Способ получения церулоплазмина

Изобретение относится к медицине, а именно к получению церулоплазмина, и может быть использовано при производстве ферментных лекарственных препаратов из плазмы крови. Предложенный способ включает растворение исходного сырья в ацетатном буферном растворе, сорбцию фермента на ионообменнике с функциональной группой ДЕАЕ, элюцию и последующую очистку, при этом в качестве ионообменника с функциональной группой ДЕАЕ используют сорбент на жесткой стиролдивинилбензольной матрице с привитой группой ДЕАЕ, а при очистке фермент в виде раствора сначала обрабатывают сольвент-детергентной смесью, потом обработанный фермент иммобилизируют на сульфопропилкатионитном сорбенте, промывают ацетатным буфером, который содержит хлорид натрия, и проводят элюцию очищенного фермента, растворение исходного сырья в ацетатном буферном растворе, сорбцию фермента на ионообменнике, где как таковой используют сорбент на жесткой стиролдивинилбензольной матрице с привитой группой ДЕАЕ, элюцию и последующую очистку. Во время очистки раствор фермента обрабатывают сольвент-детергентной смесью, потом фермент иммобилизируют на сульфопропилкатионитном сорбенте, промывают ацетатным буфером, который содержит хлорид натрия, и проводят элюцию очищенного фермента. Способ гарантирует вирусную безопасность полученного лекарственного препарата церулоплазмин и позволяет повысить выход целевого продукта. 8 з.п. ф-лы.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к получению донорского фермента церулоплазмина, который является медьсодержащим глобулярным белком плазмы крови млекопитающих, и может быть использован при производстве ферментных лекарственных препаратов из плазмы крови.

При производстве лекарственной формы церулоплазмина преимущество отдается технологиям, которые способны обеспечить эффективную очистку белка при минимальном количестве стадий, обеспечить автоматизацию и контроль производственного процесса. Существенной проблемой, которая существует при получении лекарственных препаратов из биологического материала, является опасность контаминации вирусами. Известные методы инактивации вирусов, в частности, тепловая обработка, не приемлемы к такому биологическому сырью как глобулярные белки плазмы крови, поскольку приводят к их разрушению и потере ферментной активности.

Известные способы получения церулоплазмина, в которых как сырье используют осадки донорской крови фракции IV и осадки Б, предусматривают выделение фермента на слабом анионообменнике с функциональной группой на основе третичной аммониевой основы диэтиламиноэтана (ДЕАЕ), привитой к разнообразным носителям. К таким, в частности, относятся способы, раскрытые в патентах Российской Федерации №2087150 (опубликовано 20.08.1997, кл. А61К 35/16) [1] и №2162338 (опубликовано 27.01.2001, кл. А61К 38/48, А61К 35/16) [2], а также в патентах Украины №2019 (опубликовано 20.12.1994, кл. А61К 38/48) [3], №17145 (опубликовано 31.10.1997, кл. А61К 35/16) [4], №61200 (опубликовано 17.11.2003, кл. А61К 35/16) [5]. Эта стадия технологии позволяет на несколько порядков очистить целевой белок при одновременной его концентрации. Полученный раствор содержит большое количество нерастворимых взвешенных механических включений белковой и липидной природы, которые незначительной мерой удаляются во время долговременных и технологически сложных стадий очистки методами центрифугирования или фильтрации.

Наиболее близким является способ получения церулоплазмина, который включает растворение исходного сырья в ацетатном буферном растворе, сорбцию фермента на ионообменнике из ДЕАЕ функциональной группой, элюцию и последующую очистку [1], в котором полученный после хроматографии элюат с концентрацией белка 0,5…2,0% подвергают отстаиванию в течение 6…12 часов при рН 5,1…5,4 и ионной силе 0,01…0,04, центрифугируют и концентрируют ультрафильтрацией. Сорбцию на ионообменнике, где как таковой используют ДЕАЕ-сефадекс А-50, проводят в 0,05 М ацетатном буферном растворе при рН 5,5 в течение 5…7 часов. После отстаивания промывание проводят 0,05 М ацетатным буферным раствором при рН 5,5…7,0, который содержит 0,07 М хлористого натрия.

Недостатком известного способа является вирусоопасность целевого продукта, поскольку способ не обеспечивает эффективного удаления вирусов при очистке. Так, титр целевого продукта, в который перед очисткой было внесено 4,5 log₁₀ ТЦЛД₅₀/см³ модельного вируса вирусной диареи BVDV, составляет после очистки >3,5 log₁₀ ТЦЛД₅₀/см³. Кроме того, частичная денатурация белка, которая происходит во время центрифугирования, приводит к снижению выхода целевого продукта.

Задачей изобретения является усовершенствование способа получения церулоплазмина, в котором за счет предложенной комплексной обработки и условий ее проведения повышается эффективность удаления и инактивации вирусов при очистке, что гарантирует вирусную безопасность полученного церулоплазмина. Кроме того, предложенный способ является более технологичным и позволяет снизить денатурацию белка, что приводит к повышению выхода целевого продукта.

Поставленная задача решается предложенным способом получения церулоплазмина, который включает растворение исходного сырья в ацетатном буферном растворе, сорбцию фермента на ионообменнике с функциональной группой ДЕАЕ, элюцию и последующую очистку, в которой как ионообменник с ДЕАЕ функциональной группой используют сорбент на жесткой стиролдивинилбензольной матрице с привитой группой ДЕАЕ, а при очистке фермент в виде раствора сначала обрабатывают сольвент-детергентной смесью, потом обработанный фермент иммобилизируют на сульфопропилкатионитном сорбенте, промывают ацетатным буфером, который содержит хлорид натрия, и проводят элюцию очищенного фермента.

Сорбция фермента на сорбенте с жесткой стиролдивинилбензольной матрицей с привитой группой ДЕАЕ, которая имеет зерна фракции 200-250 мкм и размер пор 30 нм, проводится с помощью колоночной хроматографии в «кипящем слое», что не позволяет нерастворенному материалу накапливаться в хроматографической колонне. Взвешенное состояние сорбента обеспечивается организацией потока снизу вверх и большим размером зерна.

Иммобилизация фермента и последующая промывка на сульфопропилкатионитном сорбенте, который имеет зерна фракции 100-200 мкм с диаметром пор 30 нм, также проводится с помощью колоночной хроматографии. Данный сорбент позволяет иммобилизировать не менее 25 мг/см³ целевого фермента, не создает высокого давления, практически не свертывается при использовании.

Лучше, сольвент-детергентная смесь для обработки фермента состоит из 0,1 М ацетатного буферного раствора при рН 5,8, который содержит 1 мас.% три-н-бутилфосфата и 1 мас.% полисорбата 80. Обработку ведут путем перемешивания сольвент-детергентной смеси с раствором фермента в реакторе в течение 6…9 часов с последующим разбавлением 0,1 М ацетатным буферным раствором при рН 5,8, который содержит 1 мас.% каприлата натрия, 0,05 М хлорида натрия и пропиленгликоль в количестве 0,2 г/л.

Обработанный фермент, иммобилизированный на сульфопропилкатионитном сорбенте, промывают в две стадии, где на первой стадии используют 0,1 М ацетатный буферный раствор при рН 5,8, который содержит 1 мас.% каприлата натрия, 0,05 М хлорида натрия и пропиленгликоль в количестве 0,2 г/л. Для промывки на первой стадии используют объем, соответствующем 7-ми объемам сорбента. На второй стадии промывания используют 0,1 М ацетатный буферный раствор при рН 5,8, который содержит 0,05 М хлорида натрия, в объеме, соответствующем трем объемам сорбента. На первой и второй стадиях промывание проводят со скоростью 4,5…5 см/мин.

Элюция очищенного фермента осуществляется 0,1 М ацетатным буферным раствором при рН 5,8, который содержит 0,3 М хлорида натрия.

Экспериментально было установлено, что предварительное выделение фермента из исходного сырья методом колоночной хроматографии с помощью сорбента с привитыми к стиролдивинилбензольной матрице группами ДЕАДЕ, обработка раствора фермента сольвент-детергентной смесью с последующей его иммобилизацией и промывкой на сульфопропилкатионитном сорбенте позволили максимально и без разрушения выделить фермент, очистить его от примесей, эффективно удалить вирусы при их наличии и концентрировать церулоплазмин для лекарственной формы. Важно, что лекарственную форму церулоплазмина получают без проведения таких нетехнологичных стадий, как центрифугирование и лиофилизация. Все процессы, которые проводятся при колоночной хроматографии, легко автоматизируются и контролируются. Таким образом, предложенный способ гарантирует вирусобезопасность полученного лекарственного препарата церулоплазмин и позволяет повысить выход целевого церулоплазмина.

Способ осуществляется таким образом.

Фракции крови IV-I и осадка Б, которые содержат церулоплазмин, смешивают с ацетатным буферным раствором в емкости с мешалкой при 0…5°С и перемешивают в течение 3…5 часов. Раствор фильтруют через капроновое сито. Осадок утилизируют. Фильтрат с помощью насоса пропускают снизу вверх через хроматографическую колонну, которая как ионообменник содержит сорбент на жесткой стиролдивинилбензольной матрице с привитой группой ДЕАЕ с зернами фракции 200-250 мкм и размером пор 30 нм, который находится во взвешенном состоянии. Элюат собирают в емкость.

Элюат разбавляют 3…5 объемами ацетатного буферного раствора и обрабатывают сольвент-детергентной смесью. Как сольвент используют, например, три-н-бутилфосфат, как детергент - полисорбат 80, октоксинол 10, β-пропиолактон и другие поверхностно-активные вещества. Смешивание проводят в реакторе. Например, 0,1 М ацетатный буферный раствор при рН 5,8, который содержит 1 мас.% три-н-бутилфосфата и 1 мас.% полисорбата 80, смешивают с раствором фермента. Смесь перемешивают в течение 6…9 часов при температуре 25°С. Далее смесь разбавляют 0,1 М ацетатным буферным раствором при рН 5,8, который содержит 1 мас.% каприлата натрия, 0,05 М хлорида натрия и пропиленгликоль в количестве 0,2 г/л.

Обработанный фермент иммобилизуют колоночной хроматографией при линейной скорости элюента 2 см/мин на сульфопропилкатионитном сорбенте, который имеет сорбционную емкость 25…30 мг/см³ и зерна фракции 100-200 мкм с диаметром пор 30 нм. Иммобилизированный фермент промывают на сульфопропилкатионитном сорбенте со скоростью 4,5…5 см/мин в течение 80-120 минут. Такое промывание лучше осуществлять в две стадии: на первой стадии 0,1 М ацетатным буферным раствором при рН 5,8, который содержит 1 мас.% каприлата натрия, 0,05 М хлорида натрия и пропиленгликоль в количестве 0,2 г/л; на второй - 0,1 М ацетатным буферным раствором при рН 5,8, который содержит 0,05 М хлорида натрия. Промывание ведут объемом, который соответствует 7-ми объемам сорбента на первой стадии, и объемом, который соответствует трем объемам сорбента на второй стадии.

Элюцию осуществляют 0,1 М ацетатным буферным раствором при рН 5,8, который содержит 0,3 М хлорида натрия. Процесс элюции длится 50…80 мин. Элюат содержит очищенный церулоплазмин, который собирают в стерильную стеклянную тару и подают на ультрафильтрацию.

Ниже приведены примеры, которые демонстрируют способ получения церулоплазмина.

Пример 1.

30 кг осадка IV смешивали с 500 л ацетатного буферного раствора в емкости с мешалкой при температуре 0°С и перемешивали в течение 3 часов. Раствор фильтровали через капроновое сито. Осадок утилизировали. Получили 520 л фильтрата, который с помощью насоса пропускают снизу вверх через хроматографическую колонну, диаметром 400 мм, которая содержит 20 дм³ сорбента с привитой группой ДЕАЕ на стиролдивинилбензольной матрице фракции 200-250 мкм и размером пор 30 нм. Объемная скорость элюента - 100 л/час. Приблизительно через 5 часов в емкости собрали 30 л элюата, который содержит церулоплазмин.

Для проверки эффективности удаления вирусов при реализации предложенного способа использовали модельные вирусы вирусной диареи ВРХ (BVDV), которые были внесены в разбавленный после элюции раствор фермента в количестве 4,5 log₁₀ ТЦЛД₅₀/см³ вируса BVDV.

Согласно требованиям GMP преднамеренное внесение любого вируса в производственные помещения не допускается. Поэтому валидация проводилась в отдельной лаборатории, оборудованной соответствующим образом, с использованием модели производственного процесса.

Разбавленный раствор фермента переносили в реактор, где обрабатывали сольвент-детергентной смесью. Как сольвент-детергентную смесь использовали 0,1 М ацетатный буферный раствор при рН 5,8, который содержит 1 мас.% три-н-бутилфосфата и 1 мас.% полисорбата 80. Смесь перемешивают в течение 7 часов при температуре 25°С. Далее смесь разбавляли 5-ю объемами 0,1 М ацетатного буферного раствора при рН 5,8, который содержит 1 мас.% каприлата натрия, 0,05 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л.

Обработанный фермент колоночной хроматографией (диаметр колонки 14 см) при линейной скорости элюента 2 см/мин иммобилизируют на сульфопропилкатионитном сорбенте, который имеет сорбционную емкость 25 мг/см³ и зерна фракции 100-200 мкм с диаметром пор 30 нм. Полученный раствор утилизировали. Иммобилизированный на сульфопропилкатионитном сорбенте фермент промывали со скоростью 5 см/мин в течение 90 минут в две стадии: на первой стадии 0,1 М ацетатным буферным раствором при рН 5,8, который содержит 1 мас.% каприлата натрия, 0,05 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л; на второй - 0,1 М ацетатным буферным раствором при рН 5,8, который содержит 0,05 М хлорида натрия.

Элюцию осуществляли 0,1 М ацетатным буферным раствором при рН 5,8, который содержит 0,3 М хлорида натрия. Процесс элюции длился 60 мин. Элюат собирали в стерильную стеклянную тару, подвергали ультрафильтрации с последующей стерилизующей фильтрацией.

Получили 20 л раствора церулоплазмина, который имеет содержание белка 30 г с удельной биологической активностью 30 ум.ед./мг.

Выход целевого продукта - 99%, соотношение Е₆₁₀/Е₂₈₀ - 0,045, концентрация белка - 30 мг/мл.

Титр после инактивации показал отсутствие вируса BVDV.

Пример 2.

30 г фракции IV-I смешивали с 450 мл ацетатного буферного раствора в емкости с мешалкой при температуре 3°С и перемешивали в течение 5 часов. Раствор фильтровали через капроновое сито. Осадок утилизировали. Получили 420 мл фильтрата, который с помощью насоса пропускают снизу вверх через хроматографическую колонну диаметром 45 мм, который содержит 200 см³ сорбента с привитой группой ДЕАЕ на стиролдивинилбензольний матрице фракции 200-250 мкм и размером пор 30 нм. Объемная скорость элюента - 1,5 мл/мин. Через 5 часов в емкости собрали 300 мл элюата, который содержит церулоплазмин, который перенесли в реактор с мешалкой и перемешивали в течение 5 часов.

Для проверки эффективности удаления вирусов при реализации предложенного способа использовали модельные вирусы псевдобешенства (PRV), которые были внесены в разбавленный после элюции раствор фермента в количестве ≥5,12 log₁₀ ТЦЛД₅₀/см³ вируса PRV. Валидация проводилась в отдельной лаборатории, оборудованной соответствующим образом, с использованием модели производственного процесса.

Разбавленный раствор фермента с модельным вирусом переносили в емкость, где обрабатывали сольвент-детергентной смесью. Как сольвент-детергентную смесь использовали 0,1 М ацетатный буферный раствор при рН 5,8, который содержит 1 мас.% три-н-бутилфосфата и 1 мас.% полисорбата 80. Смесь перемешивают в течение 9 часов при температуре 25°С. Дальее смесь разбавляли 5-ю объемами 0,1 М ацетатного буферного раствора при рН 5,8, который содержит 1 мас.% каприлата натрия, 0,05 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л.

Обработанный фермент колоночной хроматографией (диаметр колонки 15 мм) при линейной скорости элюента 2 см/мин иммобилизируют на сульфопропилкатионитном сорбенте, который имеет сорбционную емкость 25 мг/см³ и зерна фракции 100-200 мкм с диаметром пор 30 нм. Полученный раствор утилизировали. Иммобилизированный на сульфопропилкатионитном сорбенте фермент промывали со скоростью 5 см/мин в две стадии: на первой стадии 0,1 М ацетатным буферным раствором при рН 5,8, который содержит 1 мас.% каприлата натрия, 0,05 М хлорида натрия и пропиленгликоль в количестве 0,2 г/л; на второй - 0,1 М ацетатным буферным раствором при рН 5,8, который содержит 0,05 М хлорида натрия. Элюцию осуществляли 0,1 М ацетатным буферным раствором при рН 5,8, который содержит 0,3 М хлорида натрия. Через 7 часов получили элюат, который подвергали ультрафильтрации с последующей стерилизующей фильтрацией.

Получили 12 мл раствора церулоплазмина, который имеет содержание белка 470 мг с удельной биологической активностью 30 ум.ед./мг.

Выход целевого продукта - 98%, соотношение Е₆₁₀/Е₂₈₀ - 0,044, концентрация белка - 39 мг/мл.

Титр после инактивации показал отсутствие вируса PRV.

Таким образом, предложенный способ гарантирует вирусобезопасность полученного лекарственного препарата церулоплазмин и позволяет повысить выход целевого церулоплазмина. Из технологии изъяты все стадии центрифугирования.

1. Способ получения церулоплазмина, который включает растворение исходного сырья в ацетатном буферном растворе, сорбцию фермента на ионообменнике с функциональной группой ДЕАЕ, элюцию и последующую очистку, отличающийся тем, что как ионообменник с функциональной группой ДЕАЕ используют сорбент на жесткой стиролдивинилбензольной матрице с привитой группой ДЕАЕ, а при очистке фермент в виде раствора сначала обрабатывают сольвент-детергентной смесью, потом обработанный фермент иммобилизируют на сульфопропилкатионитном сорбенте, промывают ацетатным буфером, который содержит хлорид натрия, и проводят элюцию очищенного фермента.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что сорбцию фермента на сорбенте с жесткой стиролдивинилбензольной матрицей с привитой группой ДЕАЕ проводят с помощью колоночной хроматографии в «кипящем слое».

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что иммобилизацию фермента на сульфопропилкатионитном сорбенте и последующую промывку проводят с помощью колоночной хроматографии.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что сорбент с привитой группой ДЕАЕ имеет зерна фракции 200-250 мкм с размером пор 30 нм.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что сульфопропилкатионитный сорбент имеет зерна фракции 100-200 мкм с диаметром пор 30 нм.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что как сольвент-детергентную смесь используют 0,1 М ацетатный буферный раствор при рН 5,8, который содержит 1 мас.% три-н-бутилфосфата и 1 мас.% полисорбата 80, и обработку ведут путем перемешивания смеси в течение 6-9 ч с последующим разбавлением 0,1 М ацетатным буферным раствором при рН 5,8, который содержит 1 мас.% каприлата натрия, 0,05 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что промывание обработанного фермента, иммобилизированого на сульфопропилкатионитном сорбенте, осуществляют в две стадии, причем на первой стадии используют ацетатный буферный раствор, который содержит хлорид натрия и дополнительно содержит каприлат натрия и пропиленгликоль.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что на первой стадии промывания используют 0,1 М ацетатный буферный раствор при рН 5,8, который содержит 1 мас.% каприлата натрия, 0,05 М хлорида натрия и пропиленгликоль в количестве 0,2 г/л, при этом используют объем, который соответствует 7-ми объемам сорбента, а на второй стадии промывания используют 0,1 М ацетатный буферный раствор при рН 5,8, который содержит 0,05 М хлорида натрия, при этом используют объем, который соответствует трем объемам сорбента, и на первой и второй стадиях промывание ведут со скоростью 4,5-5 см/мин.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что элюцию очищенного фермента осуществляют 0,1 М ацетатным буферным раствором при рН 5,8, который содержит 0,3 М хлорида натрия.