Способ распознавания и классификации 3-оксостероидов и их метаболитов при допинговом контроле спортсменов



Способ распознавания и классификации 3-оксостероидов и их метаболитов при допинговом контроле спортсменов
Способ распознавания и классификации 3-оксостероидов и их метаболитов при допинговом контроле спортсменов
Способ распознавания и классификации 3-оксостероидов и их метаболитов при допинговом контроле спортсменов
Способ распознавания и классификации 3-оксостероидов и их метаболитов при допинговом контроле спортсменов
Способ распознавания и классификации 3-оксостероидов и их метаболитов при допинговом контроле спортсменов
Способ распознавания и классификации 3-оксостероидов и их метаболитов при допинговом контроле спортсменов

 


Владельцы патента RU 2452967:

Федеральное государственное унитарное предприятие "Антидопинговый центр" (RU)

Изобретение относится к области медицины, а точнее к способам идентификации и определения стероидов и их метаболитов, и может быть использовано при допинговом контроле. Сущность способа: в плазме крови определяют наличие и положение двойных связей и связанных с ними отличий в структурных характеристиках. Известные и исследуемые стероиды химически модифицируют по карбоксильной группе (оксимы), снимают и регистрируют их масс-спектры, выбирают из масс-спектров характеристичные ионы (Iс) и нейтральные потери (Do). Сравнивают выбранные Iс и Do с таковыми у известных оксимов 3-оксостероидов по абсолютной величине значений. При этом принимают во внимание только значения аналогичных Ic и Do с обеих сторон, разнящиеся не более чем на 0,3%, и на основании результатов сравнения идентифицируют оксимы 3-оксостероидов. Использование способа обеспечивает высокую точность распознавания и классификации 3-оксостероидов и их метаболитов при допинговом контроле спортсменов, снижает порог детектирования. Также позволяет уменьшить количество плазмы крови, необходимое для проведения анализа, при одновременном сокращении времени проведения анализа. 4 табл., 1 пр., 5 ил.

 

Изобретение относится к области медицины, а точнее к способам идентификации и определения стероидов и их метаболитов, и может быть использовано при допинговом контроле.

Известен способ распознавания и идентификации стероидов методом газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим детектором [1].

Основным недостатком указанного способа является низкая производительность процесса (одновременно можно анализировать 2-3 вещества), при этом достоверность результатов анализа не превышает 0,85, что сказывается на интерпретации результатов.

Известны также способы распознавания и идентификации анаболических андрогенных стероидов методами высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией [2-5].

Основным недостатком указанных технических решений также является низкая производительность процесса (одновременно можно анализировать 2-3 вещества) при достоверности результатов анализа не более 0,95, что также сказывается на интерпретации результатов, а кроме того, необходимые для детектирования нижние пределы концентрации определяемых веществ достаточно высоки и составляют от 10 до 2 нг/мл.

Техническим результатом, на достижение которого направлено создание данного изобретения, является обеспечение высокой точности и достоверности распознавания и классификации стероидов при одновременном уменьшении количества анализируемой биологической жидкости (плазмы крови), снижении нижнего предела детектирования и сокращении времени проведения анализа.

Поставленный технический результат достигается тем, что для способа идентификации 3-оксостероидов при исследовании плазмы крови, заключающегося в определении наличия и положения двойных связей и связанных с ними отличий в структурных характеристиках, известные и исследуемые стероиды химически модифицируют по карбоксильной группе (оксимы), снимают и регистрируют их масс-спектры, выбирают из масс-спектров характеристичные ионы (Iс) и нейтральные потери (Do), сравнивают выбранные Iс и Do с таковыми у известных оксимов 3-оксостероидов по абсолютной величине значений, при этом принимают во внимание только значения аналогичных Iс и Do с обеих сторон, разнящиеся не более чем на 0,3%, и на основании результатов сравнения идентифицируют оксимы 3-оксостероидов.

Анаболические андрогенные стероиды (ААС) самый распространенный класс соединений, которыми злоупотребляют спортсмены для достижения высоких спортивных результатов [6], и в списке запрещенных веществ Всемирного Антидопингового Агентства (ВАДА) [7] они стоят на первом месте в группе S1.

По мнению авторов, получение тех или иных производных анаболических стероидов, а именно введение в стероидную структуру фрагментов несущих постоянный заряд или легко ионизирующихся, в условиях реакций диссоциации, индуцированных соударениями, позволяет проводить идентификацию не только известных стероидов, но и изучать пути масс-спектрометрического распада новых (ранее неизвестных) стероидных структур и их предполагаемых метаболитов.

3-Оксостероиды - это стероиды, содержащие в качестве заместителя кислород у атома углерода в положении 3 в молекуле гонана (циклопентанпергидрофенантрена), являющегося основой всех стероидов. 3-Оксостероиды являются чрезвычайно важными гормонами и в зависимости от природы и местоположения заместителей, а также от наличия и местоположения двойных связей в молекуле проявляют различные регуляторные функции в организме. В настоящее время синтезировано большое количество различных стероидов (экзогенные), в том числе 3-оксостероидов, которые по функциональным свойствам не только повторяют, но и существенно превосходят природные стероиды, вырабатываемые организмом (эндогенные). Такие экзогенные стероиды, в частности тестостерон, андростендион и др., могут быть использованы и используются в качестве допинга. Поэтому для допинг-контроля спортсменов определение 3-оксостероидов и продуктов их метаболизма является чрезвычайно важным, но в то же время и чрезвычайно затруднительным. Причин тому несколько, но наиболее важной из них является химическая инертность стероидов. Так, например, 3-оксостероид можно получить дегидрированием гидрокортизона, а восстановить при довольно жестких условиях в присутствии катализатора Генбеста. Стероиды слабо ионизируются в процессе проведения ВЭЖХ-МС/МС-анализа с электрораспылительной ионизацией. Указанное обстоятельство приводит к тому, что для получения достоверных результатов анализа приходится исследовать большие количества анализируемого вещества. Кроме того, пределы детектирования стероидов при проведении вышеуказанного анализа составляют от 10 нг/мл до 2,0 нг/мл, чего явно недостаточно для достоверного анализа при содержании стероидов и продуктов их метаболизма <10,0 и до 2,0 пг/мл.

Следует заметить, что в нашем случае оксостероиды модифицируют по кетогруппе.

Стандартные растворы аналитов могут быть приготовлены растворением точных навесок в точном объеме растворителя, например метанола. Рабочие растворы могут быть получены разбавлением до соответствующей концентрации.

В качестве химических модификаторов может быть использован гидроксиламин.

В качестве элюента могут быть использованы, например, смеси метанола, ацетата аммония и муравьиной кислоты.

В качестве экстрагента для ЖЖЭ может быть использован метилтретбутиловый эфир (МТБЭ).

В качестве регуляторов рН могут быть использованы гидрокарбонат натрия и карбонат калия.

В качестве системы ВЭЖХ-МС/МС могут быть использованы хромато-масс-спектрометр с тройным квадрупольным анализатором TSQ Quantum фирмы Thermo Finnigan (США), соединенным с высокоэффективным жидкостным хроматографом модели Surveyor, оснащенным автосамплером, насосом высокого давления и дегазатором фирмы Thermo Finnigan (США).

В качестве вспомогательного оборудования могут быть использованы:

- автоматический шейкер фирмы Glas-Col®, США - для ЖЖЭ;

- центрифуга марки Rotina 46R фирмы Hettich (ФРГ) для получения контрастной поверхности раздела между органической и водной фазами;

- упариватель фирмы Barnstead Inc. (CUJA), совмещенный с генератором азота марки Mistral-4 фирмы Schmidlin-DBS AG (Чехия) для упаривания органического экстракта;

- колонка Eclipse XDB-C18, 150×2.1 мм, размер частиц 5 мкм, размер пор 100 Á, фирмы Agilent (США) для хроматографического разделения.

В качестве мобильной фазы может быть использована система: 0,05% раствор муравьиной кислоты с 20 мМ раствором ацетата аммония (рН 3.0) (А) и метанол (В).

В качестве внутренних стандартов (ISTD) могут быть использованы, например, D3-тестостерон и метилтестостерон.

В качестве 3-оксостероидов могут быть выбраны, например, тестостерон, метил-1-тестостерон, болдион, андростандион и другие подобные 3-оксостероиды.

Нейтральные потери - это потери исследуемой молекулой структурных фрагментов в процессе проведения масс-спектрометрического анализа. Следует заметить, что указанных потерь структурных фрагментов в процессе электрораспылительной ионизации может насчитываться довольно большое число, и при этом структурные фрагменты могут быть одинаковыми (например, одновременная потеря двух молекул воды) или, что чаще всего происходит на практике, разной природы и соответственно разной молекулярной массы. Вклад нейтральных потерь в суммарную информацию об исследуемом объекте достаточно велик и поэтому категория «нейтральные потери» как материальный объект, сопутствующий анализу, и была выбрана авторами в качестве критерия, вносящего существенный вклад в информацию об исследуемом веществе и, в частности, в установление его структуры.

Изобретение может быть осуществлено следующим образом.

Растворяют точные навески веществ-эталонов в органических растворителях, каждую аликвоту модифицируют гидроксиламином в кислой среде, органические компоненты каждой модифицированной аликвоты количественно отделяют, упаривают в токе азота, перерастворяют сухие остатки в мобильной фазе и далее каждую аликвоту вводят в систему ВЭЖХ-МС/МС с электрораспылительной ионизацией в режиме регистрации положительных ионов. Снимают и регистрируют хроматографические и масс-спектрометрические характеристики веществ-эталонов (детектируют полный МС/МС-спектр, определяют время удержания, молекулярную массу, прекурсор-ионы, характеристичные ионы, нижний предел обнаружения и определяют нейтральные потери). Одновременно готовят пробы исследуемых биологических жидкостей по аналогичной схеме и также снимают и регистрируют их хроматографические и масс-спектрометрические характеристики; далее выбирают из масс-спектров исследуемых биологических жидкостей Iс и Do, которые несут информацию о наличии и/или положении двойных связей в молекуле, для чего сравнивают выбранные Iс и Do с таковыми у известных оксимов 3-оксистероидов по абсолютной величине значений, при этом принимают во внимание только значения аналогичных Iс и Do с обеих сторон, разнящиеся не более чем на 0,3%, и на основании результатов сравнения разбивают данные о Iс и Do на группы соответствия структурным характеристикам известных оксимов 3-оксостероидов, для чего составляют таблицу соответствия выбранных Iс и Do структурным характеристикам известных оксимов 3-оксостероидов и на основании местоположения выбранных Iс и Do в группе соответствия классифицируют природу и структуру распознанных оксимов 3-оксостероидов.

Для лучшего понимания изобретение может быть проиллюстрировано, но не исчерпано следующими примерами его конкретного осуществления.

Пример 1.

А. Получение масс-спектров, определение характеристических ионов, времени удержания и пределов детектирования известных стероидов. Готовят стандартные растворы аналитов (1 мг/мл): тестостерон, метилтестостерон, андростендион, 1-тестостерон, метил-1-тестостерон, 1-андростендион, болденон, метандиенон, болдион, дигидротестостерон, местанолдон, 5α-андростан-3,17-дион. Рабочие растворы готовят растворением точной навески стероидов - эталонов в метаноле. Далее получают рабочие растворы стероидов разбавлением стандартных растворов до содержания 10 мкг/мл. Из каждого рабочего раствора отбирают аликвоты объемом 100 мкл, вводят внутренний стандарт (D3-тестостерон и метилтестостерон) и химически модифицируют их. Параметры модификации: гидроксиламином в кислой (HCl) среде - 30-35 мин, 60-70°С. Органический слой модифицированных аликвот количественно отделяют, упаривают в токе азота, перерастворяют сухой остаток в мобильной фазе состава: 0,05% раствор муравьиной кислоты с 20 мМ раствором ацетата аммония (рН 3.0).

Приготовленные таким образом рабочие растворы вводят в систему ВЭЖХ-МС/МС (хромато-масс-спектрометр с тройным квадрупольным анализатором TSQ Quantum фирмы Thermo Finnigan (США), соединенным с высокоэффективным жидкостным хроматографом модели Surveyor, оснащенным автосамплером, насосом высокого давления и дегазатором фирмы Thermo Finnigan (США)). Анализ ведут при скорости потока подвижной фазы 0.2 мл/мин. Определяемые вещества разделяют градиентным элюированием при условиях: 0 мин - 40% В; 8-9 мин - 90% В; 12-18 мин - 40% В; общее время анализа с учетом стабилизации системы перед вводом следующего образца составляет 18 мин. Ионизацию при атмосферном давлении осуществляют электрораспылением в режиме регистрации положительных ионов. Напряжение на капилляре - 3.8 кВ; температура капилляра 245°С; скорость потока осушающего газа (азот) - 0.45 л/мин; скорость потока газа (аргон) в камере соударения - 0.075 л/мин; температура в камере ионизации 200°С; давление на распылителе - 2 атм.

Детектирование определяемых веществ проводят в режиме регистрации селективных реакций (SRM). Ширина пика для прекурсор-ионов и соответствующих характерных ионов на первом квадруполе (Q1) и третьем квадруполе (Q3) составляет 0.5 а.е.м. (на половине высоты), время задержки - 5 мс. Обработку полученных данных (масс-спектры, характеристические ионы, время удержания и пределы детектирования исследуемых стероидов) проводят с применением программного обеспечения Xcalibur версии 1.3 фирмы Thermo Finnigan, США.

Результаты анализа стероидов-эталонов представлены в таблице.

Таблица 1
Известный оксим-3-оксостероид Характеристич. ионы I c Нейтральные потери Do Примечание
Тестостерон 304, 286, 124, 112 18 I
Метил-1-тестостерон 318, 300, 286, 201 117 III
1-Андростендион 317, 299, 285, 218, 185 117 (99+18) III
Дигидротестостерон 306, 288, 274, 159, 133 18, 36 (18+18) IV
Андростендион 317, 124, 112 36 (18+18) I
5α-Андростан-3,17-дион 319, 301, 286, 159, 133 18 IV
Метандиенон 316, 299, 280, 256, 136, 120 60, 18, 36 (18+18) II
Метилтестостерон 318, 300, 282, 124, 112 18, 36 (18+18) I
Болденон 302, 285, 266, 242, 136, 120 60, 18, 36 (18+18) II
Болдион 315, 298, 281, 255, 136, 120 60, 18, 36 (18+18) II
Местанолон 320, 302, 288, 159, 133 18, 36 (18+18) IV
1-Тестостерон 304, 286, 272, 201, 187, 117 III

Сопоставление выбранных характеристичных ионов, несущих информацию о наличии и/или положении двойных связей в молекуле (в Таблице 1 выделены жирным шрифтом), и нейтральных потерь при анализе масс-спектров 12 исследованных оксимов 3-оксостероидов позволяет выделить четыре группы соответствия выбранных характеристичных ионов и нейтральных потерь структурным характеристикам исследованных 3-оксостероидов (в Таблице 1 в графе «Примечание» обозначены римскими цифрами от I до IV)

Б. Подготовка проб и анализ исследуемых образцов плазмы крови.

У трех спортсменов из группы риска (мужчины, 22, 23 и 27 лет) получают образцы крови забором из пальца (по 150,0 мкл), отделяют плазму и делят ее на две аликвоты (объемом 20,0 и 30,0 мкл) и далее к каждому образцу плазмы крови первой аликвоты объемом 20,0 мкл добавляют 50 мкл раствора внутренннего стандарта, содержащего D3-тестостерон (10 нг/мкл) и метилтестостерон (10 нг/мкл), и химически модифицируют их. Параметры модификации: гидроксиламином в кислой (HCl) среде - 30-35 мин, 60-70°С. Модифицированные аликвоты подщелачивают до рН 9.5-10.0 смесью гидрокарбоната натрия и карбоната калия (1:2), добавляют 5 г сульфата аммония и далее экстрагируют с 5 мл МТБЭ в течение 10 мин на автоматическом экстракторе. Центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин, органический экстракт упаривают досуха в токе азота. Сухой остаток растворяют в 100 мкл метанола, затем 15 мкл раствора вводят в систему ВЭЖХ-МС/МС с электрораспылительной ионизацией при атмосферном давлении в режиме регистрации положительных ионов. Анализ ведут при следующих параметрах. Скорость потока подвижной фазы 0,2 мл/мин. Определяемые вещества разделяют градиентным элюированием при условиях: 0 мин - 40% В; 8-9 мин - 90% В; 12-18 мин - 40% В, общее время анализа с учетом стабилизации системы перед вводом следующего образца составляет 18 мин. Ионизацию при атмосферном давлении осуществляют электрораспылением в режиме регистрации положительных ионов. Напряжение на капилляре - 3.8 кВ; температура капилляра - 245°С; скорость потока осушающего газа (азот) - 0.45 л/мин; скорость потока газа (аргон) в камере соударения - 0.075 л/мин; температура в камере ионизации - 200°С; давление на распылителе - 2 атм. Детектирование определяемых веществ проводят в режиме регистрации селективных реакций (SRM). Ширина пика для прекурсор-ионов и соответствующих характерных ионов на первом квадруполе (Q1) и третьем квадруполе (Q3) составляет 0.5 а.е.м. (на половине высоты), время задержки - 5 мс.

Результаты анализа первой аликвоты образцов плазмы крови представлены в Таблицах 2, 3 и 4 (спортсмены 22, 23 и 27 лет соответственно).

Примечание: в таблицах представлены данные масс-спектров стероидов, совпадающих по характеристикам с рассматриваемыми четырьмя группами стероидов-эталонов.

Само собой разумеется, что если расширить список стероидов-эталонов (т.е. известных стероидов), то безусловно рассматриваемые 4 группы стероидов пополнятся новыми стероидами и их метаболитами, да и само число групп безусловно будет больше нежели четыре.

Таблица 2
Характеристичные ионы Нейтральные потери Нижний предел обнаружения Примечание
317, 124, 112 36 (18+18) 5,2 пг/мл Группа I
318, 300, 286, 201 117 6,0 пг/мл Группа III
Таблица 3
Характеристичные ионы Нейтральные потери Нижний предел обнаружения Примечание
304, 286, 124, 112 18 4,5 пг/мл Группа I
315, 298, 281, 255, 136, 120 60, 18, 36 (18+18) 8,3 пг/мл Группа II
Таблица 4
Характеристичные ионы Нейтральные потери Нижний предел обнаружения Примечание
320, 302, 288, 159, 133 18, 36 (18+18) 2,5 пг/мл Группа IV
317, 299, 285, 218, 185 117 (99+18) 5,3 пг/мл Группа III

По Таблицам 2-4 (графа «Примечание») установлена (распознана) принадлежность анализируемых стероидов к соответствующим группам и далее сами стероиды проклассифицированы (по сравнению выбранных характеристичных ионов).

Таким образом, у спортсменов из группы риска установлено наличие в плазме крови:

22 года - эндогенный стероид метил-1-тестостерон и экзогенный стероид андростендион,

23 года - экзогенный стероид тестостерон и эндогенный стероид болдион,

27 лет - эндогенные стероиды местанолон и 1-андростендион.

В. Сопоставительный анализ исследуемых образцов плазмы крови без дериватизации.

а) Пробоподготовку и анализ плазмы крови (по 30,0 мкл второй аликвоты каждого образца из части Б Примера 1) проводят как в Примере 1, за исключением того, что образцы не модифицируют гидроксиламином. Результаты анализа отрицательные - ни один стероид не был обнаружен.

б) У спортсмена (мужчина, 22 года) получают образец крови забором из вены (6,5 мл), отделяют плазму (объем 1,5 мл), добавляют 50 мкл раствора внутренннего стандарта, содержащего D3-тестостерон (10 нг/мкл) и метилтестостерон (10 нг/мкл), подщелачивают до рН 9.5-10.0 смесью гидрокарбоната натрия и карбоната калия (1:2), добавляют 5 г сульфата аммония и далее экстрагируют с 5 мл МТБЭ в течение 10 мин на автоматическом экстракторе. Центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин, органический экстракт упаривают досуха в токе азота. Сухой остаток растворяют в 100 мкл метанола, затем 15 мкл раствора вводят в систему ВЭЖХ-МС/МС. Анализ ведут при тех же параметрах, что и в части Б Примера 1. Результаты анализа представлены в виде МС-МС-спектров на стр.16 описания. Нижний предел обнаружения стероидов составляет 8 нг/мл (8000 пг/мл)

Как видно из описания, примера осуществления способа и сопоставительного анализа, заявляемое изобретение обеспечивает высокую точность распознавания и классификации 3-оксостероидов и их метаболитов при допинговом контроле спортсменов, снижает порог детектирования, позволяет уменьшить количество плазмы крови, необходимое для проведения анализа, при одновременном сокращении времени проведения анализа.

Масс-спектры оксимов 3-оксостероидов (представлены масс-спектры трех стероидов-эталонов из 12). Стрелками обозначены нейтральные потери и представлены их значения.

1-тестостерон оксим

Метил-1-тестостерон оксим

1-андростерон оксим

**Фактически нейтральные потери оксима 1-андростерона составляют 117 {99+18(-Н20)}

МС/МС-спектры плазмы крови из части «В» Примера 1 (соспоставительной)

Следует отметить, что по значениям характеристичных ионов МС-спектры не совпадают и не кореллируют ни с одной из установленных 4-х групп 3-оксостероидов-эталонов.

Способ идентификации 3-оксостероидов при исследовании плазмы крови, заключающийся в определении наличия и положения двойных связей и связанных с ними отличий в структурных характеристиках, при этом известные и исследуемые стероиды химически модифицируют по карбоксильной группе (оксимы), снимают и регистрируют их масс-спектры, выбирают из масс-спектров характеристичные ионы (Iс) и нейтральные потери (Do), сравнивают выбранные Iс и Do с таковыми у известных оксимов 3-оксостероидов по абсолютной величине значений, при этом принимают во внимание только значения аналогичных Iс и Do с обеих сторон, разнящиеся не более чем на 0,3%, и на основании результатов сравнения идентифицируют оксимы 3-оксостероидов.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области медицины, а именно перинатологии, неонатологии и неврологии. .
Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству, и может быть использовано для прогнозирования дискоординации родовой деятельности. .
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для своевременного выявления у женщин, больных раком легкого, метастатического поражения головного мозга.
Изобретение относится к области медицины, а именно к эндокринологии, и может быть использовано для диагностики андрогенного дефицита. .

Изобретение относится к медицине, а именно к нейроонкологии, и может быть использовано для прогнозирования выживаемости больных с низкодифференцированными глиальными опухолями головного мозга.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии. .
Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и предназначено для прогнозирования состояния фертильности у женщин репродуктивного возраста с миомой матки.
Изобретение относится к медицине, в частности к гинекологии, и касается способа прогнозирования наступления беременности в результате лечения пациенток в стандартном длинном протоколе ЭКО и ПЭ.
Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии и гинекологии, и касается способа прогнозирования эффективности лечения больных с синдромом поликистозных яичников (СПКЯ) метформином и/или снижением веса.
Изобретение относится к области медицины, а именно эндокринологии. .

Изобретение относится к медицине, в частности к урологии, и может быть использовано для лечения дисфункции мочевого пузыря у детей. .
Изобретение относится к области медицины, а именно к сексопатологии, и касается лечения психогенной эректильной дисфункции (импотенции). .

Изобретение относится к медицине, психологии и предназначено для определения мотивационной направленности (МН) индивида. .
Изобретение относится к психиатрии и медицинской психологии и может быть использовано при психодиагностике отношений психически больных к их жизни. .
Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии. .

Изобретение относится к медицинской технике, а именно к инструменту для введения чрескожного датчика, который содержит чувствительную часть, например, для регистрации содержания глюкозы в крови.
Изобретение относится к медицине, а именно к комбустиологии, травматологии, реаниматологии и наркологии, и может быть использовано при лечении пострадавших от термических ожогов, находящихся в состоянии алкогольного опьянения.
Изобретение относится к медицине, а именно к комбустиологии, травматологии, реаниматологии и наркологии, и может быть использовано при лечении пострадавших от термических ожогов, находящихся в состоянии алкогольного опьянения.
Изобретение относится к медицине, а именно к реаниматологии и наркологии, и может быть использовано при проведении дезинтоксикационно-инфузионной терапии у больных в состоянии алкогольного опьянения.
Наверх