при 50 мбар и 100^oС получают β-модификацию метансульфоната 4-[(4-метил-1-пиперазинил)метил] -N-[4-метил-3-[[(4-(3-пиридинил)-2-пиримидинил] амино] фенил] бензамида; R_f 0,58 (метиленхлорид : этилацетат : метанол : концентрированный водный раствор гидроксида аммония в соотношение 60:10:30:2); ЖХВР: t_удерж10,2 мин. Т.пл. (ДСК) 217^oС (начало плавления).

Пример 4. Приготовление таблеток на основе кристаллической β-формы метансульфоната 4-[(4-метил-1-пиперазинил)метил] -N-[4-метил-3-[[4-(3-пиридинил)-2-пиримидинил]амино]фенил]бензамида.

Таблетки, содержащие 100 мг указанного в заголовке действующего вещества, обычно имеют следующий состав, мг:
Действующее вещество - 100
Кристаллическая лактоза - 240
Avicel - 80
ПВПП-ПС - 20
Аэросил - 2
Стеарат магния - 5 - 447
Способ приготовления. Действующее вещество смешивают с носителями и прессуют с помощью таблетирующей машины (Korsch EKO, диаметр штампа 10 мм).

Avicel обозначает микрокристаллическую целлюлозу (фирма FMC, Philadelphia, США), ПВПП-ПС обозначает поперечно сшитый поливинилполипирролидон (фирма BASF, Германия).

Аэросил обозначает двуокись кремния (фирма Degussa, Германия).

Пример 5. Приготовление капсул на основе кристаллической β-формы метансульфоната 4-[(4-метил-1-пиперазинил)метил] -N-[4-метил-3-[[4-(3-пиридинил)-2-пиримидинил]амино]фенил]бензамида.

Капсулы, содержащие 100 мг указанного в заголовке действующего вещества, обычно имеют следующий состав, мг:
Действующее вещество - 100
Avicel - 200
ПВПП-ПС - 15
Аэросил - 2
Стеарат магния - 1,5 - 318,5
Капсулы изготавливают путем смешения компонентов и смесью заполняют желатиновые капсулы с твердым покрытием размера 1.

Формула изобретения

1. Кислотно-аддитивная соль монометансульфоновой кислоты и соединения формулы I

в форме, включающей по меньшей мере 90 мас. % кристаллов, имеющих β-модификацию, причем кристаллы, имеющие β-модификацию, являются негигроскопичными и остаются практически безводными в стеклянной климатической камере при 25^oС и при относительной влажности до 93% включительно.

2. Кристаллическая форма по п.1 кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, которая включает по меньшей мере 95 мас. % кристаллов, имеющих β-модификацию, и которая остается безводной при относительной влажности 93% и при 25^oС.

3. Кристаллическая форма по п.1 кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, которая включает по меньшей мере 99 мас. % кристаллов, имеющих β-модификацию, и которая остается безводной при относительной влажности 93% и при 25^oС.

4. Кристаллическая β-форма по п.1 кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, которая включает по меньшей мере 99 мас.% кристаллов, имеющих β-модификацию, и температура плавления которой ниже 225^oС.

5. Кристаллическая β-форма по п.1 кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, которая включает по меньшей мере 99 мас. % кристаллов, имеющих β-модификацию, и температура плавления которой, определяемая как начало плавления на термограмме, полученной с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии, 217^oС.

6. Кристаллическая β-форма по п.1 кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, отличающаяся наличием на рентгенограмме, полученной рентгенодифракционным анализом, пика при угле преломления 2Θ = 20^o, причем этот пик имеет относительную интенсивность линии, равную 65 по сравнению с наиболее интенсивной линией на рентгенограмме.

7. Кристаллическая β-форма по п.3 кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, отличающаяся наличием на рентгенограмме, полученной рентгенодифракционным анализом, линий, относительная интенсивность которых при следующих углах преломления 2Θ (относительные интенсивности линий в % даны в скобках): 9,7^o (40); 13,9^o (26); 14,7^o (23); 17,5^o (57); 18,2^o (90); 20,0^o (65); 20,6^o (76); 21,1^o (100); 22,1^o (89); 22,7^o (38); 23,8^o (44); 29,8^o (23) и 30,8^o (20) составляет 20% или более по сравнению с наиболее интенсивной линией на рентгенограмме.

8. Кристаллическая β-форма по п.5 кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I, температура плавления которой, определяемая как начало плавления на термограмме, полученной с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии, составляет от 217^oС и которая имеет практически такую же рентгенограмму, что и приведенная ниже, где угол отражения 2Θ отложен на горизонтальной оси, а относительная интенсивность на вертикальной оси: (см. графическую часть).

9. Кислотно-аддитивная соль по любому из пп.1-8, в виде кристаллов β-модификации, предназначенная для получения фармацевтической композиции для лечения или диагностики опухолевых заболеваний.

10. Фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью, для лечения или диагностики опухолевых заболеваний, включающая кристаллическую β-форму по любому из пп.1-8 кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I и фармацевтически приемлемый носитель.

11. Способ получения кристаллов β-модификации по п.1, отличающийся тем, что осуществляют разложение другой кристаллической формы кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I с помощью подходящего полярного растворителя в суспензии при 20 - 50^oС.

12. Способ получения кристаллов β-модификации по п.1, отличающийся тем, что растворяют другую кристаллическую форму или аморфный исходный продукт кислотно-аддитивной соли метансульфоновой кислоты и соединения формулы I в полярном растворителе при приемлемой температуре, находящейся в диапазоне от 25^oС до температуры дефлегмации реакционной смеси, а затем инициируют кристаллизацию, добавляя небольшое количество кристаллов β-модификации в качестве затравочного кристалла при 20 - 70^oС.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7