Способ получения системы доставки водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ и лекарственная форма на ее основе
Владельцы патента RU 2325151:
Кусков Андрей Николаевич (RU)
Штильман Михаил Исаакович (RU)
ООО "Научно-производственный центр "Амфион" (RU)
Настоящее изобретение относится к области лекарственных средств, в частности к способу получения системы доставки плохорастворимых и водонерастворимых биологически активных веществ путем их солюбилизации водорастворимыми амфифильными полимерами, состоящими, как минимум, из одного фрагмента водорастворимого карбоцепного полимера с молекулярным весом Mn=1000-20000 и, как минимум, одной концевой гидрофобной группы, представляющей собой один или два алифатических радикала с числом атомов углерода в углеродной цепи 6-25, методом самоассоциации дифильных веществ в водных средах при критической концентрации их мицелообразования (ККМ) или критической концентрации агрегации (ККА) с образованием частиц в виде сферических частиц, имеющих размер от 5 до 1500 нм. Кроме того, изобретение относится к лекарственной форме доставки водонерастворимых и плохорастворимых лекарственных средств, полученной указанным способом. Изобретение обеспечивает повышение водосовместимости плохорастворимых и нерастворимых в воде биологически активных веществ. 2 н. и 41 з.п. ф-лы, 2 табл.
Изобретение относится к области фармакологии, а именно к способам получения системы доставки (лекарственным формам доставки) биологически активных веществ в виде наноразмерных макромолекулярных носителей на основе амфифильных полимеров, в которых инкапсулированы различные количества биологически активных веществ, в том числе гидрофобные, плохо- или нерастворимые в воде лекарственные вещества, а также к самим лекарственным формам доставки водонерастворимых и плохорастворимых лекарственных средств.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Доставка лекарственных препаратов к органам-мишеням в организме человека является одной из основных проблем химиотерапии. Известны способы получения орального применения липосом, включающих диэфирфосфатидилхолин/холестирин в пропорции 7:1. (DESHMUCK D.S. Life Sciences, 1981 г. 28, стр.239-242). Известная система доставки обеспечила желудочно-кишечную защиту инкапсулированного пептида, но не обеспечила его происхождения через кишечный барьер. Это объясняется слишком большим размером липосом, неустойчивостью структуры и проникновением активного вещества сквозь липосомную среду.
В настоящее время выделилось направление получения наночастиц, состоящих, в частности, из внутреннего ядра, образованного структурированными полисахаридами с привитыми на их наружной части жирными кислотами и покрытыми слоем из фосфолипидов. (I. De Miguel «Biochimica et Biophysica Acta, 1995 г., 1237, стр.48-49).
В качестве ближайшего аналога, по мнению заявителей, может служить техническое решение, известное из WO 03077882 А2 25.09.2003 Д1. В Д1 раскрывается способ получения мицелл или лиофилизированных нанодисперсий гидрофобных лекарственных средств, заключенных в амфифильный сополимер, имеющий гидрофильный и гидрофобный полимерные блоки, при этом полученные частицы, включающие лекарственное средство имеют размер менее 1 мкм.
Общим существенным признаком известного и заявляемого технических решений является их форма - наночастицы, содержащие биоразлагаемый полимер.
В качестве недостатка известной системы доставки следует отметить тот факт, что она не способствует растворению плохо- или водонерастворимым лекарственных средств в организме человека, а следовательно, невозможно на ее основе создать лекарственную форму доставки плохо- или водонерастворимых лекарственных средств. Назначение известной системы ограничивается только целенаправленной доставкой лекарственного средства с контролируемым его выделением.
Задачей, на которую направлено данное изобретение, является создание лекарственной формы доставки плохо- и водонерастворимых лекарственных средств к органам-мишеням, и, как следствие, повышение эффективности лечения ряда заболеваний.
В качестве технического результата, достигаемого данным изобретением, следует отметить возможность повышения водосовместимости плохорастворимых и нерастворимых в воде биологически активных веществ, что позволило создать новые высокоэффективные водорастворимые формы биологически активных веществ для инъекционного, перорального и другого применения.
При этом использование таких форм биологически активных веществ позволяет обеспечить длительное действие препарата, его контролируемое выделение, использовать его различными путями введения, обеспечивает поступление активного вещества в оптимальных дозах, снижая возможность передозировки и проявления побочной токсичности.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ получения системы доставки (лекарственной формы доставки) плохорастворимых и малорастворимых биологически активных веществ путем их лиофилизации водорастворимыми амфифильными полимерами методом самоассоциации дифильных веществ при концентрациях выше их критической концентрации мицеллообразования (ККМ) или критической концентрации агрегации (ККА) в водных средах с образованием частиц в виде сферических наноразмерных структур, при этом векторы гидрофобных фрагментов дифильных молекул обращены внутрь частиц, образуя внутреннее ядро, которое содержит лекарственное средство, а гидрофильные полимерные цепи образуют водорастворимую оболочку данных частиц.
Дополнительно осуществляют лиофилизацию биологически активных веществ (это могут быть как органические, так и неорганические соединения) плохо- или водонерастворимых в воде за счет липосом, состоящих из липидов, которые образуют при ассоциации дополнительное векторное окружение вокруг ядра - липосомальную мембрану. Липосомальная мембрана из липидов модифицирована амфифильными полимерами, состоящими, как минимум, из одного фрагмента водорастворимого карбоцепного полимера, и, как минимум, одной концевой гидрофобной группы.
В качестве амфифильного полимера используют макромолекулярную структуру, состоящую, как минимум, из одного фрагмента водорастворимого карбоцепного полимера с включением, как минимум, одной концевой гидрофобной группы.
В качестве фрагмента водорастворимого карбоцепного полимера используют фрагмент с молекулярным весом Mn=1000-20000. А в качестве концевой гидрофобной группы предпочтительно выбирают группу, включающую один или два алифатических радикала с числом атомов углерода в углеродной цепи 6-25.
В качестве водорастворимого карбоцепного полимера используют, например, поли-N-винилпирролидон, поливиниловый спирт, полиакриламид, поли-N-диалкилакриламид, поли-N-изопропилакриламид, поли-N-(2-гидроксипропил)метакриламид, соли ненасыщенных карбоновых кислот.
Система доставки лекарственных средств - лекарственная форма, (полученная по описанному выше способу) представляет собой сферические наночастицы, содержащие ядро, в которое включено плохо или водонерастворимое биологически активное вещество (лекарственное средство), окруженное векторами гидрофобных фрагментов дифильных молекул амфифильных полимеров, обращенных внутрь к ядру, а гидрофильные полимерные цепи амфифильных полимеров образуют водорастворимую оболочку данных частиц.
С целью дополнительной лиофилизации биологически активных веществ (это могут быть как органические, так и неорганические соединения), плохо- или водонерастворимых в воде, наночастица содержит векторное окружение вокруг ядра из липидов - липосомальную мембрану. Липосомальная мембрана модифицирована амфифильными полимерами, состоящими, как минимум, из одного фрагмента водорастворимого карбоцепного полимера и, как минимум, одной концевой гидрофобной группы.
В качестве амфифильного полимера система содержит макромолекулярную структуру, состоящую, как минимум, из одного фрагмента водорастворимого карбоцепного полимера с включением, как минимум, одной концевой гидрофобной группы.
В качестве фрагмента водорастворимого карбоцепного полимера система предпочтительно содержит фрагмент с молекулярным весом Mn=1000-20000. А в качестве концевой гидрофобной группы система содержит группу, включающую один или два алифатических радикала с числом атомов углерода в углеродной цепи 6-25.
В качестве водорастворимого карбоцепного полимера система может содержать, например, поли-N-винилпирролидон, поливиниловый спирт, полиакриламид, поли-N-диалкилакриламид, поли-N-изопропилакриламид, поли-N-(2-гидроксипропил)метакриламид, соли ненасыщенных карбоновых кислот.
Общие формулы предлагаемых амфифильных полимеров могут быть представлены следующим образом:
Для всех амфифильных полимеров R - длинноцепная, алифатическая гидрофобная группа общего строения от -С6Н13 до -С25Н51:
Среднечисловая молекулярная масса (Мп) гидрофильной водорастворимой части полиакриламида, поли-М-изопропилакриламида, поли-2-гидроксипропилметакриламида и поли-N-винилпирролидона для разных образцов варьируется от 1000 до 20000.
Получение полимерных наночастиц, содержащих биологически активные вещества
Полимерные наночастицы были получены различными способами, среди которых основными являются: метод прямого растворения (диспергирования), диализный метод и эмульсионный метод (нанопреципитация). Для всех методов полимер брали в таких количествах, чтобы в конечном растворе его концентрация была больше критической концентрации мицеллообразования или критической концентрации агрегации. Количество включаемого лекарственного вещества было от 0.1 до 60 весовых %.
1. Метод прямого растворения
а) Расчетное количество амфифильного полимера и лекарственного вещества растворяли в бидистиллированной обеспыленной воде или в 10 физиологическом растворе (0.15М NaCl, pH ˜7.4). Раствор перемешивали на
качалке KS 500 "Labortechnik" (Германия) (также для перемешивания в некоторых экспериментах использовали качалку Вортекс) при 100 об/мин от 2 до 24 часов.
б) Расчетное количество амфифильного полимера и лекарственного вещества растворяли при нагревании до 40-50°С в бидистиллированной обеспыленной воде или в физиологическом растворе (0.15 М NaCl, pH ˜7.4) в течение 2-6 часов. В случае наличия осадка невключенного лекарственного вещества растворы фильтровали на 0.4 или 0.2 мкм фильтрах Миллипор.
2. Диализный метод
Расчетное количество амфифильного полимера и лекарственного вещества растворяли в органическом растворителе (например, ДМСО или ДМФА), а затем диализовали относительно 4 л воды или физиологического раствора в течение 24,48 или 72 часов, используя диализные мешки с пределом фильтрации MW 600-20000 ("Sigma"). Полученный в диализном мешке водный раствор содержал частицы с включенным биологически активным веществом.
3. Эмульсионный метод
а) Предварительно готовили раствор гидрофобного лекарственного вещества в растворителе, в котором это вещество растворяется (этилацетат, ДМСО, ДМФА, этиловый спирт). В этот раствор добавляли расчетное количество амфифильного полимера и перемешивали при нагревании (30-40°С) в течение 20-40 минут. После этого раствор выливали в бидистиллированную обеспыленную воду. Полученную эмульсию интенсивно перемешивали 40-60 минут на вортексе и подвергали воздействию ультразвуком с частотой 22 кГц в течение 5-20 минут, непрерывно охлаждая ледяной водой (ультразвуковой диспергатор 4710 (Cole-Parmer Instruments, США)). Органический растворитель отгоняли на роторном испарителе.
б) Расчетное количество амфифильного полимера и лекарственного вещества растворяли в этилацетате (или метиленхлориде) при перемешивании и нагревании (30-40°С). Затем к полученному раствору добавляли бидистиллированную воду. Полученную эмульсию интенсивно перемешивали 20-30 минут и ультраозвучивали 1-10 минут при мощности 40 Вт и импульсном режиме (1 сек через 1 сек) на приборе "VibraCell" (США) или 1-10 мнут при максимальной мощности на приборе "УЗДН - А" (Россия). Органический растворитель отгоняли на роторном растворители.
Полученные полимерные наночастицы имеют устойчивую сферическую форму, узкое распределение по размерам для каждого образца полимера (средний размер частиц для разных образцов полимеров от 5 до 1500 нм).
В качестве амфифильных полимеров использовали предпочтительно акриламид, N-изопропилакриламид, 2-гидроксипропилметакриламид и N-винилпирролидон.
Таким образом, были получены водорастворимые препараты в виде наночастиц следующих плохо растворимых гидрофобных лекарственных веществ:
- Снотворных и успокаивающих лекарственных веществ: нитразепама, флунитрозипама, барбитала, бромизовала.
- Противосу дорожных лекарственных веществ: бензоала, гексамидина, дифенина, клоназепама.
- Транквилизаторов и антидепрессантов: сибазона, феназипама, пиразидола, флуоксетина.
- Лекарственных веществ для лечения паркинсонизма: циклодола, леводона, глудантана.
- Анальгезирующих (болеутоляющих) лекарственных веществ: амидопирина, фенацетина, парацетамола, ибупрофена.
- Противовоспалительных лекарственных веществ: диклофенака, индометацина, кортизона.
- Сердечно-сосудистых лекарственных веществ: дигитоксина, кавинтона, теофиллина, форидона.
- Гормональных лекарственных веществ: тиреоидина, эстрона, метилтестостерона, силаболина.
- Витаминов и родственных веществ: бенфотиамина, рибофлавина, рутина.
- Ферментных лекарственных веществ: лизоамидазы, панкреатина, солизима.
- Лекарственных веществ, стимулирующих или регулирующих метаболические процессы: фепромарона, дипиридамола, ловастатина.
- Противомикробных, противовирусных и противопаразитарных лекарственных веществ: ампициллина, тетрациклина, рифампицина, левом ицетина, стрептоцида, бонафтона, метисазона.
- Противогрибковых лекарственных веществ: нистатина, амфотерицина В, гризеофульвина.
- Противоопухолевых лекарственных веществ: доксорубицина, метотрексата, цисплатина, эпирубицина, реумицина, хлодитана.
- Диагностических лекарственных веществ: йодамида, билигноста, пентагастрина.
- Биологически активных пептидов и белков: ДНК, инсулина, тимоптина, грамицидина.
Получение липосом, модифицированных амфифильными полимерами и содержащих биологически активные вещества
Способ солюбилизации биологически активных веществ с помощью модифицированных липосом основан на процессах самоассоциации дифильных веществ в водных средах, которые придают всей системе хорошую водосовместимость (растворимость в водных средах).
Для получения липосом, модифицированных амфифильными полимерами и содержащих биологически активные вещества, дополнительный липосомальный вектор формируют из липидов, например, из смеси фосфатидилхолин / холестерин (мольное соотношение 7:3) или фосфатидилхолин / холестерин / кардиолипин (мольное соотношение 7:3:1). Количество вводимого в липосомы модифицирующего амфифильного полимера составляло от 0.1 до 30 весовых %. Количество включаемого лекарственного вещества было от 0.1 до 60 весовых %.
Формирование модифицированных липосом, с включенными биологически активными веществами, проводили с использованием двух методик.
Пример №1. В первом случае липосом-формирующие компоненты, а также амфифильный полимер и биологически активное вещество в расчетных количествах растворяли в хлороформе при температуре 20°С. Полученный раствор вакуумировали в среде азота или аргона, полученную пленку замораживали. Затем пленку диспергировали в фосфатном буфере рН 7,4 0,01 М при 4°С. Диализат пропускали через фильтры Nucleopore (Spectrum Laboratories Inc.) с размером пор 0.6, 0.4, 0.2 и 0.1 мкм. При этом выделенные фракции липосом содержали частицы с размерами 100-200 нм.
Пример №2. Во втором случае липосом-формирующие компоненты, а также расчетные количества амфифильного полимера и лекарственного вещества растворяли в этаноле, а затем раствор упаривали на роторном испарителе Rotavapor (Buchi, Швейцария) при 35°С. Полученную пленку диспергировали в 0,01 М фосфатном буфере рН 9,2. Полученную эмульсию подвергали воздействию ультразвуком с частотой 22 кГц в течение 300-400 секунд, непрерывно охлаждая ледяной водой (ультразвуковой диспергатор 4710 (Cole-Parmer Instruments, США)). Фракцию липосом с размерами 100-200 нм выделяли с помощью гельпроникающей хроматографии с использованием сефадекса G-25.
С использованием этих методик в модифицированные амфифильными полимерами липосомы были включены следующие лекарственные вещества:
- Снотворные и успокаивающие лекарственные вещества: нитразепам, флунитрозипам, барбитал, бромизовал.
- Противосудорожные лекарственные вещества: бензоал, гексамидин, дифенин, клоназепам.
- Транквилизаторы и антидепрессанты: сибазон, феназипам, пиразидол, флуоксетин.
- Лекарственные вещества для лечения паркинсонизма: циклодол, леводон, глудантан.
- Анальгезирующие (болеутоляющие) лекарственные вещества: амидопирин, фенацетин, парацетамол, ибупрофен.
- Противовоспалительные лекарственные вещества: диклофенак, индометацин, кортизон.
- Сердечно-сосудистые лекарственные вещества: дигитоксин, кавинтон, теофиллин, форидон.
- Гормональные лекарственные вещества: тиреоидин, эстрон, метилтестостерон, силаболин.
- Витамины и родственные вещества: бенфотиамин, рибофлавин, рутин.
- Ферментные лекарственные вещества: лизоамидаза, панкреатин, солизим.
- Лекарственные вещества, стимулирующие или регулирующие метаболические процессы: фепромарон, дипиридамол, ловастатин.
- Противомикробные, противовирусные и противопаразитарные лекарственные вещества: ампициллин, тетрациклин, рифампицин, левомицетин, стрептоцид, бонафтон, метисазон.
- Противогрибковые лекарственные вещества: нистатин, амфотерицин В, гризеофульвин.
- Противоопухолевые лекарственные вещества: доксорубицин, метотрексат, цисплатин, эпирубицин, реумицин, хлодитан.
- Диагностические лекарственные вещества: йодамид, билигност, пентагастрин.
- Биологически активные пептиды и белки: ДНК, инсулин, тимоптин, грамицидин.
Для получения водорастворимых форм биологически активных веществ в виде порошков для приготовления растворов растворы модифицированных липосом и/или полимерных частиц сушили с использованием лиофильной сушки или сушки в кипящем слое.
Для получения таблетированных форм биологически активных веществ полученные порошки подвергали прессованию.
1) Включение плохорастворимых и нерастворимых в воде веществ в полимерные наночастицы проводили с использованием в качестве модельных липофильных веществ водонерастворимых флуоресцентных красителей (пирен, перилен). Для этого, аликвоты содержащие 100 мкл пирена (перилена) в метаноле (10 мг/мл), были высушены под вакуумом. 1,8 мл физиологического раствора, содержащего 0,2% азида натрия, были добавлены к каждой пробирке с высушенным пиреном (периленом). Затем в пробирки добавляли 200 мкл последовательно разбавленных (10-4-10-10 М) образцов различных амфифильных полимеров и перемешивали сутки при комнатной температуре. Далее образцы фильтровали через 0,4 мкм фильтры Millipore для того, чтобы удалить остатки несолюбилизированного пирена. Интенсивность флуоресценции солюбилизированного пирена была измерена при длине волны возбуждения 339 нм и длине волны эмиссии 385 нм, используя люминесцентный спектрометр (Perkin Elmer LS-50B, U.K.). Интенсивность флуоресценции напрямую зависела от концентрации включенного в наночастицы красителя (чем больше иммобилизированного пирена или перилена, тем выше интенсивность флуоресценции). По полученным данным строили калибровочный график для каждого из красителей, по которому в дальнейшем определяли концентрацию иммобилизированных липофильных агентов.
2) Включение амфотерицина В в полимерные наночастицы. Предварительно готовили раствор амфотерицина В в этилацетате (0,1-5 мг/мл). 5 мг амфифильного полимера растворяли в 1 мл этилацетата, содержащего амфотерицин В при перемешивании и нагревании (30-40°С). Затем добавляли 5 мл дистиллированной воды. Полученную эмульсию интенсивно перемешивали на вортексе 5 минут и ультраозвучивали в течение 1 мин. Органический растворитель отгоняли на роторном испарителе. Полученную суспензию наночастиц с включенным амфотерицином В хранили в защищенном от света месте.
Количественное определение амфотерицина В спектрофотометрическим методом. Концентрацию амфотерицина В в наночастицах в водном растворе определяли по калибровочному графику на спектрофотометре "Shimadzu UV -265 FW" (Япония) при длине волны 405 нм. Для построения калибровочного графика приготовляли серию растворов неиммобилизированного амфотерицина В в метаноле различной концентрации (от 0,01 до 0,1 мг/мл). Затем измеряли поглощение растворами наночастиц с включенным антибиотиком и по калибровочному графику находили концентрацию амфотерицина В в наночастицах.
Эффективность противогрибкового действия включенного в наночастицы амфотерицина В in vitro. Была изучена прямая противогрибковая активность иммобилизированного амфотерицина В (AmphPol-AmB) in vitro и сопоставлена активность новых форм этого антибиотика с активностью обычного амфотерицина В (АтВ). Противогрибковая активность препаратов определяли против патогенных штаммов дрожжевых грибов (Candida spp. - C.albicans и C.tropicalis) и мицелиальных грибов (Aspergillus spp. и Fusarium spp.), которые были выделены из крови или спинномозговой жидкости онкологических больных.
Выделенные культуры инкубировали при температуре 35°С в течение 24-48 часов в тканевой культуральной среде PRMI-1640, содержащей различные количества иммобилизированного на полимерных наночастицах или обычного амфотерицина В, растворенных в диметилсульфоксиде. Концентрация препарата, необходимая для подавления роста штамма каждого вида дрожжевых грибов на 90% (MIC90), оценивалась визуально. Образцы, в которых не было роста, культивировались далее с использованием метода последовательных разведении для того, чтобы определить минимальную 90% фунгицидную концентрацию для штамма каждого вида (MFC90). Полученные результаты показали, что минимальная ингибиторная концентрация наночастиц с антибиотиком ниже такой концентрации свободного препарата, и что фунгицидная активность новых наноразмерных форм амфотерицина В несколько выше активности простого фунгицида (например против грибов штамма Fusarium spp.значение MIC90 для препарта AmphPol-AmB равно 2,2 мкг/мл, а для AmB MIC90=2,6 мкг/мл).
Распределение полимерных частиц с амфотерицином В in vivo изучали при введении наночастиц, содержащих водную флюоресцирующую краску сульфородамин, зараженным Candida albicans мышам. Через день после заражения мышам вводили либо наночастицы с амфотерицином В и краской (S-AmphPol-AmB), либо идентичные наночастицы с краской, но без лекарства (S-AmphPol), либо наночастицы с амфотерицином В и без краски (AmphPol-AmB). Через 17 часов после введения мышей забивали. Почки замораживали, подвергали секции и исследовали либо непосредственно на локализацию красной флюоресценции, либо фиксировали и окрашивали, чтобы определить места грибковой инфекции. В почках мышей, получавших S-AmphPol-AmB и S-AmphPol, выявлялось яркое красное флюоресцирующее свечение в областях грибковой инфекции. В почках мышей, получавших AmphPol-AmB без краски, была только слабая диффузная аутофлюоресценция. Это говорит о том, что полимерные наночастицы с амфотерицином В или без него попадают в места инфекции.
Легочный аспергиллез у кроликов. При изучении модели первичного легочного аспергиллеза кроликам с гранулоцитопенией внутривенно вводили одну из лекарственных форм. Максимально переносимая доза наночастиц с амфотерицином В составила 6 мг/кг/день, а обычного амфотерицина - 1.8 мг/кг/день. Выживаемость после заражения была значительно больше в группе, получавшей наночастицы с амфотерицином В, и не возрастала в группе амфотерицин. Частота геморрагических осложнений в группе животных, получавших иммобилизированный антибиотик, также была меньше. Из этого следует, что при первичном легочном аспергиллезе новая наноразмерная форма амфотерицина В значительно повышает выживаемость, уменьшает частоту повреждений тканей и микробиологической инфекции.
Пример №1.
Включение Доксорубицина (Докс) в наночастицы на основе амфифильного производного полиакриламида молекулярной массы 3000 с концевой додецильной гидрофобной группой (ПАА-ДД 3000) методом прямого растворения.
Для солюбилизации доксорубицина брали 1 мл раствора амфифильного полимера ПАА-ДД 3000 в фосфатном буфере с концентрацией 0,5 мг/мл, к которому добавляли доксорубицин в концентрации 0,1 мг/мл. Полученный раствор перемешивали на качалке KS 500 "Labortechnik" (Германия) при 100 об/мин и 50°С в течение 16 часов. Затем раствор ультраозвучивали при помощи ультразвукового диспергатора Sonopuls (Bandelin electronic, Германия) для того, чтобы избежать агрегации мицеллярных наночастиц в более крупные полимерные агрегаты из-за взаимодействия полимерных цепей. Несолюбилизованный доксорубицин отделяли центрифугированием на микроцентрифуге Denville 260D (США). Количество включенного в наноразмерные полимерные агрегаты биологически активного вещества вычисляли по спектрам флуоресценции доксорубицина. Эффективность загрузки в данном случае составила 18%. Средний диаметр образованных частиц с включенным доксорубицином, определенный методом динамического светорассеяния, составил 78±6 нм.
Пример №2.
Включение Индометацина (Инд) в наночастицы на основе амфифильного производного поли-N-изопропилакриламида молекулярной массы 5500 с концевой гексадецильной гидрофобной группой (ПИПАА-ГД 5500) диализным методом.
300 мг амфифильного полимера ПИПАА-ГД 5500 растворяли в 10 мл ДМФА, после чего добавляли в полученный раствор Инд (весовое соотношение 1:1) и перемешивали в течение 6 часов на вортексе Stuart (Великобритания). Для образования наноразмерных мицеллярных частиц с включенным индометацином и удаления несолюбилизированного биологически активного вещества приготовленный раствор диализовали в течение 48 часов относительно 3 л бидистиллированной воды, используя диализные мембраны из восстановленной целлюлозы с размером пор 1,5 кДа (Sigma, США). Полученный водный раствор наночастиц обрабатывали ультразвуком с помощью ультразвукового диспергатора Sonopuls (Bandelin electronic, Германия) и центрифугировали на микроцентрифуге Denville 260D (США), чтобы удалить из раствора остатки невключенного индометацина и размельчить более крупные полимерные агрегаты. Эффективность загрузки, определенная по спектрам флуоресценции индометацина, составила 36%. Размер получившихся полимерных частиц с включенным Инд, определенный методом динамического светорассеяния составил 42±4 нм.
Пример №3.
Включение Ампициллина (Амп) в наночастицы на основе амфифильного производного поли-N-винилпирролидона молекулярной массы 4000 с концевой октадецильной гидрофобной группой (ПВП-ОД 4000) эмульсионным методом.
200 мг полимера ПВП-ОД 4000 и 100 мг ампициллина (Амп) растворяли в 8 мл хлороформа. Полученный раствор интенсивно перемешивали 4 часа при нагревании до 40°С, после чего приливали к 40 мл бидистиллированной воды. Далее эмульсию интенсивно перемешивали и многократно обрабатывали ультразвуком в течение 1 минуты при максимальной мощности на ультразвуковом диспергаторе Sonopuls (Bandelin electronic, Германия). После этого органический растворитель и часть воды отгоняли на роторном испарителе Rotadest (MTA Kutesz, Венгрия), доводя объем водного раствора полимерных наночастиц с включенным Амп до 10 мл. Полученный раствор центрифугировали в течение 8 минут при скорости вращения 6500 об./мин на микроцентрифуге Denville 260D (США) и надосадочную жидкость фильтровали через мембраны Durapore с диаметром пор 0,15 мкм (Millipore Corp., Ирландия) для удаления несолюбилизованного Амп. Эффективность включения, определенная по спектрам флуоресценции ампициллина составила 55%. Размер полученных наноразмерных полимерных частиц с включенным Амп, определенный методом динамического светорассеяния, составил 22±2 нм.
Пример №4.
Включение Нистатина (Нис) в липосомы, модифицированные амфифильным полимером акриламида с молекулярной массой полимерного фрагмента Mn=4700 и одной концевой гексадецильной группой (ПАА-ГД 4700).
Смесь липидов кардиолипина и яичного лецитина (мольной соотношение 7:3) растворяли в 15 мл смеси хлороформ/метанол (2:1 об./об.) до общей концентрации липидов в растворе 15 мг/мл. Затем к раствору добавляли 8 мольн. % (от количества липидов) амфифильного полимера ПАА-ГД 4700 и 200 мг Нис. Полученную смесь тщательно перемешивали в 250 мл круглодонной колбе. Затем на роторном испарителе Rotovator (Buchi, Швейцария) при пониженном давлении и 35°С отгоняли органический растворитель. Процесс продолжали до полного удаления растворителя и образования однородной пленки на стенках колбы. В колбу добавляли 5 мл фосфатного буфера (рН 7,4) и тщательно перемешивали в течение 40 минут до образования гомогенной молочно-белой суспензии. Суспензию выдерживали 4 часа для завершения процесса набухания системы. Затем полученную суспензию диспергировали, воздействуя ультразвуком (ультразвуковой диспергатор Sonopuls (Bandelin electronic, Германия)) и охлаждая ледяной водой. Выделение фракции липосом с размером 100-200 нм и удаление несолюбилизированного Нис осуществляли фильтрованием смеси через фильтры Nucleopore (Spectrum Laboratories Inc., США) с размером пор 0,2 мкм. Размер полученных липосом определяли методом динамического рассеяния. Эффективность включения Нис, определенная флуориметрическим методом, составила 72%.
Пример №5.
Включение Амфотерицина В (Амф) в липосомы, модифицированные амфифильным полимером N-винилпирролидона с молекулярной массой полимерного фрагмента Mn=3300 и одной концевой октадецильной группой (ПВП-ОД 3300).
Смесь липидов фосфатидилхолина, холестерина и кардиолипина (мольное соотношение 7:3:1) растворяли в 20 мл хлороформа до общей концентрации липидов в растворе 20 мг/мл. Затем в раствор вводили 12 мольн.% от количества липидов амфифильного полимера ПВП-ОД 3300 и 250 мг Амф. Полученную смесь тщательно перемешивали в 250 мл круглодонной колбе и сушили под вакуумом в среде аргона при 45°С в течение 8 часов до полного удаления растворителя и образования однородной тонкой пленки. Затем полученную пленку из липидов, полимера и Амф растворяли в 8 мл фосфатного буфера (рН 7,4), перемешивали и полученную суспензию диализовали в течение 16 часов при охлаждении до 4°С относительно 3 л буферного раствора. Полученные модифицированные липосомы с включенным Амф отделяли от неиммобилизованного антибиотика, используя колоночную хроматографию (Sephadex G-25; 0,8×5,2 см). Размер полученных липосом, определенный методом динамического светорассеяния, составил 120±10 нм. Эффективность включения Амф в модифицированные амфифильным полимером липосомы, определенная флуориметрическим методом, составила 82%.
| Таблица 1. Наноразмерные формы биологически активных веществ на основе новых амфифильных полимеров, содержащих гидрофильный фрагмент водорастворимого полимера и гидрофобный длинноцепной алифатический фрагмент. | |||||||
| № | Полимерный гидрофильный фрагмент | Алифатический гидрофобный фрагмент | Mn* | БАВ | Способ включения БАВ | Эффективность включения БАВ (%) | Средний размер частиц (вода, 25°С (нм) |
| 1 | ПВП | ОКТ2 | 6800 | доксорубицин | диализ | 14 | 65±6 |
| 2 | ПВП | ДД | 5100 | нистатин | растворение | 28 | 160±10 |
| 3 | ПВП | ГД | 3500 | индометацин | диализ | 43 | 70±6 |
| 4 | ПВП | ОД | 4000 | ампициллин | эмульсификация | 55 | 22±2 |
| 5 | ПАА | ГЕК2 | 8000 | диклофенак | диализ | 10 | 86±8 |
| 6 | ПАА | ДД | 3000 | доксорубицин | растворение | 18 | 78±6 |
| 7 | ПАА | ГД | 2300 | индометацин | растворение | 15 | 150±12 |
| 8 | ПАА | ОД | 5200 | амфотерицин | эмульсификация | 48 | 28±4 |
| 9 | ПИПАА | ГЕК2 | 7000 | доксорубицин | диализ | 8 | 60±8 |
| 10 | ПИПАА | ОКТ2 | 6400 | диклофенак | растворение | 12 | 110±10 |
| 11 | ПИПАА | ДД | 4300 | нистатин | эмульсификация | 17 | 36±3 |
| 12 | ПИПАА | ГД | 5500 | индометацин | диализ | 36 | 42±4 |
| 13 | ПГПМА | ОКТ | 2500 | доксорубицин | эмульсификация | 8 | 52±5 |
| 14 | ПГПМА | ДД | 4200 | ампициллин | эмульсификация | 16 | 40±4 |
| 15 | ПГПМА | ГД | 3600 | индометацин | эмульсификация | 34 | 32±2 |
| 16 | ПГПМА | ОД | 4800 | амфотерицин | растворение | 25 | 140±12 |
| * Молекулярная масса полимеров определена методом паровой осмометрии на осмометре Knauer (Германия). |
Номенклатура полимеров и алифатических радикалов:
ПВП - поли-N-винилпирролидон
ПАА - полиакриламид
ПИПАА - поли-N-изопропилакриламид
ПГПМА - поли-N-(2-гидроксипропил) метакриламида
Гек2 - дигексил
Окт2 - диоктил
Окт - октил
ДД - додецил
ГД - гексадецил
ОД - окдадецил
| Таблица 2. Липосомальные формы биологически активных веществ, модифицированные амфифильными полимерами, содержащими гидрофильный фрагмент водорастворимого полимера и гидрофобный длинноцепной алифатический фрагмент. | |||||||
| № | Состав липосом | Полимерный гидрофильный фрагмент | Алифатический гидрофобный фрагмент | Mn* | Количество модиф-щего полимера (мол. %) | БАВ | Эффективность включения БАВ (%) |
| 1 | КЛ/ЯЛ | ПВП | ГД | 6500 | 5 | нистатин | 80 |
| 7/3 | |||||||
| 2 | ФХ/Х/КЛ | ПВП | ОД | 3300 | 12 | амфотерицин | 82 |
| 7/3/1 | |||||||
| 3 | ФЭА/Х/ФС/ТО | ПВП | ДД | 4800 | 10 | индометацин | 70 |
| 4,5/4,5/1/1 | |||||||
| 4 | ФХ/Х/ФГ/ТК | ПВП | ОД | 5100 | 15 | доксорубицин | 86 |
| 5/4/1/1 | |||||||
| 5 | КЛ/ЯЛ | ПАА | ГД | 4700 | 8 | нистатин | 72 |
| 7/3 | |||||||
| 6 | ФХ/ХС/КЛ | ПАА | ОД | 2700 | 10 | амфотерицин | 76 |
| 7/3/1 | |||||||
| 7 | КЛ/ЯЛ | ПИПАА | ДД | 7800 | 6 | нистатин | 66 |
| 7/3 | |||||||
| 8 | ФХ/ХС/КЛ | ПИПАА | ОД | 4300 | 10 | амфотерицин | 75 |
| 7/3/1 | |||||||
| 9 | КЛ/ЯЛ | ПГПМА | ГД | 2200 | 4 | амфотерицин | 80 |
| 7/3 | |||||||
| 10 | ФХ/ХС/КЛ | ПГПМА | ОД | 4500 | 12 | нистатин | 84 |
| 7/3/1 | |||||||
| * Молекулярная масса полимеров определена методом паровой осмометрии на осмометре Knauer (Германия). |
Номенклатура полимеров, алифатических радикалов и липидов:
ПВП - поли-N-винилпирролидон
ПАА - полиакриламид
ПИПАА - поли-N-изопропилакриламид
ПГПМА - поли-N-(2-гидроксипропил) метакриламида
ДД - додецил
ГД - гексадецил
ОД - окдадецил
КЛ - кардиолипин
ЯЛ - яичный лецитин
ФХ - фосфатидилхолин
X - холестерин
ФЭА - фосфатидилэтаноламин
ФС - фосфатидилсерин
ТО - триолеин
ФГ - фосфатидилглицерол
ТК - триоктаноил
1. Способ получения системы доставки (лекарственной формы) плохорастворимых и водонерастворимых биологически активных веществ путем их солюбилизации водорастворимыми амфифильными полимерами, состоящими, как минимум, из одного фрагмента водорастворимого карбоцепного полимера с молекулярным весом Mn=1000-20000, и, как минимум, одной концевой гидрофобной группы, представляющей собой один или два алифатических радикала с числом атомов углерода в углеродной цепи 6-25, методом самоассоциации дифильных веществ в водных средах при критической концентрации их мицелообразования (ККМ) или критической концентрации агрегации (ККА) с образованием частиц в виде сферических частиц, имеющих размер от 5 до 1500 нм, при этом векторы гидрофобных фрагментов дифильных молекул полимера обращены внутрь частиц, образуя внутреннее ядро, которое содержит лекарственное средство, а гидрофильные полимерные цепи образуют водорастворимую оболочку данных частиц.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют солюбилизацию биологически активных веществ липидами, которые образуют липосомальную мембрану.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что липосомальная мембрана модифицирована амфифильными полимерами, состоящими, как минимум, из одного фрагмента водорастворимого карбоцепного полимера, и, как минимум, одной концевой гидрофобной группы.
4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что в качестве водорастворимого карбоцепного полимера используют, например, поли-N- винилпирролидон, поливиниловый спирт, полиакриламид, поли-N- диалкилакриламид, поли-N-изопропилакриламид, поли-N-(2-гидроксипропил) метакриламид, соли ненасыщенных карбоновых кислот.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ используют снотворные и успокаивающие лекарственные вещества, например, нитразепам, флунитрозипам, барбитал, бромизовал.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ используют противосудорожные лекарственные вещества, например, бензоал, гексамидин, дифенин, клоназепам.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ используют транквилизаторы и антидепрессанты, например, ибазон, феназипам, пиразидол, флуоксетин.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ используют лекарственные вещества для лечения паркинсонизма, например, циклодол, леводон, глудантан.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ используют анальгезирующие лекарственные вещества, например, амидопирин, фенацетин, парацетамол, ибупрофен.
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ используют противовоспалительные лекарственные вещества, например, диклофенак, индометацин, кортизон.
11. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ используют сердечнососудистые лекарственные вещества, например, дигитоксин, кавинтон, теофиллин, форидон.
12. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ используют гормональные лекарственные вещества, например, тиреоидин, эстрон, метилтестостерон, силаболин.
13. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ используют витамины и родственные вещества, например, бенфотиамин, рибофлавин, рутин.
14. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ используют ферментные лекарственные вещества, например, лизоамидазу, панкреатин, солизим.
15. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ используют лекарственные вещества, стимулирующие или регулирующие метаболические процессы, например, фепромарон, дипиридамол, ловастатин.
16. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ используют противомикробные, противовирусные и противопаразитарные лекарственные вещества, например, ампициллин, тетрациклин, рифампицин, левомицетин, стрептоцида, бонафтон, метисазон.
17. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ используют противогрибковые лекарственные вещества, например, нистатин, амфотерицин В, гризеофульвин.
18. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ используют противоопухолевые лекарственные вещества, например, доксорубицин, метотрексат, цисплатин, эпирубицин, реумицин, хлодитан.
19. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ используют диагностические лекарственные вещества, например, йодамид, билигност, пентагастрин.
20. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ используют биологически активные пептиды и белки, например, ДНК, инсулин, тимоптин, грамицидин.
21. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно растворы модифицированных липосом и/или полимерных частиц сушат с использованием лиофильной сушки или сушки в кипящем слое для возможности получения водорастворимых форм биологически активных веществ в виде порошков.
22. Способ по п.25, отличающийся тем, что полученный порошок препаратов подвергают прессованию для получения таблетированных форм биологически активных веществ.
23. Лекарственная форма доставки водонерастворимых и плохорастворимых лекарственных средств, полученная по п.1, в виде частиц размером от 5 до 1500 нм, содержащая солюбилизированное активное вещество плохорасворимое и нерастворимое в воде и, по крайней мере, один амфифильный полимер.
24. Лекарственная форма по п.23, отличающаяся тем, что в качестве водорастворимого карбоцепного полимера содержит например, поли-N-винилпирролидон, поливиниловый спирт, полиакриламид, поли-N-диалкилакриламид, поли-N-изопропилакриламид, поли-N-(2-гидроксипропил) метакриламид, соли ненасыщенных карбоновых кислот.
25. Лекарственная форма по п.23, отличающаяся тем, что наночастицы имеют размеры от 5 до 1500 нм.
26. Лекарственная форма по п.23, отличающаяся тем, что дополнительно содержит векторный липосомальный слой из органических и неорганических соединений, который модифицирован амфифильными полимерами, состоящими, как минимум, из одного фрагмента водорастворимого карбоцепного полимера, и, как минимум, одной концевой гидрофобной группы.
27. Лекарственная форма по п.23, отличающаяся тем, что в качестве водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ содержит снотворные и успокаивающие лекарственные вещества, например, нитразепам, флунитрозипам, барбитал, бромизовал.
28. Лекарственная форма по п.23, отличающаяся тем, что в качестве водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ содержит противосудорожные лекарственные вещества, например, бензоал, гексамидин, дифенин, клоназепам.
29. Лекарственная форма по п.23, отличающаяся тем, что в качестве водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ содержит транквилизаторы и антидепрессанты, например, ибазон, феназипам, пиразидол, флуоксетин.
30. Лекарственная форма по п.23, отличающаяся тем, что в качестве водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ содержит с лекарственные вещества для лечения паркинсонизма, например, циклодол, леводон, глудантан.
31. Лекарственная форма по п.23, отличающаяся тем, что в качестве водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ содержит анальгезирующие лекарственные вещества, например, амидопирин, фенацетин, парацетамол, ибупрофен.
32. Лекарственная форма по п.23, отличающаяся тем, что в качестве водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ содержит сердечно-сосудистые лекарственные вещества, например, дигитоксин, кавинтон, теофиллин, форидон.
33. Лекарственная форма по п.23, отличающаяся тем, что в качестве водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ содержит гормональные лекарственные вещества, например, тиреоидин, эстрон, метилтестостерон, силаболин.
34. Лекарственная форма по п.23, отличающаяся тем, что в качестве водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ содержит витамины и родственные вещества, например, бенфотиамин, рибофлавин, рутин.
35. Лекарственная форма по п.23, отличающаяся тем, что в качестве водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ содержит ферментные лекарственные вещества, например, лизоамидазу, панкреатин, солизим.
36. Лекарственная форма по п.23, отличающаяся тем, что в качестве водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ содержит лекарственные вещества, стимулирующие или регулирующие метаболические процессы, например, фепромарон, дипиридамол, ловастатин.
37. Лекарственная форма по п.23, отличающаяся тем, что в качестве водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ содержит противомикробные, противовирусные и противопаразитарные лекарственные вещества, например, ампициллин, тетрациклин, рифампицин, левомицетин, стрептоцида, бонафтон, метисазон.
38. Лекарственная форма по п.23, отличающаяся тем, что в качестве водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ содержит противогрибковые лекарственные вещества, например, нистатин, амфотерицин В, гризеофульвин.
39. Лекарственная форма по п.23, отличающаяся тем, что в качестве водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ содержит противоопухолевые лекарственные вещества, например, доксорубицин, метотрексат, цисплатин, эпирубицин, реумицин, хлодитан.
40. Лекарственная форма по п.23, отличающаяся тем, что в качестве водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ содержит диагностические лекарственные вещества, например, йодамид, билигност, пентагастрин.
41. Лекарственная форма по п.23, отличающаяся тем, что в качестве водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ содержит биологически активные пептиды и белки, например, ДНК, инсулин, тимоптин, грамицидин.
42. Лекарственная форма по п.23, отличающаяся тем, что имеет порошкообразную форму.
43. Лекарственная форма по п.23, отличающаяся тем, что имеет таблетированную форму.
