Способ ацилирования пептидов

Настоящее изобретение относится к способу ацилирования одной или нескольких аминогрупп пептида, который выбирают из группы, включающей экзендин-3, экзендин-4, Arg³⁴-GLP-1(7-37), Gly⁸-GLP-1(7-36)-амид, Gly⁸-GLP-1(7-37), Val⁸-GLP-1(7-36)-амид, Val⁸-GLP-1(7-37), Val⁸-Asp²²-GLP-1(7-36)-амид, Val⁸Asp²²-GLP-1(7-37), Val⁸Glu²²-GLP-1(7-36)-амид, Val⁸Glu²²-GLP-1(7-37), Val⁸Lys²²-GLP-1(7-36)-амид, Val⁸Lys²²-GLP-1(7-37), Val⁸Arg²²-GLP-1(7-36)-амид, Val⁸Arg²²-GLP-1(7-37), Val⁸His²²-GLP-1(7-36)-амид, Val⁸His²²-GLP-1(7-37), дез(В30)-инсулин человека и их аналоги, в котором реакцию ацилирования проводят в водной смеси, содержащей менее 10% мас./мас. апротонного полярного растворителя, и осуществляют взаимодействие пептида с ацилирующим агентом общей формулы I, где n равно 0-8; R¹ означает COOR⁴; R² означает липофильную часть молекулы; R³ вместе с карбоксильной группой, к которой присоединен R³, означает реакционноспособный сложный эфир или реакционноспособный N-гидроксиимидоэфир; и R⁴ выбирают из группы, включающей водород, С_1-12-алкил и бензил; в основных условиях в водной смеси, при этом ацилирующий агент добавляют к реакционной смеси в виде раствора, стабилизированного путем добавления кислоты. 16 з.п. ф-лы, 2 табл.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам ацилирования пептидов и белков. В частности, данное изобретение относится к способу введения одной или нескольких ацильных групп в пептид или белок.

Уровень техники

Многие пептиды признаны пригодными для использования в медицинской практике, причем указанные пептиды могут быть продуцированы в приемлемых клетках-хозяевах методами рекомбинантных ДНК или синтезированы хорошо известными методами синтеза пептидов. Однако нативные пептиды и их аналоги характеризуются высокой скоростью клиренса, неприемлемым для многих клинических показаний, при которых необходимо сохранение высокой концентрации пептида в плазме в течение длительного периода времени. Примеры пептидов, которые в нативной форме отличаются высоким клиренсом, включают АСТН, фактор высвобождения кортикотропина, ангиотензин, кальцитонин, инсулин, глюкагон, глюкагоноподобный пептид-1 (GLP-1), глюкагоноподобный пептид-2 (GLP-2), инсулиноподобный фактор роста 1, инсулиноподобный фактор роста 2, пептид, подавляющий выделение желудочного сока, фактор высвобождения гормона роста, пептид, активирующий гипофизарную аденилатциклазу, секретин, энтерогастрин, соматостатин, соматотропин, соматомедин, паратиреоидный гормон, тромбопоэтин, эритропоэтин, релизинг-факторы гипоталамуса, пролактин, стимулирующие гормоны щитовидной железы, эндорфины, энкефалины, вазопрессин, окситоцин, опиоиды и их аналоги, пероксид-дисмутазу, интерферон, аспарагиназу, аргиназу, аргининдезаминазу, аденозиндезаминазу и рибонуклеазу.

Установлено, что разные производные пептидов и их аналогов благоприятно влияют на скорость клиренса пептидов. Одним способом получения такого производного является введение липофильной ацильной группы в терапевтический пептид, вызывающее требуемый более продолжительный профиль действия по сравнению с неацилированным пептидом. Благодаря более редкому введению терапевтического белка улучшается соблюдение больным режима и схемы предписанного лечения и уменьшается количество вводимого пептида. Указанный способ описан в заявке WO 98/08871, в которой рассмотрено ацилирование GLP-1 и его аналогов, в заявке WO 98/08872, в которой рассмотрено ацилирование GLP-2 и его аналогов, и в заявке WO 99/43708, в которой рассмотрено ацилирование экзендина и его аналогов. Установлено, что между пептидом и ацильной группой желательно использовать моно- и дипептидные спейсеры, такие как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота. Спейсеры, включающие свободную группу карбоновой кислоты, необходимо защитить до ацилирования и затем удалить защитную группу.

В европейском патенте № 1227107 описано ацилирование ε-аминогрупп инсулина человека.

В заявке WO 00/55119 описан способ ацилирования пептидов (например, GLP-1) и новые ацилирующие агенты.

Чтобы терапевтические пептиды были экономически выгодными, важное значение имеют производственные затраты при получении пептидов, а также терапевтическая дозировка пептида. Наибольшие затраты при производстве терапевтических пептидов относятся к стадиям очистки, необходимым для отделения целевого белка от загрязняющих примесей, близко родственных целевому белку, таких как изомеры, дезамидные формы и т.д. Очистки обычно выполняют при помощи хроматографии с использованием дорогостоящих хроматографических матриц и растворителей, что уменьшает общий выход продукта.

Целью настоящего изобретения является создание эффективного и экономичного способа введения липофильных групп в пептиды при помощи спейсеров, представляющих собой α-амино-α,ω-дикарбоновую кислоту. Данный способ является более специфическим, позволяет получить более высокие выходы продукта и уменьшить образование близко родственных загрязняющих примесей. При этом достигается значительное сокращение затрат при производстве ацилированных пептидов. Более дешевые ацилированные пептиды весьма желательны для максимального увеличения числа больных, которым будет доступно лечение вышеуказанными препаратами, а также для реализации преимуществ альтернативных способов доставки, характеризующихся более низкой биодоступностью по сравнению с подкожными инъекциями, таких как чрезкожная и легочная доставка.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способу ацилирования одной или нескольких аминогрупп пептида или белка, который включает стадии:

а) осуществление взаимодействия пептида, содержащего по крайней мере одну свободную аминогруппу, с ацилирующим агентом общей формулы I

где

n равно 0-8;

R¹ означает COOR⁴;

R² означает липофильную часть молекулы;

R³ вместе с карбоксильной группой, к которой присоединен R³, означает реакционноспособный сложный эфир или реакционноспособный N-гидроксиимидоэфир; и

R⁴ выбирают из группы, включающей водород, С_1-12-алкил и бензил;

в основных условиях в водной смеси;

b) омыление сложноэфирной группы ацилированного пептида (COOR⁴) в основных условиях, если R⁴ не является водородом;

с) выделение N-ацилированного пептида;

отличающийся тем, что водная смесь, используемая на стадии а), содержит менее 10% мас./мас. апротонного полярного растворителя.

В одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению взаимодействие на стадии а) выполняют в водной смеси, содержащей менее 8% мас./мас. апротонного полярного растворителя, предпочтительно менее 5% мас./мас. апротонного полярного растворителя и еще предпочтительнее менее 3% мас./мас. апротонного полярного растворителя.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению ацилирующий агент добавляют к реакционной среде в виде твердого вещества.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению ацилирующий агент добавляют к реакционной смеси в виде раствора в апротонном полярном растворителе, который стабилизуют добавлением кислоты.

Подробное описание изобретения

Пептиды и белки

Настоящее изобретение относится к введению липофильных ацильных групп в любой пептид (или белок) для уменьшения скорости клиренса in vivo. Примеры таких пептидов и белков включают АСТН, фактор высвобождения кортикотропина, ангиотензин, кальцитонин, экзендин и его аналоги, инсулин и его аналоги, глюкагон и его аналоги, глюкагоноподобный пептид-1 и его аналоги, глюкагоноподобный пептид-2 и его аналоги, инсулиноподобный фактор роста 1, инсулиноподобный фактор роста 2, пептид, подавляющий выделение желудочного сока, фактор высвобождения гормона роста, пептид, активирующий гипофизарную аденилатциклазу, секретин, энтерогастрин, соматостатин, соматотропин, соматомедин, паратиреоидный гормон, тромбопоэтин, эритропоэтин, релизинг-факторы гипоталамуса, пролактин, стимулирующие гормоны щитовидной железы, эндорфины, энкефалины, вазопрессин, окситоцин, опиоиды и их аналоги, пероксид-дисмутазу, интерферон, аспарагиназу, аргиназу, аргининдезаминазу, аденозиндезаминазу и рибонуклеазу.

Совершенно очевидно, что пептид (или белок) должен иметь по крайней мере одну свободную аминогруппу, которая является N-концевой аминогруппой или аминогруппой боковой цепи. Пептиды или белок могут содержать аминокислоты, не кодированные генетическим кодом, такие как D-аминокислоты, 3-гидроксипролин, орнитин и пентилглицин. Особенно интересными являются аминогруппы аминокислотных остатков лизина и орнитина. Данный способ, в частности, относится к N-ацилированию ε-аминогруппы остатков лизина. Кроме того, должно быть понятно, что рассматриваемый пептид или белок может содержать две или больше боковых аминогрупп, все из которых могут быть N-ацилированы способом по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение особенно относится к ацилированию GLP-1 и его аналогов. Примеры GLP-1 и его аналогов, которые могут быть N-ацилированы способом по настоящему изобретению, включают GLP-1 и его аналоги с укороченной последовательностью, такие как Arg²⁶-GLP-1(7-37); Arg³⁴-GLP-1(7-37);

и их производные. Все указанные аналоги GLP-1 и аналоги с укороченной последовательностью относятся к альтернативным вариантам осуществления настоящего изобретения.

Настоящее изобретение относится также к ацилированию GLP-2 и его аналогов. Примеры GLP-2 и его аналогов, которые могут быть N-ацилированы способом по настоящему изобретению, включают аналоги GLP-2 и аналоги с укороченной последовательностью, такие как Lys²⁰GLP-2(1-33); Lys²⁰Arg³⁰GLP-2(1-33); Arg³⁰Lys³⁴GLP-2(1-34); Arg³⁰Lys³⁵GLP-2(1-35); Arg^30,35Lys²⁰GLP-2(1-35) и Arg³⁵GLP-2(1-35). Все указанные аналоги GLP-2 и аналоги с укороченной последовательностью относятся к альтернативным вариантам осуществления настоящего изобретения.

Настоящее изобретение относится также к ацилированию экзендина-3, экзендина-4 и их аналогов. Примеры аналогов экзендина, которые могут быть N-ацилированы способом по настоящему изобретению, описаны, например, в заявке WO 99/43708. Все вышеуказанные аналоги экзендина и аналоги с укороченной последовательностью относятся к альтернативным вариантам осуществления настоящего изобретения.

Настоящее изобретение относится также к ацилированию инсулина и его аналогов. Примерами инсулина и его аналогов, которые могут быть N-ацилированы способом по настоящему изобретению, являются инсулин человека и дез(В30)-инсулин человека.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения N-ацилированию подвергают ε-аминогруппу остатков лизина.

Ацилирующий агент

В способе по настоящему изобретению пептид (или белок), имеющий по крайней мере одну свободную аминогруппу, подвергают взаимодействию с ацилирующим агентом общей формулы I

Целое число n в формуле I предпочтительно равно 0-8, в частности 0-6, что соответствует, например, аспарагиновой кислоте, глутаминовой кислоте и т.д. Число n предпочтительно равно 0-4, более предпочтительно 0-2, например 0 (аспарагиновая кислота) или 1 (глутаминовая кислота). Все указанные целые числа и диапазоны указанных чисел относятся к альтернативным вариантам осуществления настоящего изобретения.

R¹ в формуле I означает свободную кислотную группу (СООН) или сложноэфирную группу (COOR⁴). В тех случаях, когда R¹ является сложноэфирной группой, R⁴ выбирают из групп, которые могут быть удалены (в виде соответствующих спиртов) гидролизом в основных условиях. Примеры таких групп включают С_1-12-алкил, например метил, этил, проп-1-ил, проп-2-ил, бут-1-ил, бут-2-ил, 2-метилпроп-1-ил, 2-метилпроп-2-ил (трет-бутил), гекс-1-ил, бензил и т.д. Все указанные группы относятся к альтернативным вариантам осуществления настоящего изобретения.

R² в формуле I означает липофильную часть молекулы, вводимую в пептид или белок. Такую липофильную часть обычно выбирают из группы, включающей С_3-39-алкил, С_3-39-алкенил, С_3-39-алкадиенил и стероидные остатки. Типичными примерами С_3-39-алкила являются гептил, нонил, ундеканил, тридеканил, пентадеканил, гептадеканил и нонадеканил. Все указанные липофильные части молекулы относятся к альтернативным вариантам осуществления настоящего изобретения.

Липофильный заместитель или часть молекулы характеризуется растворимостью в воде при 20°С в пределах от около 0,1 мг/100 мл воды до около 250 мг/100 мл воды, предпочтительно в пределах от около 0,3 мг/100 мл воды до около 75 мг/100 мл воды. Например, октановая кислота (С8) характеризуется растворимостью в воде при 20°С, равной 68 мг/100 мл, декановая кислота (С10) характеризуется растворимостью в воде при 20°С, равной 15 мг/100 мл, и октадекановая кислота (С18) характеризуется растворимостью в воде при 20°С, равной 0,3 мг/100 мл. Все пределы растворимости указанных липофильных заместителей относятся к альтернативным вариантам осуществления настоящего изобретения.

Термины "С_3-39-алкил", "С_3-39-алкенил" и "С_3-39-алкадиенил" означают насыщенные, мононенасыщенные и диненасыщенные углеводородные радикалы с прямой и разветвленной цепью, предпочтительно с прямой цепью, содержащие 3-39 атомов углерода. Типичными примерами С_3-39-алкила являются гептил, нонил, ундеканил, тридеканил, пентадеканил, гептадеканил и нонадеканил.

В используемом здесь значении термин "стероидный остаток" означает липофильную группу, которая вместе с карбонильной группой, к которой присоединен R², представляет собой производное карбоновой кислоты стероида, то есть три-, тетра- и пентациклический, полностью насыщенный или частично ненасыщенный С_16-36-углеводород. Примерами таких групп R²-C(=O)- являются литохолоил, дезоксихолоил и холоил.

Среди вышеуказанных липофильных групп С_7-25-алкил, С_7-25-алкенил, С_7-25-алкадиенил и стероидные остатки особенно пригодны для использования в настоящем изобретении. Особенно интересными примерами являются гептил, нонил, ундеканил, тридеканил, пентадеканил, гептадеканил, нонадеканил, литохолоил, дезоксихолоил и холоил. Все указанные липофильные группы относятся к альтернативным вариантам осуществления настоящего изобретения.

R³ в формуле I вместе с карбоксильной группой, к которой присоединен R³, означает реакционноспособный сложный эфир или реакционноспособный N-гидроксиимидоэфир. Все указанные сложные эфиры относятся к альтернативным вариантам осуществления настоящего изобретения. Реакционноспособные сложные эфиры и реакционноспособные N-гидроксиимидоэфиры хорошо известны в области органической химии (особенно в химии пептидов) в качестве функциональных групп, используемых при ацилировании амино-, тио- и гидроксильных групп. В контексте настоящего изобретения термин "реакционноспособный сложный эфир или реакционноспособный N-гидроксиимидоэфир" означает сложноэфирную функционально активную форму группы карбоновой кислоты, пригодную для ацилирования амина, предпочтительно первичного амина. Таким образом, должно быть понятно, что избирательное ацилирование первичных аминов является более предпочтительным, чем ацилирование гидроксильных и тиогрупп. Особенно предпочтительными являются реакционноспособные N-гидроксиимидоэфиры.

Примерами реакционноспособных сложных эфиров являются сложные эфиры 1-гидроксибензотриазола и их производные. Известен целый ряд высокоэффективных реагентов, например тетрафторборат 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония, используемых для получения активированных сложных эфиров карбоновых кислот. Такие реакционноспособные эфиры обычно образуются in situ в присутствии основания, например, органического основания, такого как триалкиламин.

Примеры имидной части реакционноспособных N-гидроксиимидоэфиров приведены в европейском патенте № 0511600 А2, на стр. 3-7. Особенно интересными примерами имидных частей являются сукцинимид, фталимид и т.д. Все указанные имидные части относятся к альтернативным вариантам осуществления настоящего изобретения.

Реакционноспособные N-гидроксиимидоэфиры формулы I можно получить в соответствии с описанием, приведенным в заявках WO 00/55119 и WO 98/02460.

При использовании ацилирующего реагента формулы I в виде свободной α-карбоновой кислоты (R⁴ = водород) соединение формулы I, где R⁴ означает группу, которая может быть избирательно удалена, превращают в соответствующее соединение, где R⁴ означает водород. Защитной группой карбоновой кислоты может быть бензильная группа, которая может быть удалена каталитическим гидрированием, или аллильная группа, которая может быть избирательно удалена. Бензильную защитную группу можно удалить каталитическим гидрированием в апротонном полярном растворителе, например в ацетоне, при комнатной температуре с использованием палладия-на-угле и водорода. Указанная реакция может быть выполнена в закрытом сосуде в атмосфере водорода (обычно под давлением 0,1-10 атм) при интенсивном перемешивании. Данная реакция обычно продолжается в течение 0,5-12 часов в зависимости от качества палладиевого катализатора. При этом производят обычную обработку.

Условия реакции

Взаимодействие между ацилирующим агентом формулы I и пептидом или белком осуществляют в основных условиях в водном растворе, содержащем менее 10% мас./мас. апротонного полярного растворителя.

В одном варианте осуществления изобретения реакцию на стадии а) выполняют в водном растворе, содержащем от 0% мас./мас. до 10% мас./мас. апротонного полярного растворителя.

В другом варианте осуществления изобретения реакцию на стадии а) выполняют в водном растворе, содержащем от 1% мас./мас. до 10% мас./мас. апротонного полярного растворителя.

В другом варианте осуществления изобретения реакцию на стадии а) выполняют в водном растворе, содержащем от 1% мас./мас. до 8% мас./мас. апротонного полярного растворителя.

Ацилирующий агент формулы I обычно используют в небольшом избытке по отношению к числу ацилируемых аминогрупп пептида. Соотношение избытка ацилирующего агента обычно составляет от 1:1 до 1:20, предпочтительно от 1:1,2 до 1:5 в зависимости от числа аминогрупп в пептиде. Ацилирующий агент можно добавлять к реакционной смеси в виде твердого вещества или раствора. При добавлении ацилирующего агента в виде раствора указанный агент растворяют в апротонном полярном растворителе и предпочтительно стабилизуют, добавляя кислоту. Для стабилизации обычно используют минеральную кислоту, например серную кислоту.

Должно быть понятно, что пептид может быть полностью N-ацилирован или только частично N-ацилирован в зависимости от используемого количества ацилирующего агента и условий реакции. Желательно, чтобы N-ацилирование было по существу стехиометрическим.

Апротонные полярные растворители являются растворителями с умеренно высокими диэлектрическими константами, не содержащими кислотного водорода (см., например, Morrison and Boyd, Organic Chemistry, 5^th ed. p. 229). Апротонный полярный растворитель обычно выбирают из группы, включающей безводный тетрагидрофуран (ТГФ), безводный диметилформамид (ДМФА), ацетон, дихлорметан, диметилсульфоксид (ДМСО), диоксан, диметилацетамид, N-метил-2-пирролидон и их смеси, из которых предпочтительными являются диметилформамид, диметилсульфоксид, диметилацетамид и N-метил-2-пирролидон и особенно предпочтительным является N-метил-2-пирролидон.

Температура обычно находится в интервале от -10°С до 50°С.

Важно, чтобы значение рН смеси растворителей находилось в пределах 7-14, например 9-13, предпочтительно в пределах 10-12, для более спокойного протекания реакции. Выход и чистота продукта обычно являются оптимальными при значении рН смеси растворителей в пределах 10-12. Требуемое значение рН получают, добавляя гидроксиды щелочных металлов, например гидроксид натрия и гидроксид калия, и/или органические основания, такие как триалкиламины (например, триэтиламин, N,N-диизопропилэтиламин и т.д.). Кроме того, может быть желательно добавить буфер, который позволяет удерживать рН почти у исходного значения до начала реакции. Примеры буфера, который можно использовать для указанной цели, включают фосфатный буфер, боратный буфер и тому подобные.

В качестве типичного примера можно отметить, что реакцию на стадии (а) выполняют с использованием белка и ацилирующего агента формулы I в молярном соотношении от 1:1 до 1:5. Пептид обычно предварительно растворяют в воде при температуре от -10°С до 30°С, например при 0-25°С, и значение рН доводят до требуемого уровня, добавляя гидроксид щелочного металла (например, гидроксид натрия или гидроксид калия). Значение рН может быть далее отрегулировано с использованием кислот, например уксусной кислоты, и оснований, например триалкиламина, но температура предпочтительно находится в вышеуказанном интервале. Альтернативно пептид предварительно растворяют непосредственно в водном растворе соответствующего количества вышеуказанной кислоты или основания. Затем добавляют ацилирующий агент в виде твердого вещества или раствора в апротонном полярном растворителе. Реакцию обычно выполняют до полного завершения (ход реакции можно контролировать ВЭЖХ), обычно достигаемого через 0,2-4 часа, в частности через 0,2-1 час, после чего добавляют воду и кислоту, например уксусную кислоту, до рН 6,5-9,0. Продукт обычно выделяют и очищают при помощи ВЭЖХ, осаждают при изоэлектрическом показателе рН или гидролизуют (стадия (b)) перед очисткой.

При использовании ацилирующего агента формулы I, в которой R⁴ означает водород, сразу же получают N-ацилированный пептид или белок, содержащий липофильные части и свободные карбоксильные группы. Таким образом, вариант, в котором R⁴ означает водород, является предпочтительным вариантом осуществления способа по настоящему изобретению.

В альтернативном случае, то есть, когда R⁴ означает С_1-12-алкил или бензил, сложный эфир N-ацилированного пептида (или сложный эфир белка) подвергают омылению в основных условиях, в результате чего получают N-ацилированный пептид или N-ацилированный белок. Омыление обычно выполняют в 0,01-4,0 М растворе гидроксида щелочного металла, например гидроксида натрия или калия. Показатель рН раствора обычно равен 10-14. Реакцию обычно выполняют в течение 0,1-12 часов, предпочтительно в течение 0,5-4 часов, при 0-40°С, например при комнатной температуре. После окончания реакции продукт очищают, например, путем осаждения при изоэлектрическом значении рН и/или при помощи препаративной ВЭЖХ. Таким образом, вариант, в котором R⁴ означает С_1-12-алкил или бензил, является другим предпочтительным вариантом осуществления способа по настоящему изобретению.

В одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению ацилирующий агент добавляют к реакционной смеси в виде твердого вещества.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению реакцию на стадии а) выполняют в водной смеси, содержащей от 0% мас./мас. до 8% мас./мас. апротонного полярного растворителя, предпочтительно от 0% мас./мас. до 5% мас./мас. апротонного полярного растворителя и еще предпочтительнее от 0% мас./мас. до 3% мас./мас. апротонного полярного растворителя.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению реакцию на стадии а) выполняют в присутствии апротонного полярного растворителя, который выбирают из группы, включающей N-метил-2-пирролидон, тетрагидрофуран и диметилсульфоксид.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению весь апротонный органический растворитель добавляют к реакционной смеси в качестве растворителя для ацилирующего агента.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению ацилирующий агент добавляют к реакционной смеси в виде раствора, стабилизированного путем добавления кислоты.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению кислоту добавляют к апротонному полярному растворителю в концентрации от 0,01% мас./мас. до 1% мас./мас., предпочтительно в концентрации от 0,05% мас./мас. до 0,5% мас./мас.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению указанную кислоту выбирают из группы, включающей серную кислоту, метансульфоновую кислоту и трифторуксусную кислоту.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению реакцию на стадии а) выполняют без апротонного полярного растворителя.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению R⁴ в формуле I означает водород.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению R⁴ выбирают из С_1-8-алкила и бензила.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению R³ вместе с карбоксильной группой, к которой присоединен R³, означает реакционноспособный N-гидроксимидоэфир.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению сложный эфир ацилированного пептида подвергают омылению при значении рН в пределах 10-14, предпочтительно при рН в пределах 9-13.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению сложный эфир ацилированного пептида подвергают омылению при значении рН в пределах 9-14, в частности при рН в пределах 10-13.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению значение рН реакционной смеси на стадии а) равно от рН 9 до рН 13, предпочтительно от рН 10 до рН 12 или более предпочтительно от рН 11,0 до рН 11,5.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению реакционная смесь, используемая на стадии а), содержит буфер, пригодный для поддержания по существу постоянного значения рН во время реакции. В одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению указанный буфер является фосфатным буфером, боратным буфером или их смесью.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению температура реакционной смеси на стадии а) находится в интервале 0-50°С, предпочтительно в интервале 5-40°С и более предпочтительно в интервале 10-30°С.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению R² выбирают из группы, включающей С_3-39-алкил, С_3-39-алкенил, С_3-39-алкадиенил и стероидные остатки.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению R²-C(=O)- выбирают из группы, включающей литохолоил и гексадеканоил.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению пептид, используемый в качестве исходного вещества на стадии а), имеет чистоту, равную по крайней мере 80%, по крайней мере 90%, по крайней мере 93%, по крайней мере 95% или по крайней мере 97%, при определении методом ВЭЖХ с обращенной фазой.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению указанный пептид выбирают из группы, включающей GLP-1, экзендин-4, GLP-2, глюкагон, инсулин, аналоги и производные любых вышеуказанных веществ.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению указанный пептид является агонистом GLP-1.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению указанный пептид выбирают из группы, включающей экзендин-3, экзендин-4, Arg³⁴-GLP-1(7-37), Gly⁸-GLP-1(7-36)-амид, Gly⁸-GLP-1(7-37), Val⁸-GLP-1(7-36)-амид, Val⁸-GLP-1(7-37), Val⁸Asp²²-GLP-1(7-36)-амид, Val⁸Asp²²-GLP-1(7-37), Val⁸Glu²²-GLP-1(7-36)-амид, Val⁸Glu²²-GLP-1(7-37), Val⁸Lys²²-GLP-1(7-36)-амид, Val⁸Lys²²-GLP-1(7-37), Val⁸Arg²²-GLP-1(7-36)-амид, Val⁸Arg²²-GLP-1(7-37), Val⁸His²²-GLP-1(7-36)-амид, Val⁸His²²-GLP-1(7-37), дез(В30)-инсулин человека и их производные.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению указанный пептид выбирают из группы, Val⁸Trp¹⁹Glu²²-GLP-1(7-37), Val⁸Glu²²Val²⁵-GLP-1(7-37), Val⁸Tyr¹⁶Glu²²-GLP-1(7-37), Val⁸Trp¹⁶Glu²²-GLP-1(7-37), Val⁸Leu¹⁶Glu²²-GLP-1(7-37), Val⁸Tyr¹⁸Glu²²-GLP-1(7-37), Val⁸Glu²²His³⁷-GLP-1(7-37), Val⁸Glu²²Ile³³-GLP-1(7-37), Val⁸Trp¹⁶Glu²²Val²⁵Ile³³-GLP-1(7-37), Val⁸Trp¹⁶Glu²²Ile³³-GLP-1(7-37), Val⁸Glu²²Val²⁵Ile³³-GLP-1(7-37), Val⁸Trp¹⁶Glu²²Val²⁵-GLP-1(7-37) и их аналоги.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению указанный пептид выбирают из HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2 (ZP-10) и его аналогов.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению указанный пептид не является инсулиновым пептидом, то есть он не является инсулином или его аналогом. В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению указанный пептид включает только одну полипептидную цепь. В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению указанный пептид содержит две полипептидные цепи, которые ковалентно связаны по крайней мере одной дисульфидной связью.

Другим объектом настоящего изобретения является применение описанного способа ацилирования для получения производного пептида, выбираемого из группы, включающей Arg³⁴, Lys²⁶(N^ε-(γ-Glu(N^α-гексадеканоил)))-GLP-1(7-37) и Lys^В29(N^ε-тетрадеканоил)дез(В30)-инсулин человека и Lys^В29(N^ε[N^α-литохолоил-Glu-OH])дез(В30)-инсулин человека.

ПРИМЕРЫ

Ацилирующие реагенты получены в соответствии с описанием, приведенным в заявке WO 00/55119.

В примерах конечную очистку продукта производили с помощью хроматографии на колонках.

Пример 1

Arg³⁴GLP-1_(7-37) экспрессировали в дрожжах (S. cerevisiae) обычными методами рекомбинантных ДНК, например, описанными в заявке WO 98/08871. Arg³⁴GLP-1_(7-37), культивируемый в ферментационном бульоне, очищали хроматографией с обращенной фазой и затем осаждали при изоэлектрическом значении рН пептида, то есть при рН 5,4. Осадок отделяли центрифугированием и замораживали.

Arg³⁴GLP-1^7-37 (1,47 г замороженного изоосажденного пептида, примерно 0,10 ммоль) растворяли в 0,1 моль/кг триэтиламина (23 мл) при 10-15°С. Значение рН раствора было равно 11,6. Добавляли γ-N-гидроксисукцинимидоэфир N-гексадеканоилглутаминовой кислоты (63,7 мг, 0,13 ммоль). Реакционную смесь выдерживали в течение 20 минут при комнатной температуре и добавляли воду (42 мл), при этом рН доводили до 8,0, добавляя 1,0 М раствор уксусной кислоты.

Выход: результаты анализа методом ВЭЖХ с обращенной фазой показали, что реакционная смесь содержала 84% (по площади) Arg³⁴Lys²⁶-[N-ε(γ-Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-1^7-37 и 0,5% (по площади) Arg³⁴Lys²⁶-[N-ε-(α-Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-1^7-37.

Пример 2

Arg³⁴GLP-1_(7-37) экспрессировали в дрожжах (S. cerevisiae) обычными методами рекомбинантных ДНК, например, описанными в заявке WO 98/08871. Arg³⁴GLP-1_(7-37), культивируемый в ферментационном бульоне, очищали хроматографией с обращенной фазой и затем осаждали при изоэлектрическом значении рН пептида, то есть при рН 5,4. Осадок отделяли центрифугированием и замораживали.

Arg³⁴GLP-1^7-37 (1,57 г замороженного изоосажденного пептида, примерно 0,14 ммоль) растворяли в 0,1 моль/кг триэтиламина (23 мл) при 10-15°С. Значение рН раствора доводили до 11,5, добавляя триэтиламин. Затем добавляли 1,7 мл γ-N-гидроксисукцинимидоэфира N-гексадеканоилглутаминовой кислоты (92,1 мг, 0,19 ммоль), растворенного в N-метил-2-пирролидоне, содержащем 0,105% мас./мас. 1 М раствора Н₂SO₄. Реакционную смесь выдерживали в течение 20 минут при комнатной температуре и добавляли воду (42 мл), при этом рН доводили до 8,0, добавляя 1,0 М раствор уксусной кислоты.

Выход: результаты анализа методом ВЭЖХ с обращенной фазой показали, что реакционная смесь содержала 83% (по площади) Arg³⁴Lys²⁶-[N-ε-(γ-Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-1^7-37 и 0,4% (по площади) Arg³⁴Lys²⁶-[N-ε-(α-Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-1^7-37.

Пример 3

Arg³⁴GLP-1_(7-37) экспрессировали в дрожжах (S. cerevisiae) обычными методами рекомбинантных ДНК, например, описанными в заявке WO 98/08871. Arg³⁴GLP-1_(7-37), культивируемый в ферментационном бульоне, очищали хроматографией с обращенной фазой и затем осаждали при изоэлектрическом значении рН пептида, то есть при рН 5,4. Осадок отделяли центрифугированием и замораживали.

Arg³⁴GLP-1^7-37 (1,53 г замороженного изоосажденного пептида, примерно 0,13 ммоль) растворяли в 0,05 моль/кг триэтиламина (25 мл) при комнатной температуре. Значение рН раствора было равно 10,9. Затем добавляли 1,8 мл γ-N-гидроксисукцинимидоэфира N-гексадеканоилглутаминовой кислоты (94,2 мг, 0,19 ммоль), растворенного в N-метил-2-пирролидоне без добавления Н₂SO₄. Реакционную смесь выдерживали в течение 30 минут при комнатной температуре и добавляли воду (48 мл), при этом рН доводили до 8,0, добавляя 1,0 М раствор уксусной кислоты.

Выход: результаты анализа методом ВЭЖХ с обращенной фазой показали, что реакционная смесь содержала 75% (по площади) Arg³⁴Lys²⁶-[N-ε-(γ-Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-1^7-37 и 4,0% (по площади) Arg³⁴Lys²⁶-[N-ε-(α-Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-1^7-37.

Пример 4. Сравнительный пример с использованием апротонного полярного растворителя в концентрации >10% мас./мас.

Arg³⁴GLP-1_(7-37) экспрессировали в дрожжах (S. cerevisiae) обычными методами рекомбинантных ДНК, например, описанными в заявке WO 98/08871. Arg³⁴GLP-1_(7-37), культивируемый в ферментационном бульоне, очищали хроматографией с обращенной фазой и затем осаждали при изоэлектрическом значении рН пептида, то есть при рН 5,4. Осадок отделяли центрифугированием и замораживали.

Arg³⁴GLP-1^7-37 (1,57 г замороженного изоосажденного пептида, примерно 0,14 ммоль) растворяли в 0,1 моль/кг триэтиламина (23 мл) при 10-15°С. Добавляли N-метил-2-пирролидон (6,8 мл) и значение рН раствора доводили до 11,5, добавляя триэтиламин. Затем добавляли γ-N-гидроксисукцинимидоэфир N-гексадеканоилглутаминовой кислоты (92,1 мг, 0,19 ммоль), растворенного в 1,7 мл N-метил-2-пирролидона, содержащего 0,105% мас./мас. 1 М раствора Н₂SO₄. Реакционную смесь выдерживали в течение 20 минут при комнатной температуре и добавляли воду (54 мл), при этом рН доводили до 8,0, добавляя 1,0 М раствор уксусной кислоты.

Выход: результаты анализа методом ВЭЖХ с обращенной фазой показали, что реакционная смесь содержала 87% (по площади) Arg³⁴Lys²⁶-[N-ε-(γ-Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-1^7-37 и 0,5% (по площади) Arg³⁴Lys²⁶-[N-ε-(α-Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-1^7-37.

Пример 5. Сравнительный пример с использованием апротонного полярного растворителя в концентрации >10% мас./мас.

Arg³⁴GLP-1_(7-37) экспрессировали в дрожжах (S. cerevisiae) обычными методами рекомбинантных ДНК, например, описанными в заявке WO 98/08871. Arg³⁴GLP-1_(7-37), культивируемый в ферментационном бульоне, очищали хроматографией с обращенной фазой и затем осаждали при изоэлектрическом значении рН пептида, то есть при рН 5,4. Осадок отделяли центрифугированием и замораживали.

Arg³⁴GLP-1^7-37 (1,51 г замороженного изоосажденного пептида, примерно 0,13 ммоль) растворяли в 0,1 моль/кг триэтиламина (20 мл) и N-метил-2-пирролидоне (100 мл) при 10-15°С. Затем добавляли γ-N-гидроксисукцинимидоэфир N-гексадеканоилглутаминовой кислоты (74 мг, 0,15 ммоль), растворенного в 1,4 мл N-метил-2-пирролидона, содержащего 0,105% мас./мас. 1 М раствора Н₂SO₄. Реакционную смесь выдерживали в течение 45 минут при комнатной температуре и добавляли воду (206 мл), при этом рН доводили до 8, добавляя 1,0 М раствор уксусной кислоты.

Выход: результаты анализа методом ВЭЖХ с обращенной фазой показали, что реакционная смесь содержала 57% (по площади) Arg³⁴Lys²⁶-[N-ε-(γ-Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-1^7-37 и 14% (по площади) Arg³⁴Lys²⁶-[N-ε-(α-Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-1^7-37.

Пример 6

В таблице 1 суммированы экспериментальные условия, используемые для ацилирования Arg³⁴-GLP-1^7-37 в экспериментах по примерам 1-5, и указано содержание загрязняющей примеси Arg³⁴Lys²⁶-[N-ε-(α-Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-1^7-37 (сокращенное обозначение α-glu). Из таблицы видно, что без добавления H₂SO₄ в качестве стабилизатора количество загрязняющей примеси α-glu можно сократить при использовании более низких концентраций апротонного полярного растворителя. При добавлении стабилизатора образование значительных количеств загрязняющей примеси α-glu начинается при гораздо более высоких концентрациях апротонного полярного растворителя, то есть при концентрации выше 28% мас./мас.

Таблица 1 Содержание апротонного полярного растворителя в реакционной смеси при ацилировании пептидов GLP-1 и полученная фракция загрязняющей примеси Arg34Lys26-[N-ε-(α-Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-17-37 (α-glu). (Данные из примеров 1-5)
№ примера	Водный раствор пептида (мл)	Добавляемое количество NMP (мл)	Содержание NMP (% мас./мас.)	Добавляемое количество H2SO4	α-glu
1	23	0	0%	-	0,5%
2	23	1,7	7%	+	0,4%
3	25	1,8	7%	-	4%
4	23	6,8+1,7	28%	+	0,5%
5	20	100+1,4	84%	+	14%

Пример 7

Кристаллизованный натрием дез(В30)-инсулин человека (1,74 г замороженного пептида, выделенного изоэлектрическим осаждением, примерно 0,088 ммоль) растворяли в 0,1 моль/кг триэтиламина (10,85 мл) при комнатной температуре. Значение рН раствора было равно 10,9. Затем добавляли метил-(2S)-5-[(2,5-диоксо-1-пирролидинил)окси]-2-{[(3a,5b)-3-гидрокси-9-метил-24-оксохолан-24-ил]амино}-5-оксопентаноат (55,1 мг, 0,089 ммоль), растворенный в N-метил-2-пирролидоне (1,25 мл). Реакционную смесь выдерживали в течение 30 минут при комнатной температуре и добавляли воду (5°С, 85 мл).

Выход: по результатам анализа методом ВЭЖХ с обращенной фазой реакционная смесь содержала 34% (по площади) N-ε-(литохолоил-γ-глутамил)-Lys^В29-дез(В30)-инсулина человека.

Пример 8

Arg³⁴GLP-1_(7-37) экспрессировали в дрожжах (S. cerevisiae) обычными методами рекомбинантных ДНК, например, описанными в заявке WO 98/08871. Arg³⁴GLP-1_(7-37), культивируемый в ферментационном бульоне, очищали хроматографией с обращенной фазой и затем осаждали при изоэлектрическом значении рН пептида, то есть при рН 5,4. Осадок отделяли центрифугированием и замораживали.

Осадок, полученный в результате изоэлектрического осаждения и содержащий Arg³⁴GLP-1_(7-37) (5,70 г замороженного осажденного пептида, примерно 0,38 ммоль), растворяли в 0,1 М растворе дигидрата динатрийгидрофосфата (170 мл, рН доводили до 11,35, добавляя 1 М раствор NaOH) при 15°С. Значение рН раствора вторично доводили до 11,4, добавляя 1 М раствор NaOH. Затем в течение 8 минут по каплям добавляли 3 мл γ-N-гидроксисукцинимидоэфира N-гексадеканоилглутаминовой кислоты (248,1 мг, 0,51 ммоль), растворенного в N-метилпирролидоне, содержащем 0,105% мас./мас. 1 М раствора H₂SO₄.

Образцы отбирали на протяжении 21,5 часа выполнения реакции при 15°С и добавляли 0,1 М раствор дигидрата динатрийгидрофосфата, содержащий 1 мг/мл глицина, рН 7,5. Конечную реакционную смесь разбавляли водой (300 мл) и рН доводили до 8,0, добавляя ледяную уксусную кислоту.

Выход: По результатам анализа методов ВЭЖХ с обращенной фазой реакционная смесь содержала 78-80% (по площади) Arg³⁴Lys²⁶-[N-ε-(γ-Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-1^7-37 и 0,24-1,67% (по площади) Arg³⁴Lys²⁶-[N-ε-(α-Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-1^7-37.

Таблица 2 Содержание Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-17-37 (γ-Glu) и Arg34Lys26-[N-ε-(α-Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-17-37 (α-Glu) в зависимости от времени реакции. (Данные из примера 8)
Время (часы)	γ-Glu (% по площади)	α-Glu (% по площади)
0,17	78,01	0,24
1	79,35	0,31
2	79,45	0,36
4	80,49	0,45
21,5	80,27	1,67

1. Способ получения N-ацилированного пептида, который включает стадии:

а) осуществление взаимодействия пептида, который выбирают из группы, включающей экзендин-3, экзендин-4, Arg³⁴-GLP-1(7-37), Gly⁸-GLP-1(7-36)-амид, Gly⁸-GLP-1(7-37), Val⁸-GLP-1(7-36)-амид, Val⁸-GLP-1(7-37), Val⁸Asp²²-GLP-1(7-36)-амид, Val⁸Asp²²-GLP-1(7-37), Val⁸Glu²²-GLP-1(7-36)-амид, Val⁸Glu²²-GLP-1(7-37), Val⁸Lys²²-GLP-1(7-36)-амид, Val⁸Lys²²-GLP-1(7-37), Val⁸Arg²²-GLP-1(7-36)-амид, Val⁸Arg²²-GLP-1(7-37), Val⁸His²²-GLP-1(7-36)-амид, Val⁸His²²-GLP-1(7-37), дез(В30)-инсулин человека и их аналоги, с ацилирующим агентом общей формулы I

где n равно 0-8;

R¹ означает COOR⁴;

R² означает липофильную часть молекулы;

R³ вместе с карбоксильной группой, к которой присоединен R³, означает реакционноспособный сложный эфир или реакционноспособный N-гидроксиимидоэфир; и

R⁴ выбирают из группы, включающей водород, С_1-12алкил и бензил;

в основных условиях в водной смеси;

b) омыление сложноэфирной группы ацилированного пептида (COOR⁴) в основных условиях, если R не является водородом;

c) выделение N-ацилированного пептида;

характеризующийся тем, что водная смесь, используемая на стадии а), содержит менее 10% мас./мас. апротонного полярного растворителя, в котором ацилирующий агент добавляют к реакционной смеси в виде раствора, стабилизированного путем добавления кислоты.

2. Способ по п.1, в котором реакцию на стадии а) выполняют в водной смеси, содержащей менее 8% мас./мас. апротонного полярного растворителя, предпочтительно менее 5% мас./мас. апротонного полярного растворителя и еще предпочтительнее менее 3% мас./мас. апротонного полярного растворителя.

3. Способ по п.1, в котором реакцию на стадии а) выполняют в присутствии апротонного полярного растворителя, причем указанный апротонный полярный растворитель выбирают из группы, включающей N-метил-2-пирролидон, тетрагидрофуран и диметилсульфоксид.

4. Способ по п.1, в котором весь апротонный органический растворитель добавляют к реакционной смеси в качестве растворителя для ацилирующего агента.

5. Способ по п.1, в котором указанную кислоту добавляют к апротонному полярному растворителю в концентрации от 0,01 до 1% мас./мас., предпочтительно в концентрации от 0,05 до 0,5% мас./мас..

6. Способ по п.1, в котором указанную кислоту выбирают из группы, включающей серную кислоту, метансульфоновую кислоту и трифторуксусную кислоту.

7. Способ по п.1, в котором реакцию на стадии а) выполняют без апротонного полярного растворителя.

8. Способ по п.1, в котором R⁴ означает водород.

9. Способ по п.1, в котором R⁴ выбирают из группы, включающей C_1-8-алкил и бензил.

10. Способ по п.1, в котором R³ вместе с карбоксильной группой, к которой присоединен R³, означает реакционноспособный N-гидроксиимидоэфир.

11. Способ по п.1, в котором сложный эфир ацилированного пептида подвергают омылению при значении рН в пределах 10-14, предпочтительно при рН в пределах 9-13.

12. Способ по п.1, в котором рН реакционной смеси на стадии а) находится в пределах от рН 9 до рН 13, предпочтительно в пределах от рН 10 до рН 12 или более предпочтительно в пределах от рН 11,0 до рН 11,5.

13. Способ по п.1, в котором температура реакционной смеси на стадии а) находится в интервале 0-50°С, предпочтительно в интервале 5-40°С и более предпочтительно в интервале 10-30°С.

14. Способ по п.1, в котором R² выбирают из группы, включающей С_3-39-алкил, С_3-39-алкенил, С_3-39-алкадиенил и стероидные остатки.

15. Способ по п.1, в котором R²-С(=O)- выбирают из группы, включающей литохолоил и гексадеканоил.

16. Способ по п.1, в котором пептид, используемый в качестве исходного вещества на стадии а), имеет чистоту, равную по крайней мере 80%, по крайней мере 90%, по крайней мере 93%, по крайней мере 95% или по крайней мере 97%, при определении методом ВЭЖХ с обращенной фазой.

17. Способ по п.1, в котором реакционная смесь, используемая на стадии а), содержит буфер, пригодный для сохранения, по существу, постоянного значения рН в течение всей реакции.