Применение производных трииндолилметана в качестве противоопухолевых средств

Изобретение относится к фармацевтике и медицине и касается производных трииндолилметана формулы (I) и (II) в качестве противоопухолевых средств, обладающих цитотоксическим, апоптотическим действием на опухолевые клетки, а также блокирующих активность транскриптационного фактора NFkB. Соединения обладают высокой противоопухолевой активностью. 4 ил., 3 табл. 4 пр.

 

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, и касается производных трииндолилметана в качестве противоопухолевых средств, обладающих цитотоксическим, апоптотическим действием на опухолевые клетки, а также блокирующих активность транскриптационного фактора NFkB.

В настоящее время основными способами лечения рака остаются хирургический и химиотерапевтический. Эффективность противоопухолевого лечения, особенно у пациентов с III-IV стадиями заболевания, невысока. Существует потребность в разработке новых высокоэффективных противоопухолевых препаратов оригинального действия, обладающих низкой токсичностью. В настоящее время проводятся активные исследования в области создания новых высокоэффективных противоопухолевых агентов, особенно так называемых «таргетных» препаратов, блокирующих определенные белки-мишени в опухолевых клетках, применение которых может снизить смертность от онкологических заболеваний и улучшить качество жизни. Лекарственная резистентность опухоли к традиционным химиопрепаратам может возникать при ингибировании запуска программированной гибели клетки - апоптоза. Разработка новых оригинальных классов противоопухолевых веществ, восстанавливающих чувствительность опухолевых клеток к индукции апоптоза, или поиск других мишеней для запуска клеточной гибели являются актуальными подходами.

Близкими к заявляемым веществам по механизму действия являются трифенилметиламиды (ТРМА) - производные трифенилуксусной кислоты, которые существенно понижают уровень активного ядерного фактора NFkB, вызывают торможение клеток меланомы в G₁ фазе клеточного цикла и апоптоз. ТРМА мало токсичны для клеток костного мозга здоровых доноров, и высокие дозы препаратов хорошо переносятся при введении мышам (Robin S. Dothager, Karson S. Putt, Brittany J. Allen, Benjamin J. Leslie, Vitaliy Nesterenko, and Paul J. Hergenrother. // Synthesis and Identification of Small Molecules that Potently Induce Apoptosis in Melanoma Cells through G1 Cell Cycle Arrest J. Am. Chem. Soc, 2005, 127, 8686-8696). Недостатком ТРМА является их невысокая активность.

Наиболее близкими к заявляемым веществам по структуре являются их полные структурные аналоги - производные триндолилметанов формулы I и II в качестве антимикробных и противогрибковых препаратов (патент RU 2388749).

Задача настоящего изобретения: оценить возможность применения производных трииндолилметана в качестве противоопухолевых средств.

С этой целью предлагается применение производных трииндолилметана, соответствующих формулам I и II с указанными радикалами в качестве противоопухолевых средств.

где R₁; R₇; R₁₃ представляют собой независимо водород, алкил, замещенный алкил, арил, гетероарил;

R₂; R₈; R₁₄ представляют собой независимо водород, алкил, замещенный алкил. Положение и количество любых заместителей могут варьировать. Любой из заместителей может в свою очередь быть замещенным;

R₃-R₆; R₉-R₁₂; R₁₅-R₁₈ представляют собой независимо водород, алкил, замещенный алкил, арил, галоген, -ОН, -OR, где R представляет собой алкил или замещенный алкил. Положение и количество любых заместителей могут варьировать. Любой из заместителей может в свою очередь быть замещенным;

Y^- представляет собой анион любой фармацевтически приемлемой органической или неорганической кислоты;

R₁₉ представляет собой водород или алкил.

Вышеуказанные формулы включают в себя также любые стереоизомеры - энантиомеры или диастереомеры (индивидуальные, рацематы, обогащенные одной из форм и т.д.) в случае, если существование таковых возможно.

Вышеуказанные формулы включают в себя любые агрегатные состояния указанных соединений, в том числе аморфные формы, кристаллические формы, сольваты.

Вышеуказанные формулы включают в себя также любые фармацевтически приемлемые солевые формы перечисленного в случае, если существование таковых возможно.

«Фармацевтически приемлемые соли» - соли, которые являются безопасными в биологическом или ином отношении, нетоксичными и приемлемыми как в ветеринарии, так и в фармацевтике и обладают необходимой фармакологической активностью исходного соединения. Фармацевтически приемлемые соли являются солями неорганических кислот, таких как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, иодистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и т.п., или солями органических кислот, таких как муравьиная, уксусная, пропионовая, бензойная, бензолсульфоновая, толуолсульфоновая, этансульфоновая, метансульфоновая, камфорсульфоновая, янтарная, фумаровая, малеиновая, молочная, яблочная, миндальная, винная, лимонная, глюконовая, глюкуроновая, гликолевая, салициловая, триметилуксусная и т.п. Подразумевается, что все фармацевтически приемлемые соли включают сольваты или кристаллические формы указанной соли

«Сольваты» - сольватированные формы, содержащие стехиометрическое или нестехиометрическое количество растворителя.

В Табл.1 и 2 приведены примеры биологической активности веществ - производных трииндолилметанов, соответствующих формулам I и II.

Ингибирование роста опухолевых клеток является индикатором противоопухолевой активности, широко используемым для описания противоопухолевых свойств новых лекарственных средств. Цитотоксическую активность соединений тестировали на панели клеточных линий опухолей человека различного гистогенеза (Пример 1, Табл. 1, Фиг.1). Максимальное ингибирование опухолевого роста наблюдалось для клеточной линии метастатической меланомы кожи Mel Kor. Показано, что клеточная гибель клеток линии Jurkat под действием соединений происходит путем апоптоза (Пример 2, Табл. 2, Фиг.2). Оценка апоптоза проводилась иммунофлуоресцентным методом путем окрашивания клеток Jurkat красителем Annexin V-FITC через 48 часов инкубации клеток с соединениями при оценке на проточном цитофлуориметре. Одним из механизмов действия производных трииндолилметанов на опухолевые клетки является блокирование уровня активации белка NFkB (Пример 3, Фиг.3). Показана противоопухолевая активность производных трииндолилметанов на мышах B6D2F1 с перевиваемой меланомой В16 (Пример 4, Фиг.4).

Пример 1. Цитотоксическое действие производных трииндолилметанов на клеточные линии опухолей человека in vitro

Противоопухолевая активность соединений была оценена на семи клеточных линиях опухолей человека с использованием МТТ (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид) теста. В исследовании были использованы следующие клеточные линии опухолей человека: НСТ116 (рак прямой кишки); К562 (эритромиелобластный лейкоз); Jurkat (Т-клеточный лимфобластный лейкоз); mel Kor (диссеминированная меланома кожи); SKOV-3 (рак яичников); MCF-7 (рак молочной железы) и SK-BR-3 (рак молочной железы). Соединения были тестированы в диапазоне концентраций от 10 мкМ и до 1 нМ.

Опухолевые клетки в количестве 10⁵-10⁶ клеток/мл вносили в лунки плоскодонного 96-луночного планшета в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной сыворотки, 2 мМ глутамина. Через 24 часа в лунки добавляли заявляемые вещества в различных концентрациях. В качестве контроля использовали опухолевые клетки, к которым добавляли только растворитель. Инкубацию с препаратом проводили 48 часов, затем добавляли МТТ в конечной концентрации 0,5 мг/мл. Клетки инкубировали 4 часа, затем среду отбирали и клетки растворяли в ДМСО. Оптическую плотность (OD) оценивали на анализаторе BioTek ELx808 при 520 нм, используя ДМСО как нулевой контроль. Исследования повторяли не менее 3 раз.

Цитотоксический эффект веществ в различной концентрации выражали в количестве жизнеспособных клеток относительно контроля (в %). Количество жизнеспособных клеток определяли как [(OD обработанных клеток)/(OD необработанных клеток)]×100. Определен параметр цитотоксического действия препарата - IC₅₀ (ингибирующая доза, при которой блокируется жизнеспособность 50% клеток).

Цитотоксическое действие соединений на клеточные линии опухолей человека (рак прямой кишки НСТ116; эритромиелобластный лейкоз К562; Т-клеточный лимфобластный лейкоз Jurkat; диссеминированная меланома кожи Mel Kor; рак яичников SKOV-3 и рак молочной железы MCF-7 и SK-BR-3) представлено в значениях IC₅₀ (выраженных в микромолях) некоторых соединений изобретения (Табл.1). На Фиг.1 представлены типичные кривые выживаемости клеток опухолевых линий под действием различных концентраций препаратов на примере заявляемого вещества LCTA 1575.

Из представленных данных в Табл.1 и на Фиг.1 видно, что заявленные вещества обладают значимой и достоверной противоопухолевой активностью в отношении различных клеточных линий опухолей человека в диапазоне концентраций от 10 до 0,01 мкМ. Наибольшую цитотоксическую активность показывают вещества LCTA 1574, LCTA 1578, LCTA 1950, LCTA 1589, для них IС₅₀ составляет диапазон доз от 0,1 до 0,01 мкМ. Производные трииндолилметанов, соответствующие формулам I и II, обладают более высокой противоопухолевой активностью по отношению к опухолевым клетками меланомы кожи линии Mel Kor.

Пример 2. Апоптотическая активность производных трииндолилметанов in vitro

Тестирование проводили на клеточной линии Т-клеточного лейкоза Jurkat. Клетки культивировались в среде RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 2 mМ глутамина, антибиотики (100 IU/mL пенициллина и 100 mg/ml стрептомицина).

Оценку апоптоза проводили по окрашиванию на Аннексин V с помощью тест-набора FITC Annexin V Apoptosis Detection kit (BD Pharmingen).

Клетки Jurkat в количестве 1,25×10⁵ клеток/мл вносили в лунки плоскодонного 96-луночного планшета в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной сыворотки, 2 мМ глутамина и инкубировали с веществами в течение 48 часов. Клетки отмывали в холодном фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и добавляли к клеткам 100 мкл Аннексин V-связывающий буфер. Добавляли 5 мкл Аннексина V и 5 мкл пропидий йодида и инкубировали 15 минут при комнатной температуре в темноте. Флуоресцентную активность клеток определяли с помощью проточного цитофлуориметра Becton Dickenson FacsCallibur при 525 нм (зеленый канал, FL1, Аннексин V) и 675 нм (красный канал, FL2, пропидий йодид). Анализировали не менее 10 тысяч клеток. Исследования повторяли не менее 3 раз.

Апоптотическую активность производных трииндолилметанов выражали в количестве апоптотических клеток относительно общего количества клеток в пробе (в %). Количество апоптотических клеток определяли как [(количество клеток, окрашенных Аннексином V)/(общее количество клеток)]×100.

Заявляемые вещества индуцируют апоптотическую гибель клеток линии Т-клеточного лимфобластного лейкоза Jurkat в зависимости от дозы вводимого вещества (Табл.2). Из представленных данных в Табл.2 видно, что большинство веществ в концентрации 1 мкМ значимо увеличивают количество апоптотических клеток. Высокую апоптотическую активность проявляют вещества LCTA 1574, LCTA 1575, LCTA 1340, LCTA 1950. На Фиг.2 представлен типичный дотплот окрашенных на Аннексии V клеток линии Jurkat под действием вещества LCTA 1575 (0,1 мкМ) (А - контрольные клетки Jurkat без обработки веществом; Б - клетки Jurkat после 48 часов инкубации с LCTA 1575 (0,1 мкМ)). Наблюдалось увеличение количества клеток, окрашенных Аннексином V, по сравнению с контролем.

Пример 3. Ингибирование активности белка NFkB под действием производных трииндолилметанов in vitro

Белок NFkB регулирует экспрессию различных генов (в том числе и некоторых протоонкогенов), вовлеченных в ингибирование апоптоза, повышение выживаемости клеток и их пролиферативной активности, стимуляцию ангиогенеза и метастазирования - основных процессов, участвующих в развитии и прогрессии опухолей. Активированный NFkB транслоцируется в ядро и запускает транскрипцию различных генов, в том числе и антиапоптотических. Белок NFkB является перспективной мишенью для действия современных противоопухолевых препаратов направленного механизма действия.

Проведено изучение влияния заявляемых веществ в нецитотоксической концентрации на уровень активированной субъединицы NFkB p65. Оценку ингибирования активности белка NFkB проводили с помощью флуоресцентного иммуноцитохимического метода при инкубации с первичными антителами против активированной субъединицы р65 NFkB.

Клетки Jurkat в количестве 1,25×10⁵ клеток/мл вносили в лунки плоскодонного 96-луночного планшета в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной сыворотки, 2 мМ глутамина и инкубировали с препаратами в нецитотоксических дозах в течение 48 часов. Клетки промывали 2 раза в холодном ФСБ и осаживали на стекла с помощью цитоцентрифуги, затем клетки фиксировали в спирте в течение 5 минут и ацетоне в течение 3 минут, далее обрабатывали в растворе ФСБ, содержащем 1% Тритон Х-100, в течение 5 минут. Затем стекла инкубировали в течение 10 минут в ФСБ, содержащей 5% BSA для блокирования неспецифического связывания. Первичные антитела против активной субъединицы NFkB p65 (MAB3026, Chemicon) наносили на 1 час. В качестве вторичных антител использовали антитела, конъюгированные с красителем Alexa Fluor 594 (А11005, Invitrogen). Препараты докрашивали Hoechst-33258 (2 мкг/мл). Препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Nikon 80i при увеличении 400х.

Заявляемые вещества снижают уровень экспрессии активированной субъединицы р65 в клетках Jurkat, а также блокируют ее транслокацию в ядро (Табл. 3).

На Фиг.3 показано, что вещество LCTA 1575 снижает активность белка NFkB. В необработанных клетках Jurkat экспрессируется значительный уровень активированного NFkB. Наблюдается окрашивание цитоплазмы и ядер опухолевых клеток антителами к активированной форме NFkB флуоресцентным красителем красного цвета, которое совмещается с голубым окрашиванием ядер клеток (Фиг.3,А). При инкубации клеток Jurkat с веществом LCTA 1575 (10^-8 М) в течение 48 часов наблюдается значительное снижение уровня активированного NFkB. В окрашенных клетках отсутствует флуоресцентное окрашивание антителами к активированной форме NFkB (Фиг.3,Б). Аналогичные результаты получены и для других веществ группы.

Пример 4. Противоопухолевая активность производных трииндолилметанов in vivo

Противоопухолевая активность вещества LCTA 1578 in vivo изучена по ингибированию роста привитой мышам меланомы В16.

Меланому В16 прививали по 10⁶ клеток самцам мышей B6D2F1 подкожно. Вещество LCTA 1578 вводили в дозах 7,5 и 12,5 мг/кг девятикратно каждые три дня (день прививки опухоли - 0) внутрибрюшинно. Измерение размеров опухоли начинали после появления пальпируемых опухолей. В дальнейшем измерение проводили каждые 3-4 дня. Измеряли длину, ширину и высоту опухоли (мм).

Противоопухолевый эффект по торможению роста опухоли (ТРО) определяли по общепринятому показателю, рассчитанному как соотношение средних объемов опухолей в леченой и контрольной группах (в %). ТРО вычисляли по формуле (V_K-V_O)/V_K×100, где V_{K -} средний объем опухоли в контрольной группе (мм³); V_O - средний объем опухоли в опытной группе (мм³). Объем опухолей у мышей вычисляли по формуле: V(мм³)=L×S×Н, где L, S, Н - длина, ширина и высота опухоли (мм).

Результаты исследований приведены на Фиг.4. Из Фиг.4 следует, что торможение роста меланомы В16 для вещества LCTA 1578, введенного в дозах 7,5 и 12,5 мг/кг, 100% на 14-й день наблюдения и 60-70% на 25-й день наблюдения.

Технический результат изобретения состоит в том, что производные трииндолилметанов, соответствующие формулам I и II, обладают противоопухолевым действием: имеют цитотоксическое действие, усиливают апоптотическую активность и ингибируют активность белка NFkB в опухолевых клетках.

Таблица 1
Применение производных трииндолилметана в качестве противоопухолевых средств
Соединение	Концентрация веществ, IC50 (µМ)+SD
НСТ116	К562	Jurkat	Mel Kor	SKOV-3	MCF-7	SK-BR-3
LCTA 1292
	2,3±0,2	1,6±0,4	Н.о*	Н.о	Н.о	Н.о	Н.о
трис(1H-индол-3-ил)метилия метансульфонат
LCTA 1320
	3,2±0,3	3,2±0,3	Н.о	Н.о	Н.о	Н.о	Н.о
трис(1-метил-1H-индол-3-ил)метилия метансульфонат
LCTA 1293
	1,3±0,3	0,2±0,1	0,5±0,2	0,22±0,04	2,26±0,42	1,31±0,16	2,17±0,95
трис(1-этил-1H-индол-3-ил)метилия метансульфонат
LCTA 1319
	1,0±0,3	0,2±0,1	0,27±0,01	0,24±0,07	0,81±0,03	1,84±0,66	1,76±0,01
трис(1-пропил-1Н-индол-3-ил)метилия метансульфонат
LCTA 1574
	0,3±0,1	0,09±0,04	0,22±0,04	0,07±0,01	0,26±0,04	0,65±0,25	0,27±0,12
трис(1-бутил-1H-индол-3-ил)метилия метансульфонат
LCTA 1575
	15,0±2,2	9,3±2,1	0,04±0,01	0,06±0,02	0,33±0,06	0,49±0,15	2,47±0,09
трис{1-бензил-1H-индол-3-ил)метилия метансульфонат
LCTA 1578
	0,15±0,04	0,05±0,03	0,2±0,06	0,05±0,01	0,28±0,07	0,78±0,12	0,44±0,19
трис(1-пентил-1H-индол-3-ил)метилия метансульфонат
LCTA 1340
	0,3±0,1	0,07±0,03	0,49±0,01	0,62±0,18	3,81±2,64	>10	>10
трис(1-гексил-1Н-индол-3-ил)метилия метансульфонат
LCTA 1874
	Н.о	Н.о	1,13±0,16	0,42±0,08	4,11±2,18	4,66±1,12	6,39±1,85
трис(1-гептил-1H-индол-3-ил)метилия метансульфонат
LCTA 1576
	16,4±2,3	12,4±2,1	Н.о	Н.о	Н.о	Н.о	Н.о
трис(1-децил-1Н-индол-3-ил)метилия метансульфонат
LCTA 1950
	Н.о	Н.о	0,14±0,02	0,36±0,08	0,4±0,08	1,33±0,52	0,42±0,03
трис(1-изопентил-1H-индол-3-ил)метилия метансульфонат
LCTA 1949
	Н.о	Н.о	Н.о	>10	>10	>10	>10
трис(1-пентил-5-бромо-1H-индол-3-ил)метилия метансульфонат
LCTA 1875
	H.o	H.o	>10	0,95±0,06	4,58±1,64	>10	>10
трис(1-пентил-5-метокси-1H-индол-3-ил)метилия ацетат
LCTA 1984
	H.o	H.o	H.o	>10	>10	>10	>10
трис(1-(4′-хлорбутил)-1H-индол-3-ил)метилия метансульфонат
LCTA 1978
	H.o	H.o	H.o	0,51±0,13	0,88±0,3	3,24±0,26	0,87±0,02
трис(1-фенил-1H-индол-3-ил)метилия метансульфонат
LCTA 1401
	1,3±0,2	1,1±0,4	H.o	H.o	H.o	H.o	H.o
трис(2-метил-1H-индол-3-ил)метилия метансульфонат
LCTA 1376
	0,1	0,1	Н.о	Н.о	Н.о	Н.о	Н.о
3,3′-((1H-индол-3-ил)метилен)бис(2-метил-1-пропил-1Н-индола)метансульфонат
LCTA 2011
трис(5-метил-1Н-индол-3-ил)метилия метансульфонат	1,5±0,3	1,3±0,2	Н.о	Н.о	Н.о	Н.о	Н.о
LCTA 1590
	0,24±0,04	0,12±0,03	0,34±0,05	0,12±0,03	0,42±0,07	0,98±0,25	0,58±0,2
трис(1-пентил-1H-индол-3-ил)метанол
LCTA 1589
	0,4±0,1	0,11±0,04	0,32±0,05	0,15±0,02	0,35±0,05	0,83±0,31	0,04±0,15
трис(1-бутил-1H-индол-3-ил)метанол
*Не определялась.

Таблица 2
Применение производных трииндолилметана в качестве противоопухолевых средств
Препараты	% апоптотических клеток (±SD) при инкубации с веществами в концентрациях
1 мкМ	0,1 мкМ
LCTA 1574	50,83±0,47	21,21±5,14
LCTA 1578	66,27±4,64	6,99±1,84
LCTA 1319	30,48±7,55	5,71±1,52
LCTA 1293	19,64±7,82	5,27±1,39
LCTA 1874	24,89±2,4	15,7±1,87
LCTA 1875	24,51±2,5	17,8±0,45
LCTA 1575
	84,64±6,2	45,71±1,67
LCTA 1340
	52,54±6,84	13,39±0,7
LCTA 1950
	96,95±0,56	22,53±4,06

Таблица 3
Применение производных трииндолилметана в качестве противоопухолевых средств
Препараты	Снижение уровня экспрессии активированной субъединицы р65 NFkB в клетках Jurkat/блокирование ее транслокацию в ядро
0,1 мкМ
LCTA 1574	Да/Да
LCTA 1578	Да/Да
LCTA 1319	Да/Да
LCTA 1293	Да/Да
LCTA 1874	Да/Да
LCTA 1875	Да/Да
LCTA 1575
	Да/Да
LCTA 1340
	Да/Да
LCTA 1950
	Да/Да

Применение производных трииндолилметана формул (I) и (II) в качестве противоопухолевых средств, обладающих цитотоксической, апоптотической активностью и способностью ингибировать активность белка NFkB:

или их фармацевтически приемлемые соли или композиции, их содержащие,
где R₁; R₇; R₁₃ представляют собой независимо водород, алкил, замещенный алкил, арил, гетероарил,
где R₂; R₈; R₁₄ представляют собой независимо водород, алкил, замещенный алкил; положение и количество любых заместителей могут варьировать, любой из заместителей может в свою очередь быть замещенным;
R₃-R₆; R₉-R₁₂; R₁₅-R₁₈ представляют собой независимо водород, алкил, замещенный алкил, арил, галоген, -ОН, -OR, где R - алкил или замещенный алкил; положение и количество любых заместителей могут варьировать, любой из заместителей может в свою очередь быть замещенным;
представляет собой анион любой фармацевтически приемлемой органической или неорганической кислоты,
R₁₉ представляет собой водород или алкил.