Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии



Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии

 


Владельцы патента RU 2402531:

Яровенко Владимир Николаевич (RU)
Токарская Елизавета Александровна (RU)
Краюшкин Михаил Михайлович (RU)
Гинцбург Александр Леонидович (RU)
Зигангирова Наиля Ахатовна (RU)
Зорина Виктория Владимировна (RU)
Тартаковская Дина Игоревна (RU)

Изобретение относится к новым биологически активным соединениям формулы I, где значения заместителей R, R1, R2 и R3 перечислены в формуле изобретения, и могут быть получены способом, включающим взаимодействие соответствующих хлорацетамидов с предварительно приготовленным раствором элементной серы с морфолином или пиперидином, пропускание полученного раствора монотиооксамидов через слой сорбента и последующее взаимодействие монотиооксамидов с гидразин-гидратом, реакцию полученного соединения с альдегидами в ДМФА при комнатной температуре с последующим осаждением метанолом, дающим хороший выход конечного продукта; полученные соединения обладают высокой эффективностью против патогенных бактерий, характеризуются избирательностью и могут быть использованы для ингибирования секреции III типа у патогенных бактерий. 3 н.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл.

 

Изобретение относится к новым гидразонам тиогидразидов оксаминовых кислот, которые могут быть использованы для подавления патогенных бактерий, в частности воздействовать на систему секреции 3 типа у патогенов.

Проблема антибиотикорезистентности является наиболее острой на данный момент, поскольку отмечено, что ко всем существующим классам антибактериальных препаратов у патогенных бактерий развивается устойчивость в той или иной степени (Сидоренко С.В. Механизмы антибиотикорезистентности / Антибактериальная терапия: Практическое руководство под ред. Страчунского Л.С., Белоусова Ю.Б., Козлова С.Н. - 2000. - М.: Фарммединфо. - 190 с.; Страчунский Л. С., Богданович Т.М. Состояние антибиотикорезистентности в России / Антибактериальная терапия:

Практическое руководство под ред. Страчунского Л.С., Белоусова Ю.Б., Козлова С.Н. - 2000. - М.: Фарммединфо. - 190 с.; Фурлетова Н.М., Карп В.П., Мирская М.А., Никитин А.П. Мониторинг спектра и чувствительности выделяемой микрофлоры в стационаре - МКО-10, 2002; Clatworthy A.E., Pierson E., Hung D.T. Targeting virulence: a new paradigm for antimicrobial therapy - Nature Chemical Biology - 2007. - V.3. - N9. - P.541-548).

Так, например, к группе β-лактамных антибиотиков на данный момент описано более 200 ферментов β-лактамаз, инактивирующих путем гидролиза одну из связей β-лактамного кольца. Согласно статистике такие ферменты встречаются у 60-80% штаммов стафилококков, 30-40% - Escherihia coli, 20% у возбудителей тяжелых нозокомиальных инфекций Enterobacter spp., в результате чего существенно снизилась эффективность цефалоспоринов III и, в последнее время, IV поколений.

Практически у всех грамотрицательных бактерий с течением времени развивается еще один механизм устойчивости к данной группе препаратов: снижение проницаемости внешних структур, в результате мутаций, приводящих к полной или частичной утрате поринов, белков, участвующих в осуществлении динамической связи между бактериями и окружающей средой, в том числе поддерживают структурную целостность клетки, регулируют транспорт питательных веществ и бактерицидных агентов).

Аналогичная ситуация складывается с чувствительностью патогенов к аминогликозидам. Описано более 50 ферментов, инактивирующих данную группу антибиотиков.

Кроме того, используемые в клинической практике антибиотики в большинстве своем эффективно работают против острых инфекций, но не эффективны к хронической стадии инфекционного процесса. Это объясняется тем, что острая и хроническая инфекции - две разные формы взаимодействия патогена и организма хозяина, при которых реализуются две различные стратегии, заложенные в геноме патогена.

В отличие от острой инфекции хроническая инфекция это более сложная система взаимодействия, эволюционно выработанная адаптация, направленная на длительное выживание.

В уровне техники известны соединения, воздействующие на вирулентные свойства патогенных бактерий. Эти соединения подавляют секреторные функции некоторых грамотрицательных бактерий, таких как Yersinia pseudotuberculosis, Salmonella enterica, Pseudomonas aeruginosa, патогенных штаммов E.coli, Chlamydia spp и не вызывают развитие устойчивости к препаратам на их основе. К таким соединениям можно отнести гидразоны, полученные на основе гидразидов бензойных и пиридинкарбоновых кислот (FEBS Letters, 581, (2007) 587-595; Infection and Immunity, 2005, p.3104-3114, Vol.73, No. 5; PNAS, 26, 2006 vol. 103, No.39, 14566-14571)

Однако недостатками этих соединений являются недостаточная растворимость в органических растворителях и значительная токсичность.

Задачей изобретения является создание соединений обладающих хорошей растворимостью в органических растворителях, не являющихся токсичными для нормальной микрофлоры и клеток хозяина, кроме того, к которым не будет развиваться резистентность.

Технический результат, достигаемый заявленной группы изобретений, заключается в получении биологически активных соединений с хорошим выходом, обладающих высокой эффективностью против патогенных бактерий, в том числе при лечении хронических болезней, вызванных патогенными бактериями, и характеризующихся избирательностью, т.е. воздействием только на патогенные бактерии. При этом полученные соединения нетоксичны для клеток человека и животных, они хорошо растворимы в органических растворителях, а также характеризуются специфической активностью в условиях биологических систем воздействия на патогенные бактерии и не вызывают развития резистентности патогенных бактерий.

Технический результат обеспечивается за счет того, что биологически активные соединения представляют собой замещенные производные гидразонов тиогидразидов оксаминовых кислот общей формулы (I):

где R, R1 представляю собой Н; незамещенные алкил С1-С5; пиридинил; фенил, замещенный СН3, Hal, CF3; группу где Х представляет собой S, замещенную алкилом С1-С5, СООН, COOR4;

или группу ; R2, R3 представляют собой Н; незамещенный алкил С1-С5; 2-гидроксициклогексил; фенил, замещенный Hal, NO2, ОН, OR4, a R4 представляет собой незамещенный алкил С1-С4 за исключением соединений

, и

Способ получения заявленных соединений включает взаимодействие соответствующих хлорацетамидов с предварительно приготовленным раствором элементной серы с морфолином или пиперидином, пропускание полученного раствора монотиооксамидов через слой сорбента, последующее взаимодействие монотиооксамидов с гидразингидратом и реакцию полученного соединения с альдегидами в ДМФА при комнатной температуре с последующим осаждением метанолом.

Способ ингибирования секреции III типа у патогенных бактерий, заключающийся в воздействии на бактерии эффективным количеством соединения по п.1. (I).

Данная система секреции III типа выявлена у таксономически далеких микроорганизмов (патогенных бактерий) - возбудителей особо опасных инфекций, таких как Yersinia, Chlamydia, Brucella, Salmonella, Shigella, Hlicobacter и др. Эта система более консервативна и в гораздо меньшей степени подвержена мутациям, как одному из факторов развития антибиотикорезистентности. Следовательно, ингибиторы секреции III типа у патогенов будут оказывать направленное воздействие на механизмы, обуславливающие процесс хронизации инфекции. Кроме того, система III секреции присутствует только у патогенных бактерий, следовательно, ее ингибиторы не токсичны для нормальной микрофлоры человека и клеток хозяина, т.е. характеризуются избирательностью.

Способ получения заявленных соединений включает взаимодействие соответствующих хлорацетамидов с предварительно приготовленным раствором элементной серы с морфолином или пиперидином, пропускание полученного раствора монотиооксамидов через слой сорбента, последующее взаимодействие монотиооксамидов с гидразингидратом, и реакцию полученного соединения с с альдегидами в ДМФА при комнатной температуре с последующим осаждением метанолом по следующей схеме:

Конкретные примеры выполнения группы изобретений.

Пример 1

2-[N'-(2-Гидрокси-бензилиден)-гидразино]-N-пиридин-2-ил-2-тиоксоацетамид (4) (LHC-680).

N-хлорацетил-2-аминопиридин (1).

К раствору 9,4 г (0,1 моль) 2-аминопиридина в 100 мл ДМФА добавляют при охлаждении 8,75 мл (0,11 моль) хлорацетилхлорида, следя за тем, чтобы температура не превышала 20°С. После окончания прибавления раствор перемешивают при комнатной температуре еще 2 часа. Затем выливают реакционную смесь в 600 мл холодной воды и отфильтровывают осадок. Промывают его на фильтре водой и сушат на воздухе.

Выход: N-хлорацетил-2-аминопиридина (1) 11,9 г, (70%). Т. пл. 140-141°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 7,41 (м, 1Н, аром); 8,21 (м, 1Н, аром); 8,07 (м, 1Н, аром); 8,63 (м, 1Н, аром); 4,20 (с, 2Н, CH2Cl); 10,57 (с, 1Н, NH). Найдено (%): С 49.20, Н 4.03, N 16.21. Вычислено (%): С 49.28, Н 4.14, N 16.42. Масс-спектр, m/z: 170.

N(S)-морфолино-N(O)-(пиридино)-тиоксамид (2).

Готовят раствор 4,8 г (0,15 моль) элементной серы в 50 мл ДМФА и добавляют 5 мл (0,06 моль) морфолина. Полученную смесь перемешивают 20-30 минут и при охлаждении добавляют к ней раствор 8,5 г (0,05 моль) хлорацетамида (1) в минимальном количестве ДМФА, следя за тем, чтобы температура не превышала 15°С. Реакционную смесь перемешивают в течение 3-5 часов (контроль по ТСХ). После окончания реакции реакционную смесь пропускают через небольшой слой сорбента, в качестве которого может быть использован силикагель, промывают его 50 мл ДМФА, полученный раствор выливают в воду, экстрагируют этилацетатом, промывают органический слой водой и пропускают через небольшую колонку с силикагелем (элюент-этилацетат). Упаривают этилацетат на роторном испарителе.

Выход: N(S)-морфолино-N(O)-(пиридино)-тиоксамид (2) 8,5 г, (68%). Т. пл. 170-172°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д, J, Гц): 7,41 (м, 1Н, аром); 8,21 (м, 1Н, аром); 8,07 (м, 1Н, аром); 8,63 (м, 1Н, аром); 3,38 (м, 2Н, CH2 морф); 4,12 (м, 2Н, СН2 морф); 10,59 (с, 1Н, NH). Найдено (%): С 52.42, Н 5.10, N 16.55. Вычислено (%): С 52.57, Н 5.21, N 16.72. Масс-спектр, m/z: 251.

2-Гидразино-N-пиридин-2-ил-2-тиоксо-ацетамид (3).

Растворяют 2,5 г (0,01 моль) монотиоксамида (2) в 15 мл ДМФА. При охлаждении и перемешивании добавляют 1 мл (0,02 моль) гидразин-гидрата. Раствор перемешивают при комнатной температуре еще 2 часа. Затем выливают в воду и подкисляют разбавленной соляной кислотой до рН 7. Отфильтровывают осадок и сушат его на воздухе.

Выход: 2-гидразино-N-пиридин-2-ил-2-тиоксо-ацетамида (3) 1,2 г, (60%). Т. пл. 164-165°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 7,41 (м, 1Н, аром); 8,21 (м, 1Н, аром); 8,07 (м, 1Н, аром); 8,63 (м, 1Н, аром); 10,59 (с, 1Н, NH). Найдено (%): С 42.76, Н 4.01, N 28.44. Вычислено (%): С 42.85, Н 4.11, N 28.55. Масс-спектр, m/z: 196.

2-[N'-(2-Гидрокси-бензилиден)-гидразино]-N-пиридин-2-ил-2-тиоксо-ацетамид (4) (LHC-680).

К 196 мг (10 ммоль) тиогидразида оксаминовой кислоты (3) в 1-2 мл ДМФА добавляют 140 мг (11 ммоль) салицилового альдегида в 1 мл ДМФА. Реакционную смесь оставляют на сутки при комнатной температуре, затем добавляют 3 мл метанола, выпавший осадок отфильтровывают и промывают метанолом.

Выход: 2-[N'-(2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-N-пиридин-2-ил-2-тиоксо-ацетамида (4) 150 мг, (50%). Т. пл. 204-205°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 7,02 (м, 4Н, аром); 7,41 (м, 1Н, аром); 8,21 (м, 1Н, аром); 8,07 (м, 1Н, аром); 8,63 (м, 1Н, аром); 10,59 (с, 1Н, NH); 11,92 (с, 1Н, NH т. амид); 12,76 (с, 1Н, ОН фен.). Найдено (%): С 55.79, Н 4.12, N 18.66. Вычислено (%): С 55.99, Н 4.03, N 18.65. Масс-спектр, m/z: 300.

Пример 2.

2[N'-(3,5-Дибромо-2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-N-пиридин-2-ил-2-тиоксо-ацетамид (5) (LHC-679).

К 196 мг (10 ммоль) тиогидразида оксаминовой кислоты (3) (см. пример 1) в 1-2 мл ДМФА добавляют 310 мг (11 ммоль) 3,5-дибром-2-гидроксибензальдегида в 1 мл ДМФА. Реакционную смесь оставляют на сутки при комнатной температуре, затем добавляют 3 мл метанола, выпавший осадок отфильтровывают и промывают метанолом.

Выход: 2-[N'-(3,5-дибромо-2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-N-пиридин-2-ил-2-тиоксо-ацетамида (5) 360 мг, (80 %). Т. пл. 321-322°С (с разл.). ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 7,41 (м, 1Н, аром); 8,21 (м, 1Н, аром); 8,07 (м, 1Н, аром); 8,63 (м, 1Н, аром); 7.02 (с, 1Н аром); 7,3 (с, 1Н, аром); 8,65 (с, 1Н, СН гидразон); 11,29 (с, 1Н NH амид); 11,92 (с, 1Н, NH т. амид); 12,76 (с, 1Н, ОН фен.). Найдено (%): С 36.58, Н 2.01, N 12.34. Вычислено (%): С 36.70, Н 2.20, N 12.23. Масс-спектр, m/z: 458.

Пример 3.

2-[N'-(3,5-Дихлор-2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-N-пиридин-2-ил-2-тиоксо-ацетамид (6).

К 196 мг (10 ммоль) тиогидразида оксаминовой кислоты (3) в 1-2 мл ДМФА добавляют 209 мг (11 ммоль) 3,5-дихлор-2-гидроксибензальдегида в 1 мл ДМФА. Реакционную смесь оставляют на сутки при комнатной температуре, затем добавляют 3 мл метанола, выпавший осадок отфильтровывают и промывают метанолом.

Выход: 2-[N'-(3,5-дихлор-2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-N-пиридин-2-ил-2-тиоксо-ацетамида (6) 309 мг, (84%). Т. пл. 314-315°С (с разл.). ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д, J, Гц): 7,41 (м, 1Н, аром); 8,20 (м, 1Н, аром); 8,06 (м, 1Н, аром); 8,64 (м, 1Н, аром); 7.01 (с, 1Н аром); 7,3 (с, 1Н, аром); 8,65 (с, 1Н, СН гидразон); 11,29 (с, 1Н, NH амид); 11,92 (с, 1Н, NH т.амид); 12,74 (с, 1Н, ОН фен.). Найдено (%): С 45.44, Н 2.62, N 15.06. Вычислено (%): С 45.54, Н 2.73, N 15.17. Масс-спектр, m/z: 369.

Пример 4.

2-[N'-(2-Гидрокси-3-этокси-бензилиден)-гидразино]-N-пиридин-2-ил-2-тиоксо-ацетамид (7) (LHC-681).

К 196 мг (10 ммоль) тиогидразида оксаминовой кислоты (3) в 1-2 мл ДМФА добавляют 182 мг (11 ммоль) 3-этокси-2-гидроксибензальдегида в 1 мл ДМФА. Реакционную смесь оставляют на сутки при комнатной температуре, затем добавляют 3 мл метанола, выпавший осадок отфильтровывают и промывают метанолом.

Выход: 2-[N'-(2-гидрокси-3-этокси-бензилиден)-гидразино]-N-пиридин-2-ил-2-тиоксо-ацетамида (7) 240 мг, (70%). Т. пл. 194-195°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 1.32 (м, 3Н, СН3); 2,81 (м, 2Н, CH2); 7,41 (м, 1Н, аром); 8,21 (м, 1Н, аром); 8,07 (м, 1Н, аром); 8,63 (м, 1Н, аром); 7.01 (м, 1Н аром); 7,10 (м, 1Н, аром); 7,02 (с, СН аром); 8,6 (с, 1Н, СН гидразон); 10,88 (с, 1Н, NH амид); 11,91 (с, 1Н, NH т. амид). 12,70 (с, 1Н, ОН фен.). Найдено (%): С 55.72, Н, 4.59, N 16.15. Вычислено (%): С 55.80, Н, 4.68, N 16.27. Масс-спектр, m/z: 344.

Пример 5.

2-[N'-(2-Гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-N-о-толил-ацетамид (8).

N-хлорацетил-2-метиланилин (9).

К раствору 10,7 г (0,1 моль) 2-метиланилина в 100 мл ДМФА добавляют при охлаждении 8,75 мл (0,11 моль) хлорацетилхлорида, следя за тем, чтобы температура не превышала 20°С. После окончания прибавления раствор перемешивают при комнатной температуре еще 2 часа. Затем реакционную смесь выливают в 600 мл холодной воды и отфильтровывают осадок. Промывают его на фильтре водой и сушат на воздухе.

Выход: N-хлорацетил-2-метиланилина (9) 15,5 г, (85%). Т. пл. 124-126°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д, J, Гц): 1,74 (с, 3Н, СН3); 7,41 (м, 1Н, аром); 7,21 (м, 1Н, аром); 7,07 (м, 1Н, аром); 7,63 (м, 1Н, аром); 4,20 (с, 2Н, CH2Cl); 10,57 (с, 1Н, NH). Найдено (%) 58.76, Н 5.37, N 7.54. Вычислено (%): С 58.87, Н 5.49, N 7.63. Масс-спектр, m/z: 183.

2-Гидразино-2-тиоксо-N-о-толил-ацетамид (10).

Метод А. Готовят раствор 0,15 моль элементной серы в 50 мл ДМФА и добавляют 5 мл (0,06 моль) морфолина. Полученную смесь перемешивают 20-30 минут и добавляют к ней раствор 9,15 г (0,05 моль) хлорацетамида (9) в минимальном количестве ДМФА, при охлаждении, следя за тем, чтобы температура не превышала 15°С. Полученную смесь перемешивают 3-4 часа (контроль по ТСХ). После окончания реакции реакционную смесь пропускают через слой силикагеля. К полученному раствору добавляют 6 мл (0,12 моль) гидразин-гидрата и перемешивают при комнатной температуре 2 часа. Затем раствор выливают в воду и подкисляют разбавленной соляной кислотой до рН 7. Отфильтровывают осадок и сушат его на воздухе.

Выход; 2-гидразино-2-тиоксо-N-о-толил-ацетамида (10) 10,4 г (60%). Т. пл. 154-155°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 1,74 (с, 3Н, СН3); 7,41 (м, 1Н, аром); 7,21 (м, 1Н, аром); 7,07 (м, 1Н, аром); 7,63 (м, 1Н, аром); 10,59 (с, 1Н, NH). Найдено: С 51.54, Н 5.18, N 20.02. Вычислено: С 51.66, Н 5.30, N 20.08. Масс-спектр, m/z: 209.

Метод Б.

Готовят раствор 4,8 г (0,15 моль) элементной серы в 50 мл ДМФА и добавляют 5 мл (0,06 моль) пиперидина. Полученную смесь перемешивают 20-30 минут и, при охлаждении, добавляют к ней раствор 8,5 г (0,05 моль) хлорацетамида (9) в минимальном количестве ДМФА, следя за тем, чтобы температура не превышала 10°С. Полученную смесь перемешивают 3-5 часов (контроль по ТСХ). После окончания реакции реакционную смесь пропускают через небольшой слой силикагеля. К полученному раствору при охлаждении и перемешивании добавляют 5 мл (0,1 моль) гидразин-гидрата. Раствор перемешивают при комнатной температуре еще 2 часа. Затем выливают в воду и подкисляют разбавленной соляной кислотой до рН 6. Отфильтровывают осадок и сушат его на воздухе.

Выход: 2-гидразино-2-тиоксо-N-о-толил-ацетамида (10) 6,0 г, (62%). Т. пл. 154-155°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 1,74 (с, 3Н, СН3); 7,41 (м, 1Н, аром); 7,21 (м, 1Н, аром); 7,07 (м, 1Н, аром); 7,63 (м, 1Н, аром); 10,59 (с, 1Н, NH). Найдено: С 51.54, Н 5.18, N 20,19. Вычислено: С 51.66, Н 5.30, N 20.08. Масс-спектр, m/z: 209.

2-[N'-(2-Гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-N-о-толил-ацетамид (8).

К 209 мг (10 ммоль) тиогидразида оксаминовой кислоты (10) в 1-2 мл ДМФА добавляют 140 мг (11 ммоль) салицилового альдегида в 1 мл ДМФА. Реакционную смесь оставляют на сутки при комнатной температуре, затем добавляют 3 мл метанола. Выпавший осадок отфильтровывают и промывают метанолом.

Выход: 2-[N'-(2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-N-о-толил-ацетамида (8) 156 мг, (50%). Т. пл. 215-217°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 1,74 (с, 3Н, СН3); 7,02 (м, 4Н, аром); 7,41 (м, 1Н, аром); 7,21 (м, 1Н, аром); 7,07 (м, 1Н, аром); 7,63 (м, 1Н, аром); 10,59 (с, 1Н, NH); 11,92 (с, 1Н, NH т.амид); 12,76; (с, 1Н, ОН фен.). Найдено: С 61.23, Н 4.71, N 13.30. Вычислено: С 61.32, Н 4.82, N 13.41. Масс-спектр, m/z: 313.

Пример 6.

N-(4-Фтор-фенил)-2-[N'-(2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-ацетамид (11).

N-хлорацетил-4-фторанилин (12).

К раствору 11,1 г (0,1 моль) 4-фторанилина в 100 мл ДМФА добавляют при охлаждении 8,75 мл (0,11 моль) хлорацетилхлорида, следя за тем, чтобы температура не превышала 20°С. После окончания добавления хлорацетилхлорида раствор перемешивают при комнатной температуре еще 2 часа. Затем реакционную смесь выливают в 600 мл холодной воды и отфильтровывают осадок. Промывают его на фильтре водой и сушат на воздухе.

Выход: N-хлорацетил-4-фторанилина (12) 14,96 г (80%). Т. пл. 110-112°С. ЯМР 1Н DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 7,21 (д, 2Н, аром); 7,07 (д, 2Н, аром); 4,20 (с, 2Н, CH2Cl). Найдено (%): С 51.11, Н 3.63, N 7.36. Вычислено (%): С 51.22, Н 3.76, N 7.47. Масс-спектр, m/z: 187.

N-(4-Фтор-фенил)-2-гидразино-2-тиоксо-ацетамид (13).

Метод А

Готовят раствор 0,15 моль элементной серы в 50 мл ДМФА и добавляют 0,06 моль морфолина. Полученную смесь перемешивают 20-30 минут и добавляют к ней раствор 9,37 г (0,05 моль) хлорацетамида (12) в минимальном количестве ДМФА, при охлаждении, следя за тем, чтобы температура не превышала 15°С. Полученную смесь перемешивают 3-10 часов (контроль по ТСХ). После окончания реакции реакционную смесь пропускают через слой силикагеля. К полученному раствору добавляют 6 мл (0,12 моль) гидразин-гидрата и перемешивают при комнатной температуре 2 часа. Затем выливают в воду и подкисляют разбавленной соляной кислотой до рН 7. Отфильтровывают осадок и сушат его на воздухе.

Выход: N-(4-фтор-фенил)-2-гидразино-2-тиоксо-ацетамида (13) 6,4 г (60%). Т. пл. 154-155°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 7,21 (д, 2Н, аром); 7,07 (д, 2Н, аром); 10,59 (с, 1Н, NH). Найдено (%): С 51.54, Н 5.18, N 20,00. Вычислено (%): С 45.06, Н 3.78, N 19,71. Масс-спектр, m/z: 213.

Метод Б

Готовят раствор 4,8 г (0,15 моль) элементной серы в 50 мл ДМФА и добавляют 5 мл (0,06 моль) пиперидина. Полученную смесь перемешивают 20-30 минут и, при охлаждении, добавляют к ней раствор 9,37 г (0,05 моль) хлорацетамида (12) в минимальном количестве ДМФА, следя за тем, чтобы температура не превышала 10°С. Полученную смесь перемешивают 3-5 часов (контроль по ТСХ). После окончания реакции реакционную смесь пропускают через небольшой слой силикагеля. К полученному раствору при охлаждении и перемешивании добавляют 5 мл (0,1 моль) гидразин-гидрата. Раствор перемешивают при комнатной температуре еще 2 часа. Затем выливают в воду и подкисляют разбавленной соляной кислотой до рН 6. Далее отфильтровывают осадок и сушат его на воздухе.

Выход: N-(4-фтор-фенил)-2-гидразино-2-тиоксо-ацетамида (13) 6,4 г, (60%). Т. пл. 154-155°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 7,21 (д, 2Н, аром); 7,07 (д, 2Н, аром); 10,59 (с, 1Н, NH). Найдено (%): С 51.54, Н 5.18, N 20,00. Вычислено (%): С 45.06, Н 3.78, N 19,71. Масс-спектр, m/z: 213.

N-(4-Фтор-фенил)-2-[N'-(2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-ацетамид (11).

К 213 мг (10 ммоль) тиогидразида оксаминовой кислоты (13) в 0,5 мл ДМФА добавляют 11 ммоль салицилового альдегида в 1 мл метанола. Реакционную смесь оставляют на сутки при комнатной температуре. Затем к реакционной смеси добавляют 2 мл метанола и охлаждают ее до -5°С. Осадок отфильтровывают и промывают небольшим количеством ледяного метанола.

Выход: N-(4-фтор-фенил)-2-[N'-(2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-ацетамида (11) 158 мг, (50%). Т. пл. 215-217°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 1.32 (м, 3Н, СН3); 2,81 (м, 2Н, CH2); 7,21 (д, 2Н, аром); 7,07 (д, 2Н, аром); 7,21 (м, 1Н, аром); 7,07 (м, 1Н, аром); 7,63 (м, 1Н, аром); 10,59 (с, 1Н, NH); 11,92 (с, 1Н, NH т.амид). 12,76 (с, 1Н, ОН фен.). Найдено (%): С 56.05, Н 3.70, N 13.32. Вычислено (%): С 56.77, Н 3.81, N 13.24. Масс-спектр, m/z: 317.

Пример 7.

2-[N'-(2-Гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-N-(4-трифторметил-фенил)-ацетамид (12) (LHC-710).

N-хлорацетил-2-трифторметиланилин(13).

К раствору 16,1 г (0,1 моль) 2-трифторметиланилина в 100 мл ДМФА добавляют, при охлаждении, 8,75 мл (0,11 моль) хлорацетилхлорида, следя за тем, чтобы температура не превышала 20°С. После окончания прибавления раствор перемешивают при комнатной температуре еще 2 часа. Затем выливают реакционную смесь в 600 мл холодной воды и отфильтровывают осадок. Далее промывают его на фильтре водой и сушат на воздухе.

Выход: N-хлорацетил-2-трифторметиланилина (13) 20,1 г, (85%). Т. пл. 134-136°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 7,62 (м, 1Н, аром); 7,57 (м, 1Н, аром); 7,35 (м, 1Н, аром); 7,62 (м, 1Н, аром); 4,22 (с, 2Н, CH2Cl); 10,55 (с, 1Н, NH). Найдено (%): С 45.40, Н 2.86, N 5.78. Вычислено (%): С 45.49, Н 2.97, N 5.89. Масс-спектр, m/z: 237.

2-Гидразино-2-тиоксо-N-(4-трифторметил-фенил)-ацетамид (14).

Готовят раствор 0,15 моль элементной серы в 50 мл ДМФА и добавляют 5 мл (0,06 моль) морфолина. Полученную смесь перемешивают 20-30 минут и добавляют к ней раствор 11,85 г (0,05 моль) хлорацетамида (13) в минимальном количестве ДМФА, при охлаждении, следя за тем, чтобы температура не превышала 15°С. Полученную смесь перемешивают 3-4 часа (контроль по ТСХ). После окончания реакции, реакционную смесь пропускают через слой силикагеля. К полученному раствору добавляют 6 мл (0,12 моль) гидразин-гидрата и перемешивают при комнатной температуре 2 часа. Затем раствор выливают в воду и подкисляют разбавленной соляной кислотой до рН 7. Отфильтровывают осадок и сушат его на воздухе.

Выход: 2-гидразино-2-тиоксо-N-(4-трифторметил-фенил)-ацетамида (14) 7,89 г, (60%). Т. пл. 163-164°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 7,63 (м, 1Н, аром); 7,58 (м, 1Н, аром); 7,34 (м, 1Н, аром); 7,61 (м, 1Н, аром); 10,59 (с, 1Н, NH). Найдено: С 40.90, Н 3.15, N 15.83. Вычислено: С 41.06, Н 3.06, N 15.96. Масс-спектр, m/z: 263.

2-[N'-(2-Гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-N-(4-трифторметил-фенил)-ацетамид (12).

К 263 мг (10 ммоль) тиогидразида оксаминовой кислоты (14) в 1-2 мл ДМФА добавляют 140 мг (11 ммоль) салицилового альдегида в 1 мл ДМФА. Реакционную смесь оставляют на сутки при комнатной температуре, затем добавляют 3 мл метанола. Выпавший осадок отфильтровывают и промывают метанолом.

Выход: 2-[N'-(2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-N-(4-трифторметил-фенил)-ацетамида (12) 183 мг, (50%). Т. пл. 215-217°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 7,63 (м, 1Н, аром); 7,58 (м, 1Н, аром); 7,34 (м, 1Н, аром); 7,61 (м, 1Н, аром); 7,21 (м, 1Н, аром); 7,07 (м, 1Н, аром); 7,63 (м, 1Н, аром); 10,59 (с, 1Н, NH); 11,93 (с, 1Н, NH т. амид); 12,76 (с, 1Н, ОН фен.). Найдено: С 61.23, Н 4.71, N 13.50. Вычислено: С 52.31, Н 3.29, N 11.44. Масс-спектр, m/z: 367.

Пример 8.

5-Этил-2-[(2-гидрокси-бензилиден-гидразинооксотиоацетил)-амино]-тиофен-3-карбоновой кислоты этиловый эфир (15) (LHC-536).

N-хлорацетил-3-карбэтокси-3-этил-тиофен (16).

К раствору 19,9 г (0,1 моль) 2-амино-3-карбэтокси-5-этилтиофена (J. Heterocycl. Chem. Vol.36, (1999), p.333-345) в 100 мл ДМФА добавляют при охлаждении 8,75 мл (0,11 моль) хлорацетилхлорида, следя за тем, чтобы температура не превышала 20°С. После окончания прибавления раствор перемешивают при комнатной температуре еще 2 часа. Затем реакционную смесь выливают в 600 мл холодной воды и отфильтровывают осадок. Промывают его на фильтре водой и сушат на воздухе.

Выход: N-хлорацетил-3-карбэтокси-5-этил-тиофена (16) 23,4 г, (85%). Т. пл. 123-125°С (EtOH). Спектр ЯМР 1H (δ, м.д., J, Гц): 1,27 (м, 3Н, СН3); 1,30 (м, 3Н, СН3); 2,45 (м, 2Н, CH2); 4,43 (м, 2Н, CH2); 4,3 (с, 2Н, CH2Cl); 7,53 (с, 1Н, тиофен); 10,65 (с, 1Н, NH). Найдено (%): С 47.92, Н 5.11, N 5.07. Вычислено (%): С 47.81, Н 5.22, N 5.00. Масс-спектр, m/z: 275.

5-Этил-2-(гидразинооксотиоацетил-амино)-тиофен-3-карбоновой кислоты этиловый эфир (17).

Готовят раствор 4,8 г (0,15 моль) элементной серы в 50 мл ДМФА и добавляют 5,1 мл (0,06 моль) морфолина. Полученную смесь перемешивают 20-30 минут и добавляют к ней, при охлаждении, раствор 13,75 г (0,05 моль) хлорацетамида (16) в минимальном количестве ДМФА, следя за тем, чтобы температура не превышала 15°С. Полученную смесь перемешивают 3-10 часов (контроль по ТСХ). После окончания реакции реакционную смесь пропускают через слой силикагеля. К полученному раствору добавляют 6 мл (0,12 моль) гидразин-гидрата и перемешивают его при комнатной температуре 2 часа. Затем раствор выливают в воду и подкисляют разбавленной соляной кислотой до рН 7. Отфильтровывают осадок и сушат его на воздухе.

Выход: 5-этил-2-(гидразинооксотиоацетил-амино)-тиофен-3-карбоновой кислоты этилового эфира (17) 8,6 г, (57%). Т. пл. 152-154°С. Спектр ЯМР 1H (δ, м.д., J, Гц): Спектр ЯМР 1H (δ, м.д., J, Гц): 1.2 (т, 3Н, СН3); 1.4 (т, 3Н, СН3); 2.8 (м, 3Н, СН3); 4.3 (м, 3Н, СН3); 7.10 (с, 1Н, Н аром.); 12.40 (с, 1Н, NH). Найдено (%): С 43.80, Н 5.87, N 14.11. Вычислено (%): С 43.84, Н 5.02, N 13.94. Масс-спектр, m/z: 301.

5-Этил-2-[(2-гидрокси-бензилиден-гидразинооксотиоацетил)-амино]-тиофен-3-карбоновой кислоты этиловый эфир (15) (LHC-536).

К 300 мг (10 ммоль) тиогидразида оксаминовой кислоты (16) в 1-2 мл ДМФА добавляют 140 мг (11 ммоль) салицилового альдегида в 1 мл ДМФА. Реакционную смесь оставляют на сутки при комнатной температуре, затем добавляют 3 мл метанола. Выпавший осадок отфильтровывают и промывают метанолом.

Выход: 5-этил-2-[(2-гидрокси-бензилиден-гидразинооксотиоацетил)-амино]-тиофен-3-карбоновой кислоты этилового эфира (15) 364 мг, (90%). Т. пл. 189-190°С. Спектр ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 1.2 (т, 3Н, СН3); 1.4 (т, 3Н, СН3); 2.8 (м, 3Н, СН3); 4.3 (м, 3Н, СН3); 7.05 (м, 4Н, Н аром); 7.10 (с, 1Н, Н аром.); 7.35 (с, 1Н); 12.40 (с, 1Н, NH). Найдено (%): С 53.23, Н 4.81, N 10.25. Вычислено (%): С 53.32, Н 4.72, N 10.36.

Пример 9

5-Этил-2-[(2-гидрокси-бензилиден-гидразиноксотиоацетил)-амино]-тиофен-3-карбоновая кислота (18) (LHC-587).

2-N-хлорацетил-3-карбокси-5-этилтиофен (19).

К раствору 17,1 г (0,1 моль) 2-амино-3-карбокси-5-этилтиофена (полученного щелочным гидролизом 2-амино-3-карбэтокси-5-этилтиофена аналогично методике, приведенной в патенте US 4159377, опубл. 26.06.1979, патентообладатель MEAD JOHNSON & СО в 100 мл ДМФА добавляют при охлаждении 8,75 мл (0,11 моль) хлорацетилхлорида, следя за тем, чтобы температура не превышала 20°С. После окончания добавления хлорацетилхлорида полученный раствор перемешивают при комнатной температуре еще 2 часа. Затем выливают реакционную смесь в 600 мл холодной воды и отфильтровывают осадок. Промывают его на фильтре водой и сушат на воздухе.

Выход: 2-N-хлорацетпил-3-карбокси-5-этилтиофена (19) 19,7 г, (80%). Т. пл. 133-134°С (EtOH). Спектр ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 1,27 (м, 3Н, СН3); 2,45 (м, 2Н, СН2); 4,3 (с, 2Н, CH2Cl); 7,53 (с, 1Н, тиофен); 10,65 (с, 1Н, NH), 14.10 (с, 1Hкарб.). Найдено (%): С 43.55, Н 4.16, N 5.54. Вычислено (%): С 43.64, Н 4.07, N 5.65. Масс-спектр, m/z: 247.

5-Этил-2-(гидразиноксотиоацетил-амино)-тиофен-3-карбоновая кислота (20).

Готовят раствор 4,8 г (0,15 моль) элементной серы в 50 мл ДМФА и добавляют 5,1 мл (0,06 моль) морфолина. Полученную смесь перемешивают 20-30 минут и добавляют к ней раствор 12,35 г (0,05 моль) хлорацетамида (19) в минимальном количестве ДМФА, при охлаждении, следя за тем, чтобы температура не превышала 15°С. Полученную смесь перемешивают 3-10 часов (контроль по ТСХ). После окончания реакции реакционную смесь пропускают через слой силикагеля. К полученному раствору добавляют 6 мл (0,12 моль) гидразин-гидрата и перемешивают раствор при комнатной температуре 2 часа. Затем раствор выливают в воду и подкисляют разбавленной соляной кислотой до рН 7. Отфильтровывают осадок и сушат его на воздухе.

Выход: 5-этил-2-(гидразиноксотиоацетил-амино)-тиофен-3-карбоновой кислоты (20) 8,2 г, (60%). Т. пл. 180-182°С. Спектр ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д, J, Гц): 1.2 (т, 3Н, СН3); 2.8 (м, 2Н, CH2); 7.10 (с, 1Н, Н аром.); 12.40 (с, 1Н, NH); 14.05 (с, 1Hкарб.). Найдено (%): С 39.46, Н 4.12, N 15.66. Вычислено (%): С 39.55, Н 4.06, N 15.37. Масс-спектр, m/z: 273.

5-Этил-2-[(2-гидрокси-бензилиден-гидразиноксотиоацетил)-амино]-тиофен-3-карбоновая кислота (18) (LHC-587).

К 273 мг (10 ммоль) тиогидразида оксаминовой кислоты (20) в 1-2 мл ДМФА добавляют 140 мг (11 ммоль) салицилового альдегида в 1 мл ДМФА. Реакционную смесь оставляют на сутки при комнатной температуре. Затем добавляют 3 мл метанола. Выпавший осадок отфильтровывают и промывают метанолом.

Выход: 5-этил-2-[(2-гидрокси-бензилиден-гидразиноксотиоацетил)-амино]-тиофен-3-карбоновой кислоты (18) 263 мг, (70%). Т. пл. 205-206°С. Спектр ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 7.05 (м, 4Н, Н аром); 7.10 (с, 1Н, Н аром.); 7.35 (с, 1Н); 12.40 (с, 1Н, NH); 14.07 (с, 1Hкарб. уширен.). Найдено (%): С 50.83, Н 4.16, N 11.21. Вычислено (%): С 50.92, H 4.01, N 11.13.

Пример 10

N,N-Диэтил-2-[N'-(2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-ацетамид (21)

2-Хлор-N,N-диэтилацетамид (22)

К 7,3 г (0,1 моль) диэтиламина в 50 мл хлористого метилена добавляют 10 г (0,1 моль) триэтиламина. Затем при охлаждении добавляют 12 г (0,11 моль) хлорацетилхлорида. После окончания реакции (контроль по ТСХ) полученную смесь выливают в 300 мл холодной воды. Органический слой отделяют, водный слой экстрагируют хлористым метиленом 2×50 мл. Объединенные органические слои промывают разбавленной соляной кислотой, затем водой, сушат над сульфатом натрия и упаривают на роторном испарителе.

Выход: 2-хлор-N,N-диэтилацетамида (22) 10,4 г, (70%). (маслообразный продукт) ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц); 2,41 (м, 4Н, СН2); 1,44 (т, 6Н, СН3); 4,20 (с, 2Н, CH2Cl). Найдено (%): С 48.08, Н 8.15, N 9,24. Вычислено (%): С 48.17, Н 8.08, N 9,36. Масс-спектр, m/z: 149.

N,N-Диэтил-2-гидразино-2-тиоксоацетамид (23).

Готовят раствор 0,15 моль элементной серы в 50 мл ДМФА и добавляют 0,06 моль морфолина. Полученную смесь перемешивают 20-30 минут и добавляют к ней при охлаждении раствор 7,45 г (0,05 моль) хлорацетамида (22) в минимальном количестве ДМФА, следя за тем, чтобы температура не превышала 15°С. Полученную смесь перемешивают 3-5 часов (контроль по ТСХ). После окончания реакции реакционную смесь пропускают через слой силикагеля. К полученному раствору добавляют 6 мл (0,12 моль) гидразин-гидрата и перемешивают при комнатной температуре 2 часа. Затем раствор выливают в воду и подкисляют разбавленной соляной кислотой до рН 7. Отфильтровывают осадок и сушат его на воздухе.

Выход: N,N-диэтил-2-гидразино-2-тиоксоацетамида (23) 5,7 г, (50%). Т. пл. 45-46°С ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д, J, Гц); 2,42 (м, 4Н, СН2); 1,47 (т, 6Н, СН3); 11,20 (с, 1Н, NH). Найдено (%): С 41.01, Н 7.39, N 24,02. Вычислено (%): С 41.12, Н 7.48, N 23,98. Масс-спектр, m/z: 175.

N,N-Диэтил-2-[N'-(2-гидрокси-бензилиден)-гидразино}-2-тиоксо-ацетамид (21).

К 175 мг (10 ммоль) тиогидразида оксаминовой кислоты (23) в 1-2 мл ДМФА добавляют 130 мг (11 ммоль) салицилового альдегида в 1 мл ДМФА. Реакционную смесь оставляют на сутки при комнатной температуре, затем добавляют 3 мл метанола. Выпавший осадок отфильтровывают и промывают метанолом.

Выход: N,N-диэтил-2-[N'-(2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-ацетамида (21) 139 мг, (50%). Т. пл. 154-155°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц); 7,02 (м, 4Н, аром); 2,42 (м, 4Н, СН2); 1,47 (т, 6Н, СН3); 11,92 (с, 1H, NH т. амид); 12,76 (с, 1Н, ОН фен.). Найдено: С 55.77, Н 6.04, N 15.13. Вычислено: С 55.89, Н 6.13, N 15.04. Масс-спектр, m/z: 279.

Пример 11

2-[N'-(2-Гидрокси-циклогексилметилен)-гидразино]-2-тиоксо-N-о-толил-ацетамид (24).

К 209 мг (10 ммоль) тиогидразида оксаминовой кислоты (10) в 1-2 мл ДМФА добавляют 132 мг (11 ммоль) 2-гидроксициклогексанкарбальдегида (Journal of Organic Chemistry; 51; 13; 1986; 2596-2599) в 1 мл ДМФА. Реакционную смесь оставляют на сутки при комнатной температуре, затем добавляют 3 мл метанола. Выпавший осадок отфильтровывают и промывают метанолом.

Выход: 2-[N'-(2-гидрокси-циклогексилметилен)-гидразино]-2-тиоксо-N-о-толил-ацетамида (24) 159 мг, (50%). Т. пл. 111-113 ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц); 1,74 (с, 3Н, СН3); 1,42 (м, 4Н, цг); 1,63 (м, 2Н, цг); 2,24 (м, 2Н, цг); 7,41 (м, 1Н, аром); 7,21 (м, 1Н, аром); 7,07 (м, 1Н, аром); 7,63 (м, 1Н, аром); 10,59 (с, 1Н, NH); 11,92 (с, 1Н, NH т. амид); 12,76 (с, 1Н, ОН фен.). Найдено: С 60.07, Н 6.50, N 13.24. Вычислено: С 60.16, Н 6.63, N 13.15. Масс-спектр, m/z: 319.

Пример 12

2-{N'-(2-Гидрокси-5-нитро-фенил)-этилиден]-гидразино}-2-тиоксо-]-N-о-толил-ацетамид (25)

К 209 мг (10 ммоль) тиогидразида оксаминовой кислоты (10) в 1 мл ДМФА и 1 мл этанола добавляют 199 мг (11 ммоль) 1-(2-гидрокси-5-нитрофенил)этанона (Journal of the University of Bombay, Science: Physical Sciences, Mathematics, Biological Sciences and Medicine; 25/A; 1957; 8, 11). Реакционную смесь кипятят в течение 3-х часов. После охлаждения осадок отфильтровывают и промывают его холодным метанолом 2х5 мл. Затем высушивают его на воздухе.

Выход: 2-{N'-[1-(2-гидрокси-5-нитро-фенил)-этилиден]-гидразино}-2-тиксо-N-o-толил-ацетамида (25) 149 мг, (40%). Т. пл. 214-215 ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц); 2,75 (с, 3Н, СН3) 1,74 (с, 3Н, СН3); 7,02 (м, 3Н, аром); 7,41 (м, 1Н, аром); 7,21 (м, 1Н, аром); 7,07 (м, 1Н, аром); 7,63 (м, 1Н, аром); 10,59 (с, 1Н, NH); 11,92 (с, 1Н, NH т. амид); 12,76 (с, 1Н, ОН фен.). Найдено: 54.70, Н 4.24, N 15.20. Вычислено: С 54.83, Н 4.33, N 15.04. Масс-спектр, m/z: 372.

Пример 13

N-(3-Циано-2-фенил-5,6,7,8-тетрагидро-бензо[4,5]тиено[2,3-b]пиридин-4-ил)-2-[N'-(3,5-дибром-2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-ацетамид (26)

4-Амино-2-фенил-5,6,7,8-тетрагидро[1]бензотиено[2,3-b]пиридин-3-карбонитрил (27)

Синтез соединения (27) проводят по методике, описанной в J. Heterocyclic. Chem. 44, 561, (2007). Смесь, состоящую из 1,78 г (10 ммоль) 2-амино-4,5,6,7-тетрагидро-1-бензотиофен-3-кабонитрила и 1,45 г (10 ммоль) 3-оксо-3-фенилпропанонитрила в 20 мл ДМФА и 1 мл пиперидина, кипятят в течение 3-х часов. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь выливают в холодную воду, фильтруют образовавшийся продукт и перекристаллизовывают из этанола.

Выход: 4-амино-2-фенил-5,6,7,8-тетрагидро[1]бензотиено[2,3-b]пиридин-3-карбонитрила (27) 2,22 г, (73%). Т.пл. 113-115°С; ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д, J, Гц); 1,41-1,56 (м, 8Н, СН2); 7,54-7,68 (м, 5Н, СН). Найдено (%): С 70.67, Н 4.80, N 13.64. Вычислено (%): С 70.79, Н 4.95, N 13.76. Масс-спектр, m/z: 305.

2-Хлор-N-(3-циан-2-фенил-5,6,7,8-тетрагидро-бензо[4,5]тиено[2,3-b]пиридин-4-ил)-ацетамид (28).

К 30,5 г (0,1 моль) амина (27) в 50 мл хлористого метилена добавляют 10 г (0,1 моль) триэтиламина. Затем, при охлаждении, добавляют 12 г (0,11 моль) хлорацетилхлорида. После окончания реакции (контроль по ТСХ) полученный раствор выливают в 300 мл холодной воды. Органический слой отделяют, водный слой экстрагируют хлористым метиленом 2×50 мл. Объединенные органические слои промывают разбавленной соляной кислотой, затем водой, сушат над сульфатом натрия и упаривают на роторном испарителе.

Выход: 2-хлор-N-(3-циан-2-фенил-5,6,7,8-тетрагидро-бензо[4,5]тиено[2,3-b]пиридин-4-ил)-ацетамида (28) 31,6 г, (83%). Т.пл. 146-148°С; ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц); 1,41-1,58 (м, 8Н, СН2); 4,20 (с, 2Н, CH2Cl); 7,56-7,70 (м, 5Н, СН). Найдено (%): С 62.78, Н 4.10, N 11.12. Вычислено (%): С 62.90, Н 4.22, N 11.00. Масс-спектр, m/z: 381.

N-(3-Циано-2-фенил-5,6,7,8-тетрагидро-бензо[4,5]тиено[2,3-b]пиридин-4-ил)-2-гидразино-2-тиоксо-ацетамид (29).

Готовят раствор 0,15 моль серы в 50 мл ДМФА и добавляют 0,06 моль морфолина. Полученную смесь перемешивают 20-30 минут и добавляют к ней раствор 19,1 г (0,05 моль) хлорацетамида (28) в минимальном количестве ДМФА при охлаждении, следя за тем, чтобы температура не превышала 15°С. Полученную смесь перемешивают 3-5 часов (контроль по ТСХ). Затем реакционную смесь пропускают через небольшой слой силикагеля и при охлаждении и перемешивании добавляют 0,1 моль гидразин-гидрата. Полученный раствор при комнатной температуре перемешивают 2 часа. Затем выливают в воду и подкисляют до рН 7. Отфильтровывают осадок и сушат его на воздухе.

Выход: N-(3-циано-2-фенил-5,6,7,8-тетрагидро-бензо[4,5]тиено[2,3-b]пиридин-4-ил)-2-гидразино-2-тиоксо-ацетамида (29) 14,3 г, (70%).

Т.пл. 140-142°С; ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д, J, Гц); 1,40-1,56 (м, 8Н, СН2); 7,56-7,70 (м, 5Н, СН); 11,20 (с, 1Н, NH). Найдено (%): С 58.83, Н 4.13, N 17.27. Вычислено (%): С 58.95, Н 4.20, N 17.19. Масс-спектр, m/z: 407.

N-(3-Циано-2-фенил-5,6,7,8-тетрагидро-бензо[4,5]тиено[2,3-b]пиридин-4-ил)-2-[N'-(3,5-дибром-2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-ацетамид (26)

К раствору 407,5 мг (10 ммоль) тиогидразида оксаминовой кислоты (30) в 1-2 мл ДМФА добавляют 308 мг (11 ммоль) 3,5-дибром-2-гидроксибензальдегида в 1 мл ДМФА. Реакционную смесь оставляют на сутки при комнатной температуре, затем добавляют 30 мл метанола. Выпавший осадок отфильтровывают и промывают метанолом.

Выход: N-(3-циано-2-фенил-5,6,7,8-тетрагидро-бензо[4,5]тиено[2,3-b]пиридин-4-ил)-2-[N'-(3,5-дибром-2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-ацетамида (26) 501 мг, (75%). Т пл. 178-180°С; ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц); 1,40-1,56 (м, 8Н, СН2); 6,68 (с, 1Н, СН); 7,56-7,84 (м, 7Н, СН); 11,02 (с, 1Н, NH); 12,76 (с, 1Н, ОН фен.). Найдено (%): С 48.33, Н 2.78, N 10.54. Вычислено (%): С 48.45, Н 2.86, N 10.46. Масс-спектр, m/z: 669.

Биологические примеры.

Для определения биологической активности и токсичности производных гидразонов тиогидразидов оксаминовых кислот были использованы следующие методы:

1. Методы определения цитотоксического эффекта производных гидразонов тиогидразидов оксаминовых кислот.

А) Для эукариотической клетки использовали метод окрашивания клеток метиленовым синим (стандартная методика) с последующим спектрометрическим учетом результатов. Работу проводили в формате 96-луночных планшетов.

В суточном монослое клеток МсСоу В (гибридная линия синовиальных клеток человека и мышиных фибробластов) и HL (эпителиальные клетки легкого человека) заменяли среду культивирования на полную СК с циклогексимидом и вносили разные дозы исследуемых химических соединений. Клетки инкубировали в течение 24 и 48 часов в CO2 инкубаторе при 37°С. Спустя 24/48 ч из лунок отбирали надосадок и отмывали клетки 0,1 моль/л раствором фосфатно-солевого буфера (ФСБ). Клетки фиксировали охлажденным метанолом (20 мкл) в течение 15 мин при 4°С.К фиксированным клеткам добавляли 40 мкл 0,5% метиленового синего и инкубировали 20 мин при комнатной температуре. После инкубации метиленовую синь отбирали из лунок и отмывали клетки ФСБ 4 раза. В лунки добавляли 100 мкл додецилсульфата натрия (SDS) в ФСБ и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре до полного лизиса клеток. Количество живых клеток определяли спектрометрически при длине волны 540 нм на флуориметре MuktiscanEX.

Б) Метод, направленный на определение метаболической активности клетки - МТТ-тест (Niks M., Otto M. Toward sanoptimized МТТ assay. // Immunol. - 1900. - V. 130, №1. - р.149-151), основанный на восстановлении бесцветной соли тетразолия (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид, МТТ) митохондриальными и цитоплазматическими дегидрогеназами живых метаболически активных клеток с образованием голубых кристаллов формазана, количество которого измеряется спектрометрически.

Метод проводили в формате 96-луночного культурального планшета. В суточном монослое клеток МсСоу В и HL заменяли среду культивирования на полную СК без циклогексемида и вносили разные дозы исследуемых химических соединений. Клетки инкубировали в течение 48 часов в СО2 инкубаторе при 37°С. За 4 часа до окончания эксперимента вносили 1:10 от объема культуральной среды 10х раствора МТТ (5 мг/мл). Инкубировали 4 часа при 37°С 5% CO2. Отбирали среду, отмывали однократно ФСБ. Добавляли в каждую лунку 100 мкл изопропанола (пропанола-2). Инкубировали при комнатной температуре 30 минут. Оценивали оптическую плотность при длине волны 540 нм на флуориметре Muktiscan EX. Субстратное поглощение оценивали при 405 нм.

В) Для оценки токсического эффекта производных гидразонов тиогидразидов оксаминовых кислот в условиях in vitro был использован кальцеиновый тест, который основывается на двойной окраске живых метаболически активных клеток и мертвых клеток с поврежденной цитоплазматической мембраной. В качестве первого красителя используется нефлюоресцирующий ацетоксиметилированный эфир кальцеина, который под действием внутриклеточный эстераз живой клетки переходит в флюоресцирующие анионы кальцеина, что обусловливает зеленое свечение живых клеток при флюоресцентной микроскопии. Вторым красителем является этидиум гомодимер, который проникает внутрь клетки только в условиях нарушения целостности ее мембраны и, связываясь с нуклеиновыми кислотами, окрашивает ядро клетки в оранжевый цвет.При просмотре препаратов с помощью люминесцентного микроскопа дифференцируют и определяют количество живых и мертвых клеток в исследуемых условиях.

Метод проводили в формате 24-луночного культурального планшета со стеклами. Анализ осуществлялся согласно протоколу, прилагаемому к коммерческому набору LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit for mammalian cells (Invitrogen, США). Для этого в суточном монослое клеток HL заменяли среду культивирования на полную СК без циклогексимидм и вносили разные дозы исследуемых химических соединений. Клетки инкубировали в течение 48 часов в СО2 инкубаторе при 37°С. Затем отбирали СК, отмывали однократно ФСБ и, не высушивая стекла, вносили смесь реагентов: 20 мкл 2 mM этидиум гомодимера и 5 мкл 2 mM Calcein AM, растворенных в 10 мл стерильного ФСБ, в объеме 150 мкл/лунка. Инкубировали в течение 20 мин при 37°С. Затем стекла монтировали на предметное стекло при нанесении на него нескольких 15-20 мкл того же раствора. Учет результатов (определение соотношения живых и мертвых клеток) осуществляли методом флюоресцентной микроскопии.

2. Метод суспензионного заражения эукариотических клеток.

Для получения суспензии использовали суточный монослой клеток МсСоу В и HL, который обрабатывали 2,5 мл раствора трипсина и версена (соотношение 1:3, соответственно) для открепления клеток от поверхности флакона. Флакон помещали в термостат на 5 мин. Затем отбирали раствор трипсина и версена и добавляли 2,5 мл полной среды культивирования (СК). Открепившиеся клетки отмывали в указанном объеме СК путем центрифугирования при 1000 об/мин 10 мин. Убирали надосадок и ресуспендировали клетки в 2 мл СК.

Для получения монослоя из приготовленной клеточной суспензии производили подсчет клеток в камере Горяева из расчета 1,5×105 кл/мл. Заражение клеток штаммом Bu-434 Chlamydia trachomatis серовар L2 производили в соотношении бактерия: клетка 1:1 в необходимом объеме транспортной среды, что обеспечивает 80-90% инфицированных клеток. Готовую суспензию вносили в лунки 96- или 24-луночных планшетов в объеме 100 мкл или 1000 мкл, соответственно. Для осаждения клеток и стимуляции взаимодействия с ними хламидий планшеты центрифугировали при 3000 об/мин 1 час при температуре 25°С. После этого планшет помещали в СО2 инкубатор на 48 ч при 37°С.

3. Определение влияния производных гидразонов тиогидразидов оксаминовых кислот на жизнеспособность хламидий.

Исследуемые химические соединения в разных концентрациях вносили в культуру клеток одновременно с патогеном для оценки возможного их влияния на взаимодействие хламидий с эукариотической клеткой: сразу после центрифугирования зараженной суспензии (ранняя стадия внутриклеточного цикла хламидий 0-2 ч), через 6-8 часов после начала эксперимента (средняя фаза), через 16 часов (поздняя стадия). Эффект оценивали методом прямой иммунофлюоресценции и путем высева материала, полученного из лизата клеток, инфицированных в присутствии ингибитора клеток.

Для данного метода были использованы клеточные линии МсСоу В и HL. Работу проводили в формате 96-луночных планшетов. В суточном монослое клеток заменяли СК на транспортную среду (ТС) и заражали С.trachomatis L2 для получения 80-90% инфицированных клеток (множественность инфекции 1:1). После центрифугирования при 3000 об/мин 30 мин при 25°С клетки инкубировали в течение 48 ч в CO2 инкубаторе при 37°С. Разные дозы исследуемого соединения добавляли в рабочую суспензию с учетом особенностей жизненного цикла хламидий, как было описано ранее. Спустя 48 ч из лунок отбирали надосадок и планшет помещали на 30 мин при -70°С, для того чтобы лизировать инфицированные клетки. В получившийся лизат добавляли 100 мкл транспортной среды и готовили разведения материала 1:10-1:1000. Заражали суточный монослой клеток с последующим центрифугированием при 3000 об/мин 30 мин при 25°С. После 48 ч инкубирования в ранее указанных условиях клетки фиксировали и окрашивали меченными ФИТЦ (флюоресце-инизотиоцианит) моноклональными антителами для последующего учета результатов методом иммунофлюоресцентной микроскопии.

4. Методы прямой иммунофлюоресценции.

Методы иммунофлюоресценции направлены на выявление объектов, содержащих некоторый антиген, и основаны на обработке препаратов соответствующими антителами, меченными флюорохромом, с последующей микроскопией в ультрафиолетовом луче.

В данной работе использован метод прямой иммунофлюоресценции (стандартная методика), позволяющий проводить полуколичественный учет развития хламидийной инфекции. Для этого использованы коммерческие наборы ЗАО "НИАРМЕДИК плюс" при НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (ФС 42-359598 и регистрационное удостоверение Минздрава России 93/ 270/ 9) "Хламоноскрин" для определения моноклональных антител к родоспецифическому липополисахаридному антигену Chlamydia и "Хламоноскрин-2" для определения моноклональных антител к видоспецифическому белковому антигену C.trachomatis.

Работу проводили на клеточных линиях МсСоу В и HL, инфицированных С.trachomatis серовар L2 в формате 96-луночных планшетов или 24-луночных со стеклами. Для этого суточный монослой заражали для получения 80-90% инфицированных клеток и одновременно с внесением инфекции добавляли разные дозы исследуемых химических соединений. Планшет центрифугировали при 3000 об/мин 30 мин при 25°С и инкубировали клетки в течение 48 ч в СО2 инкубаторе при 37°С. Через 48 ч из лунок отбирали надосадок и фиксировали клетки. При работе с 96-луночными планшетами фиксацию осуществляли ледяным 72° этанолом с последующим помещением планшета на 30-40 мин на -20°С. При работе с 24-луночными планшетами стекла промывали в 0,1 моль/л растворе ФСБ и высушивали. После этого клетки фиксировали ацетоном в течение 15 мин при комнатной температуре. На фиксированные клетки наносили 30-50 мкл моноклональные, меченные ФИТЦ антитела к белковым антигенам всех серотипов C.trachomatis (ХлаМоноСкрин-2, ООО «НИАРМЕДИК ПЛЮС») и инкубировали в течение 30 мин во влажной камере при 37°С. После инкубации клетки промывались 2 раза раствором ФСБ. Препарат полностью высушивали. В формате 24-луночных планшетов, подготовленные таким образом стекла монтировали на предметное стекло при помощи монтирующей жидкости (забуференный глицерин). Готовые препараты исследовали в люминесцентном микроскопе.

5. Метод непрямой иммунофлюоресценции.

Метод непрямой иммунофлюоресценции (стандартная методика) с использованием коммерческих антител к эффекторному белку ТТС IncA C.trachomatis (поликлональная кроличья сыворотка, специфическая к IncA, «Innovagen», Швеция).

Пример 1

2-[(2-(3-Этокси-2-гидроксибензилиден)гидразино]-М-(4-фторфенил)-2-тиоксоацетамид (LHC 709)

Соединение характеризуется высокой степенью растворимости в ДМФ, не образует осадка в процессе хранения и при переведении в транспортную среду.

Анализ токсичности LHC 709 в условиях in vitro (при добавлении 50 мМ раствора в среду культивирования эукариотических клеток в дозах 12.5, 25, 50 и 75 мкМ и последующем инкубировании в течение 48 часов при 37°С), проведенный методами 1. А-В, выявил отсутствие токсического эффекта.

Способность данного соединения подавлять внутриклеточный жизненный цикл хламидии в условиях in vitro оценивалась при помощи методов 2-4. Наилучший эффект соединение LHC 709 проявляет в дозе 50 мкМ при добавлении в СК клеток HL одновременно с инфекционным материалом (штамм C.trachomatis L2) и последующем культивировании в течение 48 часов. Показано, что в данных условиях инфицированные клетки отсутствуют (см. Фиг.1, на которой показано влияние LHC 709 на внутриклеточное развитие хламидийной инфекции в условиях in vitro (48 ч)). Анализ активности данного соединения в дозе 25 мкМ в аналогичных условиях проведения эксперимента выявил выраженное сокращение размеров включений.

Пример 2

2-[2-(3-Этокси-2-гидроксибензилиден)гидразино]-2-тиоксо-N-[2-(трифторметил)фенил]ацетамид (LHC 711).

Соединение характеризуется высокой степенью растворимости в ДМФ, не образует осадка в процессе хранения и при переведении в транспортную среду.

Токсичность LHC 711 для эукариотических клеток оценивалась методами 1. А-В при добавлении 50 мМ раствора данного соединения в СК клеток в дозах 12.5, 25, 50 и 75 мкМ и последующем инкубировании в течение 48 часов при 37°С. Установлено отсутствие токсичности соединения во всех указанных дозах.

Способность данного соединения подавлять внутриклеточный жизненный цикл хламидии в условиях in vitro оценивалась при помощи методов 2-4. Наибольший эффект выявлен в дозе 50 мкМ при добавлении в СК клеток HL одновременно с инфекционным материалом (штамм C.trachomatis L2) и последующем культивировании в течение 48 часов. В данных условиях эксперимента включения мелкие и единичные по сравнению с таковыми показателями в контроле (100%) (см. Фиг.2, на которой показано влияние LHC 711 на внутриклеточное развитие хламидийной инфекции в условиях in vitro (48 ч)). Анализ активности данного соединения в дозе 25 мкМ в аналогичных условиях выявил снижение размеров включений (средние и мелкие).

Пример 3

2-[2-(3,5-Дибром-2-гидроксибензилиден)гидразино]-2-тиоксо-N-[2-(трифторметил)фенил]ацетамид (LHC 712).

Соединение характеризуется высокой степенью растворимости в ДМФ, не образует осадка в процессе хранения и при переведении в транспортную среду.

Анализ токсичности LHC 712 оценивался методами 1. А-В при добавлении 50 мМ раствора данного соединения в СК клеток в дозах 12.5, 25, 50 и 75 мкМ и последующем инкубировании с клетками линии HL в течение 48 часов при 37°С. Установлено отсутствие токсичности соединения в дозах 12.5-50 мкМ.

Способность данного соединения подавлять внутриклеточный жизненный цикл хламидии в условиях in vitro оценивалась при помощи методов 2-4. Наибольшая активность данного соединения выявлена в дозе 50 мкМ при добавлении в СК клеток HL одновременно с инфекционным материалом (штамм C.trachomatis L2) и последующем культивировании в течение 48 часов. Показано, что в данных условиях эксперимента включения мелкие и единичные по сравнению с таковыми показателями в контроле (100%) (см. Фиг.3, на которой показано влияние LHC 712 на внутриклеточное развитие хламидийной инфекции в условиях in vitro (48 ч)).

Пример 4

N-(4-Фтор-фенил)-2-[N'-(2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-ацетамид (LHC 725).

Данное соединение характеризуется высокой степенью растворимости в ДМФ, не образует осадка в процессе хранения и при переведении в транспортную среду.

Анализ токсичности LHC 725 в условиях in vitro (при добавлении 50 мМ раствора в среду культивирования эукариотических клеток в дозах 12.5, 25, 50 и 75 мкМ и последующем инкубировании в течение 48 часов при 37°С), проведенный методами 1. А-В, выявил отсутствие токсического эффекта.

Способность данного соединения подавлять внутриклеточный жизненный цикл хламидии в условиях in vitro оценивалась при помощи методов 2-4. Показано, что наибольшее подавление внутриклеточной инфекции соединение LHC 725 проявляет в дозе 75 мкМ при добавлении в СК клеток HL одновременно с инфекционным материалом (штамм C.trachomatis L2) и последующем культивировании в течение 48 часов. Выявлено, что в данных условиях количество инфицированных клеток сокращается до 10% по сравнению с контролем, кроме того, LHC 725 влияет на размер включений (средние и мелкие) (см. Фиг.4, на которой показано влияние LHC 725 на внутриклеточное развитие хламидийной инфекции в условиях in vitro (48 ч)).

Пример 5

2-[2-(3,5-Дибром-2-гидроксибензилиден)гидразино]-N-(4-фторфенил)-2-тиоксоацетамид (LHC 726).

Соединение характеризуется высокой степенью растворимости в ДМФ, не образует осадка в процессе хранения и при переведении в транспортную среду.

Анализ токсичности LHC 726 в условиях in vitro (при добавлении 50 мМ раствора в среду культивирования эукариотических клеток в дозах 12.5, 25, 50 и 75 мкМ и последующем инкубировании в течение 48 часов при 37°С), проведенный методами 1. А-В, выявил отсутствие токсического эффекта.

Способность данного соединения подавлять внутриклеточный жизненный цикл хламидии в условиях in vitro оценивалась при помощи методов 2-4. Наилучший эффект соединение LHC 726 проявляет в дозе 75 мкМ при добавлении в СК клеток HL одновременно с инфекционным материалом (штамм C.trachomatis L2) и последующем культивировании в течение 48 часов. Показано, что в данных условиях процент инфицированных клеток сокращается по сравнению с таковыми показателями в контроле в 5 раз (20% и 100%, соответственно) (см. Фиг.5, на которой показано влияние LHC 726 на внутриклеточное развитие хламидийной инфекции в условиях in vitro (48 ч)). Кроме того, в опытной группе уменьшаются размеры включений (средние).

Пример 6

2-[(2-(3-Этокси-2-гидроксибензилиден)гидразино]-2-тиоксо-N-[3-(трифторметил)фенил]ацетамид (LHC 771).

Соединение характеризуется высокой степенью растворимости в ДМФ, не образует осадка в процессе хранения и при переведении в транспортную среду.

Анализ токсичности LHC 771 оценивался методами 1. А-В при добавлении 50 мМ раствора данного соединения в СК клеток в дозах 12.5, 25, 50 и 75 мкМ и последующем инкубировании с клетками линии HL в течение 48 часов при 37°С. Установлено отсутствие токсичности соединения во всех указанных дозах.

Ингибирующий эффект LHC 771 на развитие хламидийной инфекции в условиях in vitro оценивался при помощи методов 2-4. Наибольшая активность данного соединения выявлена в дозе 50 мкМ при добавлении в СК клеток HL одновременно с инфекционным материалом (штамм C.trachomatis L2) и последующем культивировании в течение 48 часов. Показано, что в данных условиях эксперимента включения мелкие, а количество инфицированных клеток составляет 10% по сравнению с таковыми показателями в контроле (100%) (см. Фиг.6, на которой показано влияние LHC 771 на внутриклеточное развитие хламидийной инфекции в условиях in vitro (48 ч)).

Пример 7

2-[(2-(3,5-Дибром-2-гидроксибензилиден)гидразино]-2-тиоксо-N-[3-(трифторметил)фенил]ацетамид (LHC 772).

Соединение характеризуется высокой степенью растворимости в ДМФ, не образует осадка в процессе хранения и при переведении в транспортную среду.

Токсичность LHC 772 для эукариотических клеток оценивалась методами 1. А-В при добавлении 50 мМ раствора данного соединения в СК клеток в дозах 12.5, 25, 50 и 75 мкМ и последующем инкубировании в течение 48 часов при 37°С. Установлено отсутствие токсичности соединения во всех указанных дозах.

Ингибирующая активность LHC 772 в условиях in vitro оценивалась при помощи методов 2-4. Наибольший эффект выявлен в дозе 50 мкМ при добавлении в СК клеток HL одновременно с инфекционным материалом (штамм C.trachomatis L2) и последующем культивировании в течение 48 часов. В данных условиях эксперимента отмечено наличие единичных инфицированных клеток с мелкими включениями (Фиг.7, на которой показано влияние LHC 772 на внутриклеточное развитие хламидийной инфекции в условиях in vitro (48 ч)).

В таблице 1 представлены результаты проведенных тестов, которые свидетельствуют о биологической активности замещенных производных гидразонов тиогидразидов оксаминовых кислот, а также о том, что эти соединения не токсичны для эукариотических клеток.

Пример 8

Исследование на специфическую активность некоторых замещенных производных гидразонов тиогидразидов оксаминовых кислот (LHC 709 и 711) ингибировать функции третьей транспортной системы (ТТС) проводилось по методу 5.

Для этого суточный монослой заражали для получения 80-90% инфицированных клеток, центрифугировали при 3000 об/мин 30 мин при 25°С и инкубировали клетки в течение 48 ч в СО2 инкубаторе при 37°С. Через 8 ч после заражения (время транслокации эффекторного белка в мембрану включения) добавляли разные дозы исследуемых химических соединений. Через 24 ч из лунок отбирали надосадок, стекла промывали в 0,1 моль/л растворе ФСБ и высушивали. После этого клетки фиксировали ацетоном в течение 15 мин при комнатной температуре. На фиксированные клетки наносили 50 мкл сыворотки и инкубировали в течение 30 мин в CO2 инкубаторе при 37°С. Затем стекла промывали указанным раствором ФСБ и наносили антитела, меченные ФИТЦ. Инкубировали в течение 30 мин во влажной камере при 37°С. После инкубации стекла с клетками промывались 2 раза раствором ФСБ. Препарат полностью высушивали. Подготовленные таким образом стекла монтировали на предметное стекло при помощи монтирующей жидкости. Готовые препараты исследовали в люминесцентном микроскопе. Одновременно проводилась окраска моноклональными антителами к белку МОМР наружной мембраны клеточной стенки, что позволяло оценивать развитие хламидийной инфекции. В случае действия препарата на ТТС при данной окраске выявляются включения, соответствующие по своим размерам сроку инфекции. На Фиг.8. показано подавление транслокации эффекторного белка IncA ТТС C.trachomatis L2 специфическими ингибиторами.

Другой тест на специфичность соединений в отношении ТТС связан с тем, что транслоцируемый с помощью ТТС хламидийный белок IncA участвует в процессе слияния отдельных, развивающихся внутри клетки включений. При окраске инфицированных клеток антителами к белку МОМР в формате эксперимента: заражение - через 8 часов внесение химсоединения - инкубация до 24 часов с момента заражения, в контрольных клетках наблюдали крупные включения, по одному в каждой клетке, а в случае действия соединения на ТТС - несколько мелких, не слившихся включений в цитоплазме клетки.

Проведенные тесты свидетельствуют о том, что ряд биологически активных соединений, представляющих собой замещенные производные гидразонов тиогидразидов оксаминовых кислот общей формулы (I) может проявлять специфическую активность в отношении ТТС, подавляя процесс транслокации эффекторного белка IncA и препятствуя, тем самым, процессу гомотипичного слияния первичных включений, т.е. ингибировать систему секреции III типа у патогенных бактерий, не вызывая развития устойчивости к препаратам в результате селекции резистентных мутантов, а также оказывая направленное воздействие на механизмы, обуславливающие процесс хронизации инфекции.

Сказанное выше позволяет сделать вывод, что поставленная техническая задача решена.

Таблица 1
Результаты тестирования химических соединений
Название Концентрация, мкМ Токсичность (тест Calcein AM, кол-во живых клеток), в % Влияние на внутриклеточный цикл развития С.trachomatis
Множественность инфекции (48 ч), в % Размер включений
LHC 709 12,5 98 5 средние
25 98 5 мелкие
50 98 0 -
75 0 -
LHC 711 12,5 98 крупные
25 98 80 средние
50 98 единичные мелкие
75 0
LHC 712 12,5 98 50 средние/мелкие
25 98 10 мелкие
50 70 единичные мелкие
75 - 0 -
LHC 725 12,5 - -K+ -K+
25 95 =K+ =K+
50 80-85 40 средние
75 80 10 средние
LHC 726 12,5 - -K+ -K+
25 95 =K+ =K+
50 95 20-30 средние
75 75 20 средние
К+ - положительный контроль (инфицированные клетки в отсутствие ингибитора)
Продолжение Таблицы 1
Название Концентрация, мкМ Токсичность (тест Calcein AM, кол-во живых клеток), в % Влияние на внутриклеточный цикл развития С.trachomatis
Множественность инфекции (48 ч), в % Размер включений
LHC 771 12,5 - 70 -K+
25 95 60 =K+
50 95 10 мелкие
75 95 10 мелкие
LHC 772 12,5 - -K+ -K+
25 95 =K+ =K+
50 95 единичные мелкие
75 95 единичные мелкие
К+ - положительный контроль (инфицированные клетки в отсутствие ингибитора)

1. Замещенные производные гидразонов тиогидразидов оксаминовых кислот общей формулы:

где R-R1 представляют собой Н, незамещенные алкил С1-С5; пиридинил; фенил, замещенный СН3, Hal, CF3; группу где Х представляет собой S, замещенную алкилом С1-С5, СООН, COOR4;
или группу

R2, R3 представляют собой Н, незамещенный алкил С1-С5, 2-гидроксициклогексил; фенил, замещенный Hal, NO2, ОН, OR4, a R4 представляет собой незамещенный алкил С1-С4 за исключением соединений
, и

2. Способ получения соединений по п.1, включающий взаимодействие соответствующих хлорацетамидов с предварительно приготовленным раствором элементной серы с морфолином или пиперидином, пропускание полученного раствора монотиооксамидов через слой сорбента, последующее взаимодействие монотиооксамидов с гидразингидратом, и реакцию полученного соединения с альдегидами в ДМФА при комнатной температуре с последующим осаждением метанолом.

3. Способ ингибирования секреции III типа у патогенных бактерий, заключающийся в воздействии на бактерии эффективным количеством соединения по п.1.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к N-замещенным производным тиогидразидов оксаминовых кислот общей формулы: где R и R1, представляют собой Н, незамещенные или замещенные Het, фенил, Alk, при этом заместителями могут быть Alk, Hal, CF3, COOR3, SR 3, либо R+R1=C2H4OC 2H4; R2 представляет собой Н, Alk, OR3, Hal, где R3=Alk; Het представляет собой 5- или 6-членное кольцо, содержащее один или два гетероатома, выбранных из N, S.

Изобретение относится к новым биологически активным веществам, а именно к 4-(4-мeтилфeнил)-4-oкco-2-[3-этoкcикapбoнил-4,5-R 2,R1-тиoфeн-2-иламино]бут-2-еновым кислотам общей формулы Технический результат - получение новых соединений, обладающих противовоспалительной и анальгетической активностью, а также низкой токсичностью, которые можно применять в качестве лекарственных средств.

Изобретение относится к соединениям общей формулы (II), и его фармацевтически приемлемым солям, к их применению и фармацевтической композиции на их основе. .

Изобретение относится к области органической химии, в частности к способу получения метиловых эфиров 2-тиофенкарбоновой кислоты, предназначенные для использования в синтезе оптических отбеливателей, красителей для хлопка, шерсти, искусственных волокон, лекарственных препаратов, а также в качестве присадки к маслам или гидравлическим жидкостям.

Изобретение относится к новым соединениям общей формулы I в которой А обозначает тиофендиил, фенилен или пиридиндиил; R1 обозначает алкил, алкенил, алкинил, которые необязательно содержат один или несколько заместителей, выбранных из группы, включающей галоген, циано-, нитро-, аминогруппу, -NH-алкил и N(алкил)2, или -СН 2-(O-СН2-СН2 -)mО-алкил; -(CH2 )n-О-алкил; -(СН2 )n-С(O)-NH-алкил; -(СН2 )n-NH-С(O)-алкил; -(СН2 )n-С(O)алкил; -(СН2 )n-С(O)-O-алкил; или -(СН 2)n-O-С(O)-алкил; или группу -NR 3R4, в которой R3 и R4 независимо обозначают водород; алкил, алкенил или алкинил, которые необязательно содержат один или несколько заместителей, выбранных из группы, включающей галоген, циано-, нитро-, аминогруппу, -NH-алкил и N(алкил) 2; или -СН2-(O-СН 2-СН2-)mО-алкил; -(СН2)n-(O)-алкил; -(СН2)n-С(O)-NH-алкил; -(СН2)n-NH-С(O)-алкил; -(СН2)n-С(O)алкил; -(СН2)n-С(O)-O-алкил; или -(СН2)n-O-С(O)-алкил; n равно 1-6; m равно 1-4; и к их фармацевтически приемлемым солям.

Изобретение относится к новым соединениям - ацилированным арилциклоалкиламинам формулы I в любой из их стереоизомерных форм или в виде их смеси в любом соотношении, или их фармацевтически приемлемым солям, где в формуле I: R1 представляет собой арил, необязательно замещенный одним или двумя одинаковыми или различными заместителями, выбранными из группы, включающей С1-С6-алкил и галоген; R2 представляет собой арил или гетероарил, представляющий собой остаток 5-6-членного ароматического моноциклического гетероцикла, содержащий 1-2 атома азота в качестве гетероатома и/или 1 атом серы или кислорода, или остаток 9-10-членного ароматического бициклического гетероцикла, содержащий 1-2 атома азота в качестве гетероатома, каждый из которых является незамещенным или содержит 1-3 одинаковых или разных заместителей, выбранных из группы, состоящей из галогенов, NH2, незамещенных С1-С10-алкила, C 1-С10-алкокси, С1 -С10-алкиламино и ди(С1 -С10-алкил)амино, и по меньшей мере, монозамещенного C1-С10-алкила, и т.д., n представляет собой 1, 2, 3 или 4.

Изобретение относится к трициклическим производным, представленным формулой (I), или к их фармацевтически приемлемым солям, обладающим пролиферативной активностью и способностью ингибировать ангиогенез, к способу их получения (варианты), к пролиферативному агенту и ингибитору ангиогенеза на их основе.

Изобретение относится к новым замещенным бензоилциклогексенонам, обладающих биологической активностью, в частности гербицидной активностью. .

Изобретение относится к новым соединениям, соответствующим приведенной ниже общей формуле (I): к оптическим изомерам указанных соединений, а также к их солям, обладающим свойством модулятора активированного пролифератором пероксисом рецептора подтипа у (PPAR ).

Изобретение относится к соединениям общей формулы (I) и к их фармацевтически приемлемым солям, оптическим изомерам или их смеси в качестве активаторов глюкокиназы. .

Изобретение относится к соединениям формулы (I) где R означает водород или (низш.)алкил; R1 означает (низш.)алкил или (С3-С 7)циклоалкил; Х означает азот, a Y означает углерод или Y означает азот, а Х означает углерод; m означает 0 или 1; Z означает С(O) или SO2; R2 выбирают из группы, состоящей из (низш.)алкила, (С3-С7)циклоалкила или (С3-С7)циклоалкила, замещенного (низш.)алкилом, (низш.)фенилалкила, где фенильное кольцо является незамещенным или моно- или дизамещенным (низш.)алкокси или галоидом, пиридила, моно-или дизамещенного галоидом, и NR3R4 или в случае, когда Z означает С(O), R2 может быть также (низш.)алкокси; R3 означает водород или (низш.)алкил; R4 выбирают из группы, состоящей из (низш.)алкила, (низш.)алкоксиалкила, (С3-С7)циклоалкила, незамещенного фенила или фенила, монозамещенного (низш.)алкокси, или (низш.)фенилалкила, где фенил является незамещенным или моно- или дизамещенным галоидом; или R3 и R4 образуют вместе с атомом азота, к которому они присоединены, 5-, 6-или 7-членное гетероциклическое кольцо, необязательно содержащее дополнительный гетероатом, выбранный из кислорода, упомянутое гетероциклическое кольцо является незамещенным или замещенным одной или двумя группами, независимо выбранными из (низш.)алкила, галоида и галоидалкила, или является конденсированным с фенильным или циклогексильным кольцом, и к их фармацевтически приемлемым солям, а также к фармацевтическим композициям, включающим эти соединения.

Изобретение относится к соединениям формулы и их фармацевтически приемлемым солям или сложным эфирам, где X1 обозначает О, S, СН2 ; R1 обозначает водород; R2 обозначает водород или C1-С7алкил, R3 обозначает водород или C1-C7алкил; R4 и R8 независимо друг от друга обозначают водород, С 1-С7алкил, С1-С7алкокси-С 1-С7алкил, фторС1-С7алкил; R5, R6 и R7 независимо друг от друга обозначают водород, С1-С7алкил, галоген, фторС1-С7алкил; и при этом один из R5, R6 и R7 обозначает где X2 обозначает S, О, NR 9, (СН2)PNR9CO или (CH 2)PCONR9, R9 обозначает водород, С1-С7алкил; один или два из Y 1, Y2, Y3 и Y4 обозначают N, а остальные обозначают C-R12; R10 обозначает C1-C7алкил, С3-С7 циклоалкил; R11 обозначает водород; R12 независимо друг от друга в каждом случае выбирают из водорода, С1-С7алкила, С3-С7 циклоалкила, фторС1-С7алкила, С1 -С7алкокси-С1-С7алкила, гидроксиС 1-С7алкила, ди-C1-C7алкиламино-С 1-С7алкила; R13 обозначает фенил или гетероарил, представляющий собой 6-членное ароматическое кольцо, содержащее азот в качестве гетероатома, которые могут быть замещены группой CF3, низшей фторалкоксигруппой или галогеном; m=0 или 1, n=0, 1, 2, и p=0, 1 или 2, и сумма m, n и p=1, 2, 3 или 4; при условии, что исключены соединения формулы I, где X1 обозначает O, R2 и R 3 обозначают водород; R6 представляет собой Х2 обозначает О или S, и m=0.

Изобретение относится к новым соединениям общей формулы (I) где R1 представляет собой 3-10-членную неароматическую гетероциклическую группу, где группа ограничена группой, содержащей азот в качестве атома, составляющего кольцо, и азот, имеющий дополнительную связь, или группой, представленной формулой -NR11aR11b, где R11a и R11b могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга и каждый представляет собой водород, C1-6 алкил, C3-10 циклоалкил, C6-10 арил, 5-10-членный гетероарил или 4-10-членную неароматическую гетероциклическую группу, и R11a и R11b могут быть замещены заместителем, выбранным из группы заместителей А или группы заместителей В, и R1 может быть замещен заместителем, выбранным из группы заместителей А или группы заместителей В; R2 и R3 представляют собой водород; R4, R 5, R6 и R7 могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга и каждый представляет собой водород, галоген, C1-6 алкил; R8 представляет собой водород или C1-6 алкил; R9 представляет собой 3-10-членную неароматическую гетероциклическую группу, где группа ограничена группой, содержащей азот в качестве атома, составляющего кольцо, и азот, имеющий дополнительную связь, или группой, представленной формулой -NR11aR11b , где R11a и R11b имеют те же значения, как описано выше; n представляет собой целое число 1 или 2; и Х представляет собой группу, представленную формулой -C(R 10)=, или азот, где R10 представляет собой водород; где группа заместителей А состоит из галогена, гидроксила и оксо группы; где группа заместителей В состоит из C1-6 алкила, C3-10 циклоалкила, C6-10 арила, 5-10-членного гетероарила, 3-10-членной неароматической гетероциклической группы, C1-6 алкокси, 5-10-членной гетероарилокси, 4-10-членной неароматической гетероциклической оксигруппы и группы, представленной формулой -Т1-Т2-Т3 , и каждая группа в группе заместителей В может быть замещена заместителем, выбранным из группы заместителей С, где Т1 представляет собой непосредственную связь или C1-6 алкилен, Т2 представляет собой группу, представленную формулой -NRT1-, Т3 представляет собой водород или C1-6 алкил и RT1 представляет собой водород или C1-6 алкил; и где группа заместителей С состоит из гидроксила, C1-6 алкила, 3-10-членной неароматической гетероциклической группы и ди-С1-6 алкиламиногруппы, к фармацевтической композиции, обладающей противоопухлевой активностью, к ингибиторам: рецептора фактора роста гепатоцитов, ангиогенеза и ракового метастазирования, а также к противоопухлевому средству.

Изобретение относится к N-замещенным производным тиогидразидов оксаминовых кислот общей формулы: где R и R1, представляют собой Н, незамещенные или замещенные Het, фенил, Alk, при этом заместителями могут быть Alk, Hal, CF3, COOR3, SR 3, либо R+R1=C2H4OC 2H4; R2 представляет собой Н, Alk, OR3, Hal, где R3=Alk; Het представляет собой 5- или 6-членное кольцо, содержащее один или два гетероатома, выбранных из N, S.
Наверх