Способ криоконсервирования тромбоцитов

Изобретение относится к области медицины. Способ криоконсервирования тромбоцитов осуществляют путем смешивания с криозащитным раствором в эластичной упаковке, поэтапного замораживания с выдерживанием упаковок в морозильной камере, в хладагенте в виде раствора этилового спирта, с фиксированной температурой холодовой адаптации клеток и с последующим их перемещением для замораживания в хранилище при температуре -80°С. Контроль температуры охлаждения клеток ведут на отрезке между 20 и 30 минутами, по контрольному образцу биообъекта и при резком падении температуры в течение 15-20 секунд упаковку переносят в морозильник-хранилище. Способ обеспечивает повышение сохранности клеток, прост в исполнении. 1 ил.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам консервирования тромбоцитов замораживанием, и может найти применение для терапии заболеваний, вызванных недостатком тромбоцитов.

В качестве прототипа выбран способ криоконсервирования тромбоцитов (Авт. св. №2195111, А01N 1/02) путем смешивания с криозащитным раствором в эластичной упаковке, поэтапного замораживания с выдерживанием упаковок в морозильной камере, в хладагенте в виде раствора этилового спирта, с фиксированной температурой (-22÷-25°С) холодовой адаптации в течение фиксированного (1÷25 мин) времени холодовой адаптации биообъекта и с последующим его перемещением для замораживания в хранилище при температуре -80°С. После проведенного размораживания в водяной бане количество сохранных клеток составляет 87%. Способ разработан для учреждений, которые не имеют технических средств для записи термограмм замораживаемых биообъектов, необходимых для контроля окончания холодовой адаптации замораживаемого биообъекта и своевременного его перемещения на втором этапе в морозильник-хранилище.

Использование в известном изобретении фиксированного времени холодовой адаптации тромбоцитов приводит в 2/3 случаев к снижению количества сохранных клеток. Установлено, что замораживаемая суспензия донорских тромбоцитов представлена клетками, которые отличаются друг от друга по возрасту, морфологическим, биологическим и другим характеристикам. Такие тромбоциты, являясь открытой биологической системой, проходят холодовую адаптацию в различные (оптимальные для каждой клетки и биообъекта в целом) отрезки времени, которые только в 1/3 случаев могут совпасть с фиксированным временем холодовой адаптации. Принудительное укорочение или удлинение (от оптимального) продолжительности адаптационного периода путем фиксации времени снижает количество сохранных тромбоцитов.

Технический результат - повышение сохранности тромбоцитов обеспечивается в предлагаемом способе за счет исключения фиксированного времени холодовой адаптации биообъекта, при этом контроль температуры охлаждения клеток ведут по контрольному образцу биообъекта и по резкому ее падению в виде излома кривой термограммы на отрезке между 20 и 30 мин делают вывод об окончании этапа холодовой адаптации, после чего в течение 15-20 с упаковку переносят в морозильник-хранилище для окончательного замораживания и хранения тромбоцитов при температуре -80°С.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Концентрат тромбоцитов смешивают 1:1 с гемоконсервантом Тромбокриодмац, выдерживают в нем 15-20 мин при комнатной температуре 18-20°С, после чего 60 мл суспензии клеток расфасовывают по 55-58 мл в первичные эластичные полимерные контейнеры вместимостью 300 или 500 мл до заполнения на 18,3-19,3 или 11,0-11,6%, соответственно, и контейнер для контрольного образца биообъекта вместимостью 2-10 мл. Первичный контейнер герметизируют, маркируют согласно паспортным данным замораживаемого биообъекта, помещают во вторичный герметичный эластичный полимерный пакет, затем упаковку герметизируют. В контейнер вместимостью 2-10 мл вносят 2-5 мл биообъекта (контрольный образец), маркируют и устанавливают в нем температурный датчик, который подключают к цифровому табло и прибору для записи термограммы. На первом этапе упаковку и контейнер с контрольным образцом при исходной температуре 18-20°С помещают в морозильную камеру с фиксированной температурой -28±2,0°С раствором 38-45 об.% этилового спирта 96 об.%. Охлажденные до -26÷-30°С клетки проходят фазу холодовой адаптации. Вывод об окончании этапа холодовой адаптации биообъекта делают по резкому падению температуры в виде излома кривой термограммы на отрезке между 20 и 30 мин замораживания, после чего на втором этапе в течение 15-20 с упаковку переносят в морозильник-хранилище для окончательного замораживания и хранения тромбоцитов при температуре -80°С, которую достигают за 34-51 мин. Тромбоциты, замороженные до -80°С, пригодны к использованию до 2,5 лет. Размораживание клеток производят путем погружения упаковки в 20-литровую водяную баню и интенсивного покачивания упаковки (3-4 раза/с) в ручном или автоматическом режиме при температуре 38-39°С до согревания суспензии тромбоцитов до 37°С. Сохранность размороженных тромбоцитов определяют по сохранности их морфологических и функциональных свойств. Расчет выражают в процентах в сравнении с аналогичными показателями клеток до замораживания. Высокую эффективность предлагаемого способа консервирования тромбоцитов подтверждают следующие результаты:

- количество морфологически сохранных тромбоцитов составляет от 85,0 до 96,0 (89,4±7,8)%;

- показатели функционального состояния клеток на уровне 73,0-79,0%.

Экспериментальные исследования выполнены на базе лаборатории консервирования крови и тканей ФГУ «Кировский НИИ гематологии и переливания крови Росздрава».

Показательны три примера способа криоконсервирования тромбоцитов по контрольному образцу биообъекта, различающихся по времени холодовой адаптации клеток (см. чертеж).

Пример 1. Для криоконсервирования был взят объем суспензии донорских тромбоцитов на растворе Тромбокриодмац 60 мл. В первичный эластичный контейнер «Гемакон» 300 ввели 55 мл суспензии, в результате объем контейнера заполнили на 19,3%, затем герметизировали и приклеили наклейку с паспортными данными замораживаемого биообъекта. Первичный контейнер вложили во вторичный пакет, после чего упаковку герметизировали. Оставшиеся 5 мл суспензии ввели в контейнер для контрольного образца биообъекта, затем его маркировали, установили внутрь температурный датчик ТСМ 3-02, подключили к цифровому табло и прибору ГСП 04. Скорость движения ленты самописца прибора установили 240 мм/ч. Технические средства включили в сеть 220 V. При исходной температуре 18°С после 17 мин выдержки упаковку и контейнер с контрольным образцом биообъекта поместили в морозильную камеру, заполненную раствором 38-45 об.% этилового спирта 96 об.%, предварительно охлажденного до температуры холодовой адаптации -28,0±2,0°С. Через 2 мин температура суспензии достигла 0°С. После появления на 20 мин на термограмме характерного излома кривой охлаждение биообъекта достигло -26°С, упаковку в течение 18 с переместили в морозильник-хранилище с температурой -80°С. Продолжительность второго этапа составила 41 мин (см. чертеж а).

Размораживание клеток производили путем погружения упаковки в водяную баню и интенсивного покачивания упаковки (3-4 раза/с) в ручном или автоматическом режиме при температуре 38-39°С до согревания суспензии до 37°С.

Показатели сохранности морфологических и функциональных свойств размороженных клеток по различным методам оценки свидетельствуют о высокой эффективности предлагаемого способа консервирования тромбоцитов при умеренно низких температурах:

- количество сохранных тромбоцитов составляет 85,7±6,2%;

- показатели функционального состояния клеток на уровне 79,0±4,0%.

Пример 2. 60 мл суспензии донорских тромбоцитов на растворе Тромбокриодмац расфасовали в первичный эластичный контейнер «Гемакон» 300 (58 мл суспензии) до заполнения на 18,3%, затем герметизировали и приклеили наклейку с паспортными данными замораживаемого биообъекта. Первичный контейнер вложили во вторичный эластичный пакет, после чего упаковку герметизировали. Оставшиеся 2 мл суспензии ввели в контейнер для контрольного образца биообъекта, затем его маркировали, установили внутрь температурный датчик ТСМ 3-02, подключили к цифровому табло и прибору ГСП 04. Скорость движения ленты самописца прибора установили 240 мм/ч. Технические средства включили в сеть 220 V. При исходной температуре 18°С после 17 мин выдержки упаковку и контейнер с контрольным образцом поместили в морозильную камеру, заполненную раствором 38-45 об.% этилового спирта 96 об.%, предварительно охлажденного до фиксированной температуры холодовой адаптации -28,0±2,0°С. Через 1,5 мин температура суспензии достигла 0°С. После появления на 26 мин на термограмме характерного излома кривой охлаждение биообъекта достигло -28°С, упаковку в течение 17 с переместили в морозильник-хранилище с температурой -80°С. Продолжительность второго этапа составила 34 мин (см. чертеж б).

Размораживание клеток производили путем погружения упаковки в водяную баню и интенсивного покачивания упаковки (3-4 раза/с) в ручном или автоматическом режиме при температуре 38-39°С до согревания суспензии до 37°С.

Показатели сохранности морфологических и функциональных свойств замороженных-оттаянных клеток по различным методам оценки свидетельствуют о высокой эффективности предлагаемого способа консервирования тромбоцитов при умеренно низких температурах:

- количество сохранных тромбоцитов составляет 90,3±5,1%;

- показатели функционального состояния клеток на уровне 78,7±4,5%.

Пример 3. 60 мл суспензии донорских тромбоцитов на растворе Тромбокриодмац расфасовали в первичный эластичный контейнер «Гемакон» 500 (55 мл) до заполнения на 11,0 об.% и 5 мл суспензии - в контейнер для контрольного образца биообъекта, контейнеры герметизировали, маркировали согласно паспортным данным консервируемого биообъекта, после чего первичный контейнер вложили во вторичный эластичный пакет и упаковку герметизировали. В контейнер с контрольным образцом биообъекта установили температурный датчик ТСМ 3-02, подключили к цифровому табло и прибору ГСП 04. Скорость движения ленты самописца прибора установили 240 мм/ч. Технические средства включили в сеть 220 V. При исходной температуре 18°С после 17 мин выдержки упаковку и контейнер с контрольным образцом биообъекта поместили в морозильную камеру, заполненную раствором 38-45 об.% этилового спирта 96 об.%, предварительно охлажденного до температуры холодовой адаптации -28,0±2,0°С. Через 1,3 мин температура суспензии достигла 0°С. После появления на 30 мин на термограмме характерного излома кривой охлаждение биообъекта достигло -30°С, после чего упаковку через 18 с переместили в морозильник-хранилище с температурой -80°С. Продолжительность второго этапа составила 34 мин ( см. чертеж в).

Размораживание клеток производили путем погружения упаковки в водяную баню и интенсивного покачивания упаковки (3-4 раза/с) в ручном или автоматическом режиме при температуре 38-39°С до согревания суспензии до 37°С.

Показатели сохранности морфологических и функциональных свойств замороженных-оттаянных клеток по различным методам оценки свидетельствуют о высокой эффективности предлагаемого способа консервирования тромбоцитов при умеренно низких температурах:

- количество сохранных тромбоцитов составляет 95,9±1.8%;

- показатели функционального состояния клеток на уровне 75,3±7,5%.

Предлагаемый способ обеспечивает прогнозируемые показатели сохранности 85-96% тромбоцитов.

Использование в предлагаемом способе стандартных порций криоконсервируемых суспензий тромбоцитов, фиксированной температуры холодовой адаптации и записывание термограммы охлаждения биообъекта позволяет обеспечить оптимальные режимы замораживания биообъекта и холодовой адаптации, в частности, а также прогнозировать высокий процент сохранных тромбоцитов.

Предлагаемая технология криоконсервирования тромбоцитов человека в установленных стандартах технологии предельно проста в реализации, дает стабильный положительный результат и найдет широкое применение в медицинской практике.

Способ криоконсервирования тромбоцитов путем смешивания с криозащитным раствором в эластичной упаковке, поэтапного замораживания с выдерживанием упаковок в морозильной камере в хладагенте в виде раствора этилового спирта с фиксированной температурой холодовой адаптации клеток и с последующим их перемещением для замораживания в хранилище при температуре -80°С, отличающийся тем, что контроль температуры охлаждения клеток ведут на отрезке между 20 и 30 мин, по контрольному образцу биообъекта и при резком падении температуры в виде излома кривой термограммы в течение 15-20 с упаковку переносят в морозильник-хранилище.