Способ получения лекарственного средства для лечения заболеваний сетчатки и пигментного эпителия глаза, а также сосудистой оболочки глаза

Изобретение относится к области медицины, а более конкретно к офтальмологии. Способ заключается в том, что выделяют из свежеэнуклеированных глаз позвоночных животных макулярную область пигментного эпителия сетчатки, промывают ее в физиологическом растворе, выдерживают ткань пигментного эпителия в водно-солевом растворе при 4-7°С в течение 2-4 часов, центрифугируют, собирают надосадочную жидкость, разделяют ее методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы при рН 3,5-10,0, собирают фракции основных белков, удаляют из них сахарозу и амфолины методом диализа, полученный при этом раствор белка высушивают и очищают электрофорезом в 7,5-15%-ном полиакриламидном геле, затем элюируют низкомолекулярную фракцию с Rf=0,4-0,9 деионизованной водой из геля в диализных мешках, с пределом пропускания пор 2-8 кДа, полученный регуляторный пептид сушат и растворяют в физиологическом водно-солевом растворе. Изобретение обеспечивает повышение процента выхода регуляторных пептидов, обладающих биологической активностью в сверхмалых дозах, выделение высокоочищенных полипептидов с низкой молекулярной массой.

 

Изобретение относится к области медицины, а более конкретно к офтальмологии.

Известно изобретение по патенту РФ №2232586 - офтальмологическое лекарственное средство и способ лечения заболеваний, патологических состояний и повреждений сетчатой оболочки глаза МКИ 7 А61К 35/44, 38/17, А61F 9/00, A61P 27/02, приоритет от 23.04.2003.

Изобретение заключается в следующем: офтальмологическое лекарственное средство, включающее препарат сетчатки и фармацевтически приемлемый носитель, заключающееся в том, что оно содержит в качестве препарата сетчатки гликопротеин, выделенный из сетчатки глаза млекопитающих, растворимый в насыщенном растворе сульфата аммония, имеющий изоэлектрическую точку ниже 3,0 и кажущуюся молекулярную массу от 8 до 200 кДа и, возможно, хлористый кальций.

Однако данное изобретение обладает существенными недостатками: они не используют ткани макулярной области нейральной сетчатки, основная часть регуляторных пептидов выпадает в осадок в связи с растворением экстрактов ткани в насыщенном растворе сульфата аммония, большая молекулярная масса белков.

Известно изобретение по патенту РФ №2073518 - средство, восстанавливающее функцию сетчатой оболочки глаза МКИ 6 А61К 35/44, А61F 9/00, приоритет от 17.06.93.

Изобретение заключается в следующем: средство, восстанавливающее функцию сетчатой оболочки глаза, представляет собой комплекс низкомолекулярных полипептидов, полученных из сетчатки животных путем экстракции 3%-ным раствором уксусной кислоты с добавлением хлористого цинка и обработки надосадочной жидкости ацетоном.

Однако данное изобретение обладает существенными недостатками: они не используют ткани макулярной области нейральной сетчатки, высокая концентрация полипептидов в препарате, используется комплекс низкомолекулярных полипептидов, нет высокой степени очистки препарата.

Техническая задача, решаемая предлагаемым изобретением, заключается в том, что используют области пигментного эпителия сетчатки, содержащие наибольшее количество биохимически и физиологически активных белков и полипептидов, что позволяет повысить процент выхода регуляторных пептидов, обладающих биологической активностью в сверхмалых дозах, выделять высокоочищенные полипептиды с низкой молекулярной массой.

Указанная техническая задача решается тем, что в способе получения лекарственного средства для лечения заболеваний сетчатки и пигментного эпителия глаза, также сосудистой оболочки глаза из свежеэнуклеированных глаз позвоночных животных выделяют макулярные области ткани пигментного эпителия сетчатки, промывают их в водно-солевом физиологическом растворе, выдерживают ткань пигментного эпителия в водно-солевом растворе при 4-7°С в течение 2-4 часов, центрифугируют тканевой экстракт, собирают надосадочную жидкость, разделяют ее методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы при рН 3,5-10,0, температуре 4-6°С и напряжении 500-2000 В в течение 72-96 часов, после этого собирают фракции основных белков рН 8,5-9,5, объединяют их, диализуют до полного удаления сахарозы и амфолинов в диализных мешках с пределом пропускания пор 2-8 кДа при 4-7°С в течение 10-14 дней. Полученный при этом водный раствор белка высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, которое очищают методом электрофореза в 7,5-15%-ном полиакриламидном геле, собирают низкомолекулярную фракцию Rf=0,4-0,9, содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля в течение 2-5 дней при 4-7°С, полученную фракцию диализуют деионизованной водой в диализных мешках с пределом пропускания пор 2-8 кДа в течение 7-10 дней при 4-7°С, отдиализованный раствор регуляторного пептида далее повторно высушивают лиофильно до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка, который затем растворяют в физиологическом водно-солевом растворе. Полученный при этом раствор разбавляют до концентрации 10^-10-10^-12 мг/мл и разливают во флаконы путем холодной стерилизации с использованием мембранных фильтров.

Способ характеризуется следующими примерами.

Пример 1.

Выделяют из свежеэнуклеированных глаз крупного рогатого скота ткани макулярной области пигментного эпителия сетчатки при температуре 20°С и давлении 730 мм рт.ст., промывают их в водно-солевом физиологическом растворе (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды), выдерживают ткани макулярной области пигментного эпителия сетчатки в водно-солевом растворе (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды) при Т=+7°С и давлении 730 мм рт.ст. в течение 4 часов, центрифугируют тканевой экстракт при 2500g 10 мин при Т=20°С и давлении 730 мм рт.ст., осуществляют сбор надосадочной жидкости и разделяют ее методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы в интервале рН 3,5-10,0 при температуре +6°С и напряжении 500-2000 В в течение 96 часов, собирают фракции основных белков (рН 9,5), объединяют их, диализуют до полного удаления сахарозы и амфолинов диализных мешках с пределом пропускания пор 2 кДа в течение 14 дней при Т=+4°С, давлении 730 мм рт.ст., далее полученный водный раствор белка лиофильно высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, лиофилизат, представляющий собой белый хлопьевидный мелкодисперсный порошок, далее фракционируют с помощью метода электрофореза в нативных условиях в 7,5%-ном полиакриламидном геле при Т=25°С и давлении 730 мм рт.ст., собирают низкомолекулярную фракцию (Rf=0,9), содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля в течение 5 дней при Т=+4°С, давлении 730 мм рт.ст., полученную фракцию диализуют против деионизованной воды в диализных мешках с пределом пропускания не ниже 2 кДа в течение 10 дней при T=+4⁰C, давлении 730 мм рт.ст., отдиализованный белковый раствор далее повторно высушивают лиофильно до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка для приготовления лекарственного средства, из препарата регуляторного пептида, полученного после электрофореза, приготавливают исходный раствор пептида, растворяя сухой лиофилизованный порошок регуляторного пептида в физиологическом водно-солевом растворе (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 1 мМ KCl - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl на 1 л деионизованной воды), концентрацию регуляторного пептида в исходном растворе определяют с помощью колориметрического метода с использованием бицинхониновой кислоты, растворы регуляторного пептида в концентрациях, соответствующих 10^-1-10^-9 мг/мл, приготавливают путем последовательного разбавления в физиологическом растворе в 10 раз исходного раствора, при постоянном встряхивании после каждого разведения, при температуре 20°С и давлении 730 мм рт.ст., затем в 100-мл мерную колбу вносили 10 мл раствора регуляторного пептида в концентрации, соответствующей 10^-9 мг/мл, и далее прибавляют физиологический раствор (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, на 1 л деионизованной апирогенной воды) до объема 100 мл и перемешивают при температуре 20°С, полученный раствор с концентрацией 10^-10 мг/мл разливают во флаконы в стерильных условиях, используя фильтры для холодной стерилизации с размером пор 0,22 мкм, в асептических условиях стерильного бокса и ламинарного потока воздуха. Конечный выход активного пептида получают равным 2 мг из 50 глаз сырого продукта, после очистки методом электрофореза получают пептиды с молекулярной массой менее 8 кДа, активность пептидов методом биотестирования равна 125-160%. Высокоочищенные препараты получают после очистки методом электрофореза и проверяют методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте вода/ацетонитрил на колонке С8: при детекции с длиной волны 280 нм гомогенный препарат элюируется с колонки с временем удержания 3-4 мин.

Пример 2.

Выделяют из свежеэнуклеированных глаз крыс ткани макулярной области пигментного эпителия сетчатки при температуре 25°С и давлении 760 мм рт.ст., промывают их в солевом водном физиологическом растворе (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды), выдерживают ткани макулярной области пигментного эпителия сетчатки в солевом водном растворе (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды) при Т=+4°С и давлении 760 мм рт.ст. в течение 3 часов, центрифугируют тканевой экстракт при 3000g 15 мин при Т=25°С и давлении 760 мм рт.ст., осуществляют сбор надосадочной жидкости и разделяют ее методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы в интервале рН 3,5-10,0 при температуре +4°С и напряжении 500-2000 В в течение 96 часов, собирают фракции основных белков (рН 8,5), объединяют их, диализуют до полного удаления сахарозы и амфолинов в диализных мешках с пределом пропускания 8 кДа в течение 10 дней при Т=+7°С, давлении 760 мм рт.ст., далее полученный водный раствор белка лиофильно высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, лиофилизат, представляющий собой белый хлопьевидный мелкодисперсный порошок, далее фракционируют с помощью метода электрофореза в нативных условиях в 15%-ном полиакриламидном геле при Т=+25°С и давлении 760 мм рт.ст., собирают низкомолекулярную фракцию (Rf=0,6), содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля в течение 4 дней при Т=+7°С, давлении 760 мм рт.ст., полученную фракцию диализуют против деионизованной воды в диализных мешках с пределом пропускания 8 кДа в течение 7 дней при Т=+7°С, давлении 760 мм рт.ст., отдиализованный белковый раствор далее повторно высушивают лиофильно до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка для приготовления лекарственного средства, из препарата регуляторного пептида, полученного после электрофореза, приготавливают исходный раствор пептида, растворяя сухой лиофилизованный порошок регуляторного пептида в физиологическом водно-солевом растворе (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 1 мМ KCl - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl на 1 л деионизованной воды), концентрацию регуляторного пептида в исходном растворе определяют с помощью колориметрического метода с использованием бицинхониновой кислоты, растворы регуляторного пептида в концентрациях, соответствующих 10^-1-10^-9 мг/мл, приготавливают путем последовательного разбавления в физиологическом растворе в 10 раз исходного раствора, при постоянном встряхивании после каждого разведения, при температуре +25°С и давлении 760 мм рт.ст., затем в 100-мл мерную колбу вносили 10 мл раствора регуляторного пептида в концентрации, соответствующей 10^-8 мг/мл, и далее прибавляют физиологический раствор (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, на 1 л деионизованной апирогенной воды) до объема 100 мл и перемешивают при температуре +25°С, полученный раствор в концентрации 10^-9 мг/мл разливают во флаконы в стерильных условиях, используя фильтры для холодной стерилизации с размером пор 0,22 мкм, в асептических условиях стерильного бокса и ламинарного потока воздуха. Конечный выход активного пептида получают равным 1 мг из 50 глаз сырого продукта, после очистки методом электрофореза получают пептиды с молекулярной массой менее 8 кДа, активность пептидов методом биотестирования равна 125-160%.

Пример 3.

Выделяют из свежеэнуклеированных глаз 7-, 14-, 19-дневных куриных эмбрионов ткани макулярной области пигментного эпителия сетчатки при температуре +23°С и давлении 745 мм рт.ст., промывают их в солевом водном физиологическом растворе (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды), выдерживают ткани макулярной области пигментного эпителия сетчатки в солевом водном растворе (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды) при Т=+5°С и давлении 745 мм рт.ст. в течение 2 часов, центрифугируют тканевой экстракт при 3000g 10 мин при Т=23°С и давлении 745 мм рт.ст., осуществляют сбор надосадочной жидкости и разделяют ее методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы в интервале рН 3,5-10,0 при температуре +5°С и напряжении 500-2000 В в течение 72 часов, собирают фракции основных белков (рН 10,0), объединяют их, диализуют до полного удаления сахарозы и амфолинов в диализных мешках с пределом пропускания пор 5 кДа в течение 12 дней при Т=+5°С, давлении 745 мм рт.ст., далее полученный водный раствор белка лиофильно высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, лиофилизат, представляющий собой белый хлопьевидный мелкодисперсный порошок, далее фракционируют с помощью метода электрофореза в нативных условиях в 12,5%-ном полиакриламидном геле при Т=23°С и давлении 745 мм рт.ст., собирают низкомолекулярную фракцию (Rf=0,8), содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля в течение 4 дней при Т=+5°С, давлении 745 мм рт.ст., полученную фракцию диализуют против деионизованной воды в диализных мешках с пределом пропускания 2 кДа в течение 8 дней при Т=+5°С, давлении 745 мм рт.ст., отдиализованный белковый раствор далее повторно высушивают лиофильно до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка для приготовления лекарственного средства, из препарата регуляторного пептида, полученного после электрофореза, приготавливают исходный раствор пептида, растворяя сухой лиофилизованный порошок регуляторного пептида в физиологическом водно-солевом растворе (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 1 мМ KCl - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl на 1 л деионизованной воды), концентрацию регуляторного пептида в исходном растворе определяют с помощью колориметрического метода с использованием бицинхониновой кислоты, растворы регуляторного пептида в концентрациях, соответствующих 10^-1-10^-9 мг/мл, приготавливают путем последовательного разбавления в физиологическом растворе в 10 раз исходного раствора, при постоянном встряхивании после каждого разведения, при температуре 23°С и давлении 745 мм рт.ст., затем в 100-мл мерную колбу вносили 10 мл раствора регуляторного пептида в концентрации, соответствующей 10^-9 мг/мл, и далее прибавляют физиологический раствор (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, на 1 л деионизованной апирогенной воды) до объема 100 мл и перемешивают при температуре 23°С, полученный раствор в концентрации 10^-10 мг/мл разливают во флаконы в стерильных условиях, используя фильтры для холодной стерилизации с размером пор 0,22 мкм, в асептических условиях стерильного бокса и ламинарного потока воздуха. Конечный выход активного пептида получают равным 1,5 мг из 50 глаз сырого продукта, после очистки методом электрофореза получают пептиды с молекулярной массой менее 8 кДа, активность пептидов методом биотестирования равна 125-160%.

Пример 4.

Выделяют из свежеэнуклеированных глаз лягушек Xenopus laevis ткани макулярной области пигментного эпителия сетчатки при температуре 24°С и давлении 740 мм рт.ст., промывают их в солевом водном физиологическом растворе (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды), выдерживают ткани макулярной области пигментного эпителия сетчатки в солевом водном растворе (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды) при Т=+6°С и давлении 740 мм рт.ст. в течение 4 часов, центрифугируют тканевой экстракт при 2000g 15 мин при Т=24°С и давлении 740 мм рт.ст., осуществляют сбор надосадочной жидкости и разделяют ее методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы в интервале рН 3,5-10,0 при температуре +4°С и напряжении 500-2000 В в течение 96 часов, собирают фракции основных белков (рН=9,0), объединяют их, диализуют до полного удаления сахарозы и амфолинов в диализных мешках с пределом пропускания пор 8 кДа в течение 14 дней при Т=+6°С, давлении 740 мм рт.ст., далее полученный водный раствор белка лиофильно высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, лиофилизат, представляющий собой белый хлопьевидный мелкодисперсный порошок, далее фракционируют с помощью метода электрофореза в нативных условиях в 7,5%-ном полиакриламидном геле при Т=24°С и давлении 740 мм рт.ст., собирают низкомолекулярную фракцию (Rf=0,4), содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля в течение 4 дней при Т=+4°С, давлении 740 мм рт.ст., полученную фракцию диализуют против деионизованной воды в диализных мешках с пределом пропускания 3 кДа в течение 7 дней при Т=+6°С, давлении 740 мм рт.ст., отдиализованный белковый раствор далее повторно высушивают лиофильно до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка для приготовления лекарственного средства, из препарата регуляторного пептида, полученного после электрофореза, приготавливают исходный раствор пептида, растворяя сухой лиофилизованный порошок регуляторного пептида в физиологическом водно-солевом растворе (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 1 мМ KCl - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl на 1 л деионизованной воды), концентрацию регуляторного пептида в исходном растворе определяют с помощью колориметрического метода с использованием бицинхониновой кислоты, растворы регуляторного пептида в концентрациях, соответствующих 10^-1-10^-9 мг/мл, приготавливают путем последовательного разбавления в физиологическом растворе в 10 раз исходного раствора, при постоянном встряхивании после каждого разведения, при температуре 24°С и давлении 740 мм рт.ст., затем в 100-мл мерную колбу вносили 10 мл раствора регуляторного пептида в концентрации, соответствующей 10^-8 мг/мл, и далее прибавляют физиологический раствор (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, на 1 л деионизованной апирогенной воды) до объема 100 мл и перемешивают при температуре 24°С, полученный раствор в концентрации 10^-9 мг/мл разливают во флаконы в стерильных условиях, используя фильтры для холодной стерилизации с размером пор 0,22 мкм, в асептических условиях стерильного бокса и ламинарного потока воздуха. Конечный выход активного пептида получают равным 1 мг из 50 глаз сырого продукта, после очистки методом электрофореза получают пептиды с молекулярной массой менее 8 кДа, активность пептидов методом биотестирования равна 125-160%.

Пример 5.

В качестве экспериментальной модели, отражающей дегенеративные процессы в сетчатке и в сосудистой оболочке, используют культуру заднего отдела глаза крыс. Исследование проводят на крысах линии Wistar, обоего пола, весом 200 г.

Крыс забивают с помощью эфирного наркоза, из энуклеированных глаз под микроскопическим контролем удаляют микрохирургическим путем переднюю камеру глаза (роговица, хрусталик, жидкость передней камеры глаза и ростовую зону сетчатки с радужкой). Изолированные задние отделы глаз культивируют в питательной среде 199 без добавления сыворотки крови в присутствии препарата регуляторного пептида, выделенного из ретинального пигментного эпителия глаза позвоночных в конечной концентрации, соответствующей 10^-10 мг белка/мл. Препарат регуляторного пептида добавляют в питательную среду 199 в соотношении 1:10 (по объему) 1 раз в начале культивирования заднего отдела глаза крыс in vitro.

Культуры инкубируют в стерильных условиях в течение 45-50 часов при температуре 37°С. В качестве контроля изучают задние отделы глаза, культивированные в питательной среде 199, в которую не добавляют препарат. Влияние исследуемого препарата регуляторного пептида, выделенного из ретинального пигментного эпителия, оценивают по морфологическому состоянию тканей заднего отдела глаза крысы. Для каждого культивированного образца проводят сравнительный морфологический анализ состояния четырех тканей, составляющих задний отдел глаза: склеральный отдел, сосудистая оболочка, пигментный эпителий сетчатки, нейральная сетчатка (ганглиозный слой, наружный и внутренний сетчатые слои, наружный и внутренний ядерные слои, слой отростков фоторецепторов).

При длительном культивировании заднего отдела глаза взрослых особей позвоночных животных in vitro во всех тканях наблюдают развитие деструктивных явлений, в частности в нейральной сетчатке и пигментном эпителии сетчатки, которые характерны для ряда ретинопатий, а также для пигментного ретинита у человека. В настоящем исследовании на вторые сутки в контрольных культурах наблюдают картину развития дегенеративных процессов во всех тканях заднего отдела глаза. Следует отметить, что среди первых в изучаемых тканях идентифицируют нарушения адгезивных межклеточных взаимодействий, топографически тесное взаимодействие между тканями нарушается. В контроле наблюдают картину, предшествующую началу разрушения тканей глаза и адгезивных связей между ними. Внутри склеры обнаруживают полости, а в сосудистой оболочке наблюдают разрывы и отслоение от склеральной оболочки.

Во всех слоях сетчатки отмечают нарушения межклеточных контактных взаимодействий. Слой отростков фоторецепторов имеет рыхлую структуру, обнаруживают значительное количество сломанных отростков в интерфоторецепторном матриксе. Ширина интерфоторецепторного матрикса варьирует в участках среза и местами очень велика. Происходит также частичное разрушение пигментного эпителия за счет нарушения межклеточных контактов в пределах монослоя. Таким образом, картина состояния тканей заднего отдела глаза крыс в значительной степени отражает состояние, которое характеризуется как начальный этап развития деструкции тканей глаза. Такую картину состояния тканей заднего отдела глаза наблюдают при различных заболеваниях сетчатки у человека, например при дистрофии и пигментном ретините.

Добавление в среду культивирования препарата регуляторного пептида, выделенного из пигментного эпителия глаза, способствует сохранению пространственной организации тканей заднего отдела глаза, сохраняются межтканевые взаимодействия: сосудистая оболочка - мембрана Бруха - пигментный эпителий - сетчатка. Наблюдают максимальную сохранность пигментного эпителия сетчатки по сравнению с контролем. Кроме того, отмечают достоверное уменьшение толщины сосудистой оболочки по сравнению с контролем, что, в свою очередь, свидетельствует о сосудосуживающем действии исследуемого регуляторного пептида. Оценку относительной толщины различных слоев сетчатки и сосудистой оболочки после культивирования проводят на полутонких срезах.

Наблюдают плотное взаимодействие между отростками фоторецепторов и микровиллями клеток пигментного эпителия, что свидетельствует о сохранении в интерфоторецепторном пространстве адгезии клеток сетчатки и пигментного эпителия, играющей принципиальную роль в осуществлении зрительной функции. Отростки большего числа фоторецепторов сохраняют целостность. Эпителиальный слой пигментных клеток не претерпевает разрушений, а упаковка клеток в нем остается более плотной, чем в контроле. Помимо этого гранулы меланина в слое пигментного эпителия располагаются более компактно на базальной стороне клеток, а также в микровиллях по сравнению с контролем, где наблюдают смещение пигментных гранул на апикальную сторону клеток, которые, в свою очередь, теряют или втягивают микровилли, о чем можно свидетельствовать по отсутствию пигмента в соответствующей области. Эти данные указывают на то, что изучаемый регуляторный пептид, выделенный из пигментного эпителия глаза, способствует стабилизации дифференцировки клеток пигментного эпителия. Следует отметить, что добавление препарата изучаемого регуляторного пептида в культуральную среду способствует увеличению жизнеспособности клеток Мюллеровской глии, а также увеличению жизнеспособности биполяров во внутреннем ядерном слое сетчатки примерно на 10% (р<0,05). Как известно, биполярные клетки играют ведущую роль в проведении зрительного сигнала от фоторецепторов к ганглиозным клеткам, кроме того, биполяры и клетки Мюллера являются потенциальным клеточным резервом при восстановительных и репаративных процессах в сетчатке, возникающих при дегенерациях различного рода. В связи с этим полученные данные приобретают дополнительную значимость в плане использования регуляторного пептида, выделенного из пигментного эпителия глаза, при нейродегенеративных заболеваниях сетчатки глаза.

Таким образом, можно отметить протекторное действие изучаемого регуляторного пептида на состояние тканей заднего отдела глаза крысы при длительном культивировании и особенно на внутренний ядерный слой сетчатки, и на зону интерфоторецепторного пространства, а также на состояние сосудистой оболочки глаза.

Пример 6.

Пациент К. 12 лет. Диагноз: Тапеторетинальная абиотрофия, 3 стадии. Острота зрения до лечения Vis ОУ 0.3 н/к, поля зрения сужены на 10 град. от точки фиксации.

На фоне курса консервативного лечения в течение 20 дней прошла курс лечения лекарственным средством, приготовленным, как описано в примере 1, инсциллировала в ОД по 1 капле 3 раза в день лекарственное средство для лечения заболеваний сетчатки и пигментного эпителия глаза, а также сосудистой оболочки глаза.

При выписке после лечения: Vis ОД 0.4 н/к, поля зрения сужены на 30 град. от точки фиксации; ОС 0.3 н/к, поля зрения сужены на 15 град. от точки фиксации. Отмечена стабильная положительная динамика состояния сетчатки ОД.

Предложенный способ позволяет использовать области пигментного эпителия сетчатки, содержащие наибольшее количество биохимически и физиологически активных белков и полипептидов, повышать процент выхода регуляторных пептидов, обладающих биологической активностью в сверхмалых дозах, выделять высокоочищенные полипептиды с низкой молекулярной массой. Полученное, таким образом, лекарственное средство способствует стабильной положительной динамике состояния сетчатки и расширению полей зрения.

Способ получения лекарственного средства для лечения заболеваний сетчатки и пигментного эпителия глаза, а также сосудистой оболочки глаза, характеризующийся тем, что выделяют из свежеэнуклеированных глаз позвоночных животных макулярную область пигментного эпителия сетчатки, промывают ее в водно-солевом физиологическом растворе, выдерживают ткань пигментного эпителия в водно-солевом растворе при 4-7°С в течение 2-4 ч, центрифугируют тканевой экстракт, собирают надосадочную жидкость, разделяют ее методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы при рН 3,5-10,0, температуре 4-6°С и напряжении 500-2000 В в течение 72-96 ч, собирают фракции основных белков при рН 8,5-9,5, удаляют из них сахарозу и амфолины методом диализа в диализных мешках с пределом пропускания 2-8 кДа в течение 10-14 дней при 4-7°С, полученный при этом раствор белка высушивают и очищают электрофорезом в 7,5-15%-ном полиакриламидном геле, с последующим элюированием низкомолекулярной фракции с Rf=0,4-0,9 деионизованной водой из геля в диализных мешках, с пределом пропускания пор 2-8 кДа в течение 7-10 дней при 4-7°С, сушкой полученного регуляторного пептида и растворением его в физиологическом водно-солевом растворе.