Способ количественного определения акрилонитрила в крови методом газохроматографического анализа
Владельцы патента RU 2452961:
Федеральное бюджетное учреждение науки "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" (ФБУН "ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения") (RU)
Изобретение относится к области медицинских токсикологических исследований, в частности к санитарной токсикологии. При осуществлении способа берут 2 см3 цельной крови, содержащей акрилонитрил, подкисляют ее 0,5 см3 1% раствором серной кислоты до рН 2-3, проводят экстракцию 2 см3 диэтилового эфира в течение 1-2 мин, далее для удаления белков осуществляют центрифугирование пробы при 6000 об/мин в течение 10 мин и проводят количественное определение акрилонитрила в подготовленных пробах газохроматографическим методом по калибровочному графику с использованием аппаратно-программного комплекса на базе газового хроматографа "Кристалл-5000" с термоионным детектором на капиллярной колонке DB-624-30m*0,32mm*0,25µm при температурном режиме: колонка - 50°С-200°С, испаритель - 200°С; детектор - 250°С; расход газа-носителя 1 (азот) - 1,4 см3/мин; расход газа-носителя 2 (азот) - 20 см3/мин. Достигается повышение точности, чувствительности и упрощение анализа. 3 з.п. ф-лы, 1 прим., 4 табл.
Изобретение относится к области медицинских токсикологических исследований, в частности к санитарной токсикологии, и может быть использовано для количественного определения акрилонитрила в цельной крови.
Известен метод определения акрилонитрила в воде [1] путем обработки анализируемой пробы раствором перманганата калия, удаления избытка последнего восстановителем, добавлением бромной воды и удалением избытка брома тем же восстановителем с последующим определением образующегося бромциана, при этом в качестве восстановителя используют 0,2-0,3%-ный раствор нитрита натрия, образующийся бромциан перед определением высаливают, экстрагируют толуолом и определение ведут путем газохроматографического анализа экстракта. Способ заключается в следующем: к 1 см3 воды добавляют 1 см3 щелочного раствора перманганата калия (3,5 см3 0,1 н раствор КМnO4 доводят до 100 см3 0,1 н раствором NaOH). Избыток КМnO4 удаляют добавлением 0,2 см3 0,3% водного раствора NaNO2 и подкисляют 0,5 см3 2 н раствора НСl. Раствор при этом обесцвечивается. Затем к смеси добавляют 0,1-0,2 см3 насыщенной бромной воды до образования ярко желтого окрашивания, перемешивают и избыток брома связывают добавлением 1,5 г NaCl и экстрагируют образовавшийся BrCN 2 см3 толуола энергичным встряхиванием в течение 3 мин. Аликвотную часть (3 мкл) толуольного слоя анализируют на хроматографе с ДЭЗ, используя стеклянную колонку длиной 2 м и внутренним диаметром 4 мм, заполненную силанизированным хроматоном, покрытым 15% полиэтиленгликоля 1500. Количественный анализ проводят методом абсолютной калибровки по высотам пиков. Чувствительность определения акрилонитрила 0,1 мкг/см3.
Также известен способ количественного определения акрилонитрила в воде [2]. Известный способ осуществляют обработкой пробы воды объемом 1 см3 щелочным раствором перманганата калия объемом 1 см3 (1,9 см3 0,1 н раствора перманганата калия доводят до 100 см3 0,05 н гидроксидом натрия) с последующим удалением его избытка и бромированием пробы 1-2 капли 10-40%-ной НВr, избыток которой удаляют 0,1 см3 3%-ным раствором салицилата натрия до обесцвечивания жидкости. Далее раствор экстрагируют 2 см3 толуола в течение 3 мин и экстракт (3 мкл) анализируют газохроматографическим методом с электронно-захватным детектором. Количественный анализ проводят методом абсолютной калибровки по высоте пиков. Чувствительность определения 0,001 мкг/см3. Однако для определения акрилонитрила в крови данный известный способ не применим в виду использования сильного окислителя, который оказывает влияние на точность анализа. Это объясняется тем, что перманганат-ион обладает высокой окислительной способностью и легко окисляет органические соединения, содержащиеся в пробе крови, в том числе и акрилонитрил. В результате этого процесса возможно образование других более сложных органических соединений, что может затруднить экстракцию и определение изучаемого соединения в пробе крови.
Наиболее близким к предлагаемому способу по технической сущности является способ определения акрилонитрила в его аддуктах с белками крови [3]. Способ включает взятие крови, очищение глобина по Остерману-Голкару, подготовку образцов к количественному определению, количественное определение акрилонитрила с использованием газовой хроматографии и масс-спектрометрии. Новым в способе является то, что подготовку образцов к количественному определению осуществляют путем окисления атома серы в алкилированных белках до сульфоксидной формы с помощью перекиси водорода с последующим освобождением акрилонитрила из сульфоксидной формы при температуре 250±5°С в инъекционной камере газового хроматографа. При этом очищение глобина производилось по методу Остермана-Голкара [4].
Недостатком известного способа является сложность подготовки образцов к количественному определению, которую осуществляют путем окисления атома серы в алкилированных белках до сульфоксидной формы перекисью водорода с последующим освобождением акрилонитрила из сульфоксидной формы при (250±50)°С в инъекционной камере газового хроматографа. Еще одним недостатком известного способа является недостаточная чувствительность и точность.
Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в повышении чувствительности и точности определения акрилонитрила в цельной крови при одновременном упрощении способа.
Указанный технический результат достигается предлагаемым способом количественного определения акрилонитрила в крови методом газохроматографического анализа, включающим отбор пробы крови, подготовку ее к анализу и количественное определение акрилонитрила методом газохроматографического анализа, отличающийся тем, что подготовку пробы крови к анализу производят путем подкисления ее 1%-ным водным раствором серной кислоты до рН 2-3, последующего осуществления экстракции акрилонитрила диэтиловым эфиром, объем которого соотносится с объемом пробы крови как 1:1, и центрифурирования при 6000 об/мин в течение 10 мин для отделения белков от экстракта, далее, с помощью метода газохроматографического анализа, используя градуировочный график, производят определение в полученном экстракте количественного содержания акрилонитрила.
Экстракцию акрилонитрила диэтиловым эфиром производят в течение 1-2 мин.
Подкисление пробы 1%-ным водным раствором серной кислотой производят в объемном соотношении с пробой как 1:4.
Газохроматографическое определение акрилонитрила в крови осуществляют с использованием газового хроматографа "Кристалл-5000" с термоионным детектором на капиллярной колонке DB-624-30m*0,32mm*0,25µm при температурном режиме: колонка - 50°С-200°С, испаритель - 200°С; детектор - 250°С; расход газа-носителя 1 (азот) - 1,4 см3/мин; расход газа-носителя 2 (азот) - 20 см3/мин.
Экспериментальным путем обнаружено, что указанный технический результат обеспечивается именно совокупностью предложенных признаков, при реализации которых и достигается высокая чувствительность и точность определения акрилонитрила в пробе крови, а также упрощается способ.
В лабораторных условиях был проведен ряд опытов для установления существенности признаков, положенных в основу предлагаемого способа.
Пример. Согласно заявляемому способу берут 2 см3 цельной крови, содержащей акрилонитрил, подкисляют ее 0,5 см3 1% раствором серной кислоты до рН 2-3, проводят экстракцию 2 см3 диэтилового эфира в течение 1-2 мин, далее для удаления белков осуществляют центрифугирование пробы при 6000 об/мин в течение 10 мин и проводят количественное определение акрилонитрила в подготовленных пробах газохроматографическим методом по калибровочному графику с использованием аппаратно-программного комплекса на базе газового хроматографа "Кристалл-5000" с термоионным детектором на капиллярной колонке DB-624-30m*0,32mm*0,25µm при температурном режиме: колонка - 50°С-200°С, испаритель - 200°С; детектор - 250°С; расход газа-носителя 1 (азот) - 1,4 см3/мин; расход газа-носителя 2 (азот) - 20 см3/мин.
Для построения калибровочного графика использовали следующую методику. Градуировка проводится с целью получения градуировочной зависимости, которая характеризует зависимость между величиной отклика детектора (площадь пика на хроматограмме мм2) и концентрации (мкг/см3) акрилонитрила в пробе и строится по 7 сериям рабочих стандартных растворов. Каждую серию, состоящую из 5 стандартных растворов, готовят в мерных пробирках объемом 5 см3. Для этого в каждую пробирку, содержащую 2 см3 крови, вводят акрилонитрил в соответствии с таблицей 1.
| Таблица 1 | ||||||||
| Стандартные растворы для установления градуировочной характеристики при определении в крови акрилонитрила в диапазоне концентраций 0,0159-0,8 мкг/см3 | ||||||||
| Номер смеси | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Акрилонитрил Объем исходного стандартного раствора, мм3 | 0.2 | 0,5 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |
| Концентрация акрилонитрила, мкг/см3 | 0,0159 | 0,039 | 0,0795 | 0,159 | 0,319 | 0,477 | 0,636 | 0,795 |
Для построения градуировочного графика используют цельную кровь, не содержащую исследуемый компонент - акрилонитрил. В пробирки помещают по 2 см3 крови со стандартной смесью, содержащей акрилонитрил, подкисляют 0,5 см3 1% раствором серной кислоты до рН 2-3, экстрагируют 2 см3 диэтилового эфира в течение 1-2 мин. Для денатурации белков экстракты центрифугируют при 6000 об/мин в течение 10 мин и переносят в бюкс и проводят количественное определение акрилонитрила в подготовленных пробах газохроматографическим методом.
Полученные экстракты - стандартные растворы хроматографируют на хроматографе «Кристалл-5000» с термоионным детектором. В хроматографическую колонку через испаритель вводят по 1 мм3 экстракта каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях:
температура термостата колонок 50-200°С при скорости нагревания 10°С/мин; расход газа-носителя (азот) - 30 см3/мин; деление потока 1:10. Время удерживания: акрилонитрила - 4 мин 05 с. Для получения достоверных результатов анализ каждой градуировочной смеси проводят не менее 2-х раз,
Отработка оптимальных газохроматографических параметров для определения акрилонитрила в крови на фоне других азотсодержащих соединений осуществлялась с использованием аппаратно-программного комплекса на базе газового хроматографа "Кристалл-5000" с термоионным детектором (ТИД). Высокая эффективность метода определения акрилонитрила в крови достигнута путем подбора оптимальных условий газохроматографического анализа: термоионный детектор (ТИД), капиллярная колонка DB-624 -30 m*0,32 mm*0,25µm, температурный режим колонка - от 50°С-200°С; испаритель - 200°С; детектор - 250°С; расход газа-носителя 1 (азот) - 1,4 см3/мин; расход газа-носителя 2 (азот) - 20 см3/мин.
При проведении исследований была изучена эффективность извлечения акрилонитрила из крови путем применения ряда различных экстрагентов: хлористый метилен, диэтиловый эфир, гептан. Средние значения полноты экстракции акрилонитрила из крови для ряда экстрагентов и параметров аналитического процесса представлены в таблице 2.
| Таблица 2 | |||
| Средние значения полноты экстракции акрилонитрила из крови | |||
| Экстрагент | Концентрация акрилонитрила в пробе крови, мкг/см3 | Полнота экстракции, % | |
| Введено | Найдено | ||
| 1. Хлористый метилен | 0,159±0,013 | 0,227±0,021 | 14 |
| 2. Гептан | 0,159±0,015 | 0,260±0,025 | 16,5 |
| 3. Диэтиловый эфир | 0,159±0,014 | 0,149±0,011 | 94,0 |
Установлено, что наибольшее извлечение акрилонитрила из крови достигается экстракцией его диэтиловым эфиром - 94%.
В процессе исследований также изучена зависимость степени экстракции акрилонитрила от типа неорганических кислот и природы органических растворителей. Полученные данные приведены в таблице 3.
| Таблица 3 | |||
| Средние значения полноты экстракции акрилонитрила из пробы крови в зависимости от природы органических растворителей и типа неорганических кислот | |||
| Экстрагент | Тип неорганической кислоты | ||
| 1% р-р H2SO4 | 1% р-р НСl | 1% р-р Н3РO4 | |
| Полнота экстракции, % | |||
| 1. Хлористый метилен | 28,0 | 10,0 | 8,0 |
| 2. Гептан | 10,0 | 6,5 | 7,9 |
| 3. Диэтиловый эфир | 94,7 | 33,0 | 35,0 |
Наибольшая степень экстракции (94,7%) при подобранных оптимальных условиях газохроматографического анализа и типа неорганических кислот была достигнута в предлагаемом способе при использовании диэтилового эфира и серной кислоты.
При проведении исследований также проводили анализы пробы крови у детей, проживающих в условиях экологического неблагополучия с возможным влиянием акрилонитрила на организм ребенка. Пробы крови обрабатывали предлагаемым способом и по калибровочному графику определяли содержание компонента в пробах. Полученные результаты приведены в таблице 4.
| Таблица 4 | |
| Содержание акрилонитрила в крови детей группы обследования | |
| № пробы ребенка | Содержание акрилонитрила, мкг/см3 |
| 1 | 0,0102 |
| 2 | 0,014 |
| 3 | 0,0128 |
| 4 | 0,0107 |
| 5 | 0,011 |
В результате проведенного эксперимента установлено, что чувствительность определения для акрилонитрила в пробе цельной крови составила 0,01 мкг/см3. При этом исследовании погрешность определения составила для акрилонитрила 25,0%.
Испытания показали, что возможно определение акрилонитрила в количестве 0,00001 мкг в анализируемом объеме пробы. Это следует из следующего расчета: 0,01 мкг в 1 см3 или в 1000 мм3 крови. В хроматограф мы вкалываем 1 мм3, который является анализируемым объемом пробы. Таким образом, 0,01 мкг разделить на 1000 мм3, и получаем чувствительность 0,00001 мкг в анализируемом объеме пробы.
Таким образом, применение предлагаемого способа позволяет повысить чувствительность определения, а именно: степень экстракции акрилонитрила из крови при оптимально подобранных газохроматографических условиях и заявляемых операциях подготовки пробы к анализу составила 94,7%. В то время как известный способ определения акрилонитрила в его аддуктах с белками крови по прототипу (патент РФ №2110794) позволяет определять только 27% от дозы 25-28 мг/кг (при уровне дозы акрилонитрила 25-28 мг/кг, количество акрилонитрила, связанного с гемоглобином и измеренного как S-(2-карбоксиэтил)цистеин, составляет примерно 27% от соответствующей величины).
Наряду с указанным, у заявляемого способа значительно сокращен период подготовки образцов к исследованию, а именно с 30 мин у известного способа до 19 мин у предлагаемого способа, что приводит к его упрощению. Доказательством этому служит расчет времени подготовки образцов к исследованию и газохроматографический анализ:
- 2 см3 цельной крови, содержащей акрилонитрил, подкисляют ее 0,5 см3 1% раствором серной кислоты до рН 2-3, проводят экстракцию 2 см3 диэтилового эфира в течение 1-2 мин - общее затраченное время 4 мин;
- для удаления белков осуществляют центрифугирование пробы при 6000 об/мин в течение 10 мин - общее время 11 мин;
- количественное определение акрилонитрила в подготовленных пробах газохроматографическим методом - время выхода акрилонитрила составляет 4 мин;
- итого общее время - 19 мин.
Список использованной литературы
1. А.с. СССР №1059507. Способ количественного определения акрилонитрила, кл. G01N 31/08,1982.
2. А.с. СССР №1493948. Способ количественного определения акрилонитрила, кл. G01N 31/00,1987.
3. Патент РФ №2110794. Способ определения акрилонитрила в его аддуктах с белками крови, кл. G01N 33/48, 1992.
4. Osterman - GolKar S., Ehrenberg L., Segerback D., Mutal. Res., 1976, vol. 34, p.1-10.
1. Способ количественного определения акрилонитрила в крови методом газохроматографического анализа, включающий отбор пробы крови, подготовку ее к анализу и количественное определение акрилонитрила методом газохроматографического анализа, отличающийся тем, что подготовку пробы крови к анализу производят путем подкисления ее 1%-ным водным раствором серной кислоты до рН 2-3, последующего осуществления экстракции акрилонитрила диэтиловым эфиром, объем которого соотносится с объемом пробы крови как 1:1, и центрифурирования при 6000 об/мин в течение 10 мин для отделения белков от экстракта, далее с помощью метода газохроматографического анализа, используя градуировочный график, производят определение в полученном экстракте количественного содержания акрилонитрила.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что экстракцию акрилонитрила диэтиловым эфиром производят в течение 1-2 мин.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что подкисление пробы 1%-ным водным раствором серной кислотой производят в объемном соотношении с пробой как 1:4.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что газохроматографическое определение акрилонитрила в крови осуществляют с использованием газового хроматографа "Кристалл-5000" с термоионным детектором на капиллярной колонке DB-624-30m*0,32mm*0,25µ,m при температурном режиме: колонка - от 50-200°С, испаритель - 200°С; детектор - 250°С; расход газа-носителя 1 (азот) - 1,4 см3/мин; расход газа-носителя 2 (азот) - 20 см3/мин.
