Способ моделирования предупреждения формирования госпитальных штаммов


 


Владельцы патента RU 2458138:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (RU)

Предлагаемый способ относится к области микробиологии и эпидемиологии и касается способа моделирования предупреждения формирования госпитальных штаммов. Способ включает введение экспериментальным животным мышам линии СВА с ожоговой травмой на фоне грибковой и бактериальной инфекций, сопровождающейся резким угнетением антиинфекционной защиты, внутримышечно препараты «Галавит» 1 раз в сутки в дозе 200 мкг/мышь и «Лидокаин» внутримышечно 1 раз в сутки в дозе 8 мкг/кг массы тела три дня подряд с интервалом 24 часа между инъекциями. Представленное изобретение позволяет создать модель формирования госпитальных штаммов, с помощью которой возможно изучить изменение свойств условно-патогенных микроорганизмов в сторону повышения их вирулентности и резистентности к антибиотикам. 2 табл.

 

Предлагаемый способ относится к медицине, а именно к микробиологии, иммунологии и эпидемиологии, и может быть использован с целью моделирования предупреждения формирования госпитальных штаммов.

Проблема внутрибольничного инфицирования является одной из серьезных, так как оказывает значительное влияние на длительность госпитализации, общебольничную летальность и, в конечном счете, на стоимость лечения. Основной причиной развития госпитальных инфекций являются госпитальные штаммы условно-патогенных микроорганизмов, которые формируются в стационарных условиях.

До последнего времени мероприятия по борьбе с госпитальными инфекциями основывались на борьбе с уже возникшими у иммунокомрометированных больных и медицинского персонала, гнойно-воспалительными инфекциями. Вместе с тем, имеется возможность предупредить возникновение госпитальных инфекций на уровне формирования госпитальных штаммов возбудителей последних, используя современные достижения медицины, в частности, применяя способы предупреждения формирования госпитальных штаммов возбудителей.

Имеющиеся в литературе данные о способах микробиологического мониторинга госпитальных инфекций имеют существенные недостатки.

Наиболее близким прототипом является «Способ диагностики госпитальных микробных ассоциаций при микробиологическом мониторинге в рамках эпидемиологического надзора за гнойно-септическими инфекциями» (Патент на изобретение №2298037).

Одним из принципиально весомых недостатков предлагаемых в литературе способов является изучение свойств возбудителей на уровне штаммов микроорганизмов. Известно, что популяции всех живых существ неоднородны (гетерогенны) по различным биологическим признакам, что обеспечивает надежность живых систем при изменении условий существования. По мнению В.Д. Белякова (1987), важнейшей движущей силой эпидемиологического (инфекционного) процесса и одним из основных условий существования паразитарной системы является гетерогенность популяций микроорганизма и макроорганизма (паразита и хозяина).

Установлено (В.В.Бельский, П.В.Калуцкий, В.В.Киселева и др. Гетерогенность микробных популяций, М., 2008, 154 с.), что популяции свежевыделенных от больных штаммов микроорганизмов состоят из особей, отличающихся не только по наличию признаков антибиотикорезистентности, но и по уровню резистентности.

Кроме того, госпитальные штаммы микроорганизмов состоят из особей, отличающихся по клинически значимым признакам агрессии и вирулентности (антилизоцимная, гемолитическая, протеолитическая активность и др.) [Е.В.Шаталова, В.В.Бельский. Смешанные инфекции ожоговой травмы, Курск, 1998, 92 с.], что имеет важное патогенетическое значение для развития любой инфекции.

Без знания и учета механизмов формирования госпитальных штаммов весьма затруднительна этиологическая диагностика возбудителей госпитальных инфекций. Если не учитывать гетерогенность микробных популяций последних, оценка различных методов идентификации, предлагаемых авторами, является ошибочной.

Во-вторых, принципиально важным недостатком предлагаемых способов является то, что в ходе микробиологического мониторинга за гнойно-септическими инфекциями авторы диагностируют штаммы как госпитальные на основании только лишь изучения результатов сравнительной оценки без изучения последних на фоне применения иммуномодуляторов. А ведь известно, что селекция наиболее вирулентных, с множественной лекарственной устойчивостью особей из состава популяции штаммов любых возбудителей (т.е. формирование госпитальных штаммов и их ассоциаций) происходит только через организм иммунокомпрометированных больных. Следовательно, основным условием, влияющим на формирование госпитальных штаммов и их ассоциаций, является уровень иммунологической защиты организма. Отсюда - проводить исследования, доказывающие госпитальную природу штаммов и их ассоциаций, без применения иммуномодуляторов у иммунокопрометированных больных является не достоверно доказывающим фактором.

В связи с этим задачей изобретения было разработать способ моделирования предупреждения формирования госпитальных штаммов, позволяющий предупредить изменение свойств условно-патогенных микроорганизмов в сторону повышения их вирулентности и резистентности к антибиотикам, что является основой для формирования госпитальных штаммов в составе различных видов условно-патогенных возбудителей гнойно-септических процессов.

Задача изобретения достигается тем, что экспериментальным животным (мышам линии СВА) с ожоговой травмой на фоне грибковой и бактериальной инфекций, сопровождающейся резким угнетением антиинфекционной защиты, три дня подряд с интервалом 24 часа между инъекциями вводят внутримышечно галавит 1 раз в сутки в дозе 200мкг/мышь и лидокаин внутримышечно 1 раз в сутки в дозе 8 мкг/кг массы тела. Далее изучали структуру популяций возбудителей внутрибольничных инфекций по признакам лекарственной устойчивости и основным свойствам вирулентности.

Способ осуществляется следующим образом. Эксперименты выполнены на мышах линии СВА, прошедших карантинный режим вивария Курского государственного медицинского университета и не имевших внешних признаков каких-либо заболеваний. В контрольные и опытные группы Требования Международного Комитета, изложенные в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных целей (г. Страсбург, Франция, 1986) в работе, полностью соблюдены.

Известно, что формирование госпитальных штаммов происходит через организм иммунокомпрометированных больных. В связи с этим для создания иммунодефицита в организме животных нами была выбрана модель термического ожога, т.к. известно, что это состояние всегда сопровождается снижением уровня иммунного статуса организма. Термически ожог III-B степенью площадью 30% поверхности тела вызывали под эфирным рауш-наркозом с помощью прибора для нанесения дозированного ожога.

Заражение мышей производили путем внутрибрюшинного введения 0,2 мл 2-миллиардной взвеси суточной культуры микроорганизмов (грибы рода Candida и Pseudomonas aeruginosa), выделенные от больных с ожоговой травмой и гнойно-воспалительными процессами. Через двое суток после заражения животных выводили из опыта с помощью эфирного наркоза и в стерильных условиях извлекали селезенку. Производили посевы крови и взвеси селезенки на элективные среды (ЦПХ - агар для синегнойных бактерий и среда Сабуро - для грибов). Взвесью полученных культур заражали следующую партию животных, т.е. производили пассажи. Всего проведено по 6 пассажей. После каждого второго пассажа брали кровь на исследование и производили посев взвеси селезенки для получения изолированных колоний. С целью изучения структуры популяции по признакам лекарственной устойчивости полученные колонии (не менее 100) бархатным штампом переносили на чашки с мясо-пептонным агаром, содержащим 25 мкг/мл антибиотиков: карбенициллина, стрептомицина, полимиксина и канамицина (для синегнойных бактерий); амфотерицина В, леворина и нистатина (для грибов рода Candida). С целью изучения структуры популяции изучаемых штаммов по признакам патогенности те же 100 колоний засевали на 5% кровяной агар (гемолитическая активность) и на чашки Петри со свернутой лошадиной сывороткой (протеолитическая активность). Чашки с посевами выдерживали сутки в термостате при температуре 37°С и учитывали результаты определения лекарственной устойчивости по наличию роста на средах с антибиотиками и по наличию гемолиза на чашках с кровяным агаром и протеолиза - на чашках со свернутой сывороткой.

С целью изучения предупреждения формирования госпитальных штаммов структуру популяций микробов изучали на фоне применения галавита с лидокаином.

Галавит - отечественный иммуномодулятор, обладающий иммуномодулирующим, противовоспалительным и регенерирующим эффектами (Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммуномодуляторы: механизм действия и клиническое применение // Иммунология. - 2003. - №4. - С.196-202). Кроме того, немаловажное значение в первые дни болезни при ожоговых травмах имеет болевой шок, который в свою очередь также вызывает супрессию иммунного ответа. Учитывая патогенез развития ожоговой болезни, мы рекомендуем применять иммуномодулирующие препараты в комбинации с лидокаином, который не только купирует проявление болезненного синдрома при ожоговой травме, но и препятствует поступлению в сосудистое русло токсических и иммуносупрессирующих субстанций при развитии инфекции на фоне ожоговой травмы. Весомым положительным моментом лидокаина является еще и то, что лидокаин не является сложным эфиром, он медленно метаболизируется в организме и таким образом оказывает продолжительное действие.

В связи с тем, что при его метаболизме в организме не происходит образования парааминобензойной кислоты, он не оказывает антисульфаниламидного действия и может применяться у больных, получающих сульфаниламидные антибактериальные препараты (М.Д.Машковский. Лекарственные средства // Пособие для врачей. - 2001, Т.1. - С.294).

Показателями для изучения состояния уровня иммунной защиты были: фагоцитарная активность нейтрофилов периферической крови (% активных фагоцитов), фагоцитарное число (среднее количество фагоцитируемых микроорганизмов в расчете на один фагоцит), которые определяли по общепринятым методикам. Кроме того, изучали фагоцитарный резерв нейтрофилов (ФРН) и состояние бактерицидных систем нейтрофилов, что является, как известно, весомыми показателями при гнойно-воспалительных процессах любой этиологии. ФРН определяли по реакции восстановления нитросинего тетразолия (Ваксман М.Е., Маянский А.Н. Способ оценки функциональной активности нейтрофилов человека по реакции восстановления нитросинего тетразолия // Методические рекомендации. - Казань. - 1979. - 17 с.). Активность бактерицидных систем нейтрофилов - по наличию лизосомальных катионных белков в цитоплазме лейкоцитов (Шубич М.Г. Выявление катионных белков в цитоплазме лейкоцитов с помощью бромтимологого синего // Вопросы медицинской химии. - 1090. - №10, Т.16. - С.1321).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета прикладных программ «Microsoft Office XP» с применением критерия Стьюдента.

Пример конкретного выполнения

Экспериментальные животные были разделены на группы (по 25 животных в каждой):

I. Интактные.

II. Животные с ожоговой травмой, инфицированные синегнойной палочкой (Р. aeruginosa) - бактериальная инфекция.

III. Животные с ожоговой травмой. Инфицированные дрожжеподобными грибами (Candida albicans) - грибковая инфекция.

IV. Животные с ожоговой травмой, инфицированные бактериальной инфекцией и леченные галавитом в сочетании с лидокаином;

V. Животные с ожоговой травмой, инфицированные грибковой инфекцией и леченные галавитом в сочетании с лидокаином.

Заражение животных, пассажи культур, изучение структуры популяции изучаемых штаммов и уровня иммунной защиты организма - как описано выше, стр 4-6.

Галавит вводили внуртимышечно в дозе 200 мкг/мышь сразу после воспроизведения ожоговой травмы 1 раз в сутки в течение 3 дней.

Лидокаин - внутримышечно в дозе 8 мкг/кг массы тела сразу после воспроизведения ожоговой травмы 1 раз в сутки в течение 3 дней.

Ожог III - В степени площадью около 30% поверхности тела получали под легким эфирным наркозом на лишенной волосяного покрова участка кожи спины с помощью устройства, поддерживающего температуру обжигающей поверхности на уровне 100°С при экспозиции 8 секунд (В.В.Минухин, 1985).

Нами установлено: у животных с ожоговой травмой, осложненной как бактериальной, так и грибковой инфекцией, резко снижаются все показатели фагоцитоза по сравнению с контрольными (интактными) животными, и наблюдается высокая микробная обсемененность селезенки. В тех же условиях, но после применения галавита с лидокаином показатели фагоцитоза значительно повышаются и даже превышают показатели контрольных животных; селезеночный индекс (число микроорганизмов на орган) у леченых животных значительно снижался уже при исследовании после 4 пассажа, а после 6 пассажа как бактерии, так и грибы из селезенки не высевались (табл.1).

Таблица 1
Влияние иммуномодуляторов на показатели антиинфекционной защиты организма
Изучаемые показатели Группы животных
Интактные Ожог+инфицирование Лечение галавитом с лидокаином
Показатели в разные сроки исследования (пассажи) М±m (n=25)
2 4 6 2 4 6 2 4 6
Активность фагоцитоза 60,8±0,15 60,2±0,17 60,5±0,12 32,7±2,5 30,1±2,7 35,8±2,9X 58,5±1,7 62,3±1,3 68,2±0,8XX
Фагоцитарное число 2,0±0,04 2,1±0,05 2,2±0,07 0,8±0,03 0,6±0,05 0,9±0,02X 1,5±0,07 2,1±0,04 3,2±0,02XX
ФРН (%) 28,0±2,2 30,0±2,7 29,0±2,3 7,0±0,9 5,0±1,2 8,0±1,3X 12,0±1,4 17,0±2,3 30,0±2,8XX
Обсемененность селезенки (микр.тел/орган) // // // 2,4×105 Сплошной рост 6×107 3×102 Отдельные колонииXX Отсутствие роста
Примечание: Х = р<0,05 - достоверность различий с данными контрольной группы (интактные);
XX = р<0,05 - достоверность различий с данными контрольной группы (ожог+инфицирование);
// - исследования не проводились.

Результаты изучения структуры популяции микроорганизмов в динамике инфекционного процесса in vivo показали, что параллельно с повышением иммунного статуса организма животных происходили существенные изменения в составе популяций возбудителей гнойно-септических процессов. Если в составе популяций, полученных от инфицированных животных с ожоговой травмой, наблюдалось непрерывное увеличение особей с признаками резистентности к антибиотикам и признаками вирулентности (в отношении признаков вирулентности уже к 6 пассажу популяции как синегнойных бактерий, так и грибов рода Candida стали статистически достоверно (р<0,01) однородными, т.е. наблюдается формирование штаммов с признаками «госпитальных» через иммунокомпрометированный организм, то после применения галавита с лидокаином (повышение иммунного статуса), наоборот, число особей с этими признаками статистически достоверно (р<0,01) снижалось, т.е. применение иммуномодуляторов способствует достоверной элиминации из состава популяции вирулентных и резистентных к антибиотикам особей, что приводит к сапрофитизации возбудителей в организме, которая наблюдается уже с 4 пассажа исследования (табл.2).

Таблица 2
Влияние иммуномодуляторов на состав популяций возбудителей
Изучаемые признаки % особей в популяциях (из 100 колоний) Р
от нелеченых животных (ожог+инфицирование) от леченных животных (галавит+лидокаин)
Показатели в разные сроки исследования (пассажи)
2 4 6 2 4 6
Устойчивость к: Популяция Pseudomonas aeruginosa
карбенициллину 72,0 95,0 100,0 70,0 58,0 47,0 <0,01
стрептомицину 75,0 98,0 100,0 65,0 50,0 30,0 <0,01
полимиксину 50,0 65,0 95,0 50,0 42,0 34,0 <0,01
канамицину 85,0 98,0 100,0 78,0 55,0 40,0 <0,01
Гемолиз 85,0 100,0 100,0 80,0 50,0 38,0 <0,01
Протеолиз 72,0 100,0 100,0 65,0 45,0 25,0 <0,01
Устойчивость к: Популяция Candida albicans
Амфотерицину В 58,0 70,0 95,0 49,0 45,0 30,0 <0,01
Леворину 65,0 78,0 100,0 62,0 50,0 34,0 <0,01
Нистатину 72,0 90,0 100,0 68,0 55,0 42,0 <0,01
Гемолиз 55,0 62,0 85,0 39,0 30,0 25,0 <0,01
Примечание: достоверность различий с данными контрольной группы (нелеченые животные с ожогом и инфекцией).

Таким образом, полученные результаты достоверно показывают, что на фоне выраженного иммунодефицита в динамике инфекционного процесса создаются условия, когда из исходных гетерогенных популяций возбудителей внутрибольничных инфекций формируются штаммы с признаками госпитальных. Применение препаратов, восстанавливающих антиинфекционную резистентность экспериментальных животных, способствует элиминации из состава популяций микроорганизмов вирулентных и резистентных к антибиотикам особей, что приводит к сапрофитизации возбудителей в организме и 100% выживаемости животных. Есть достоверные основания считать, что и в клинических условиях повышение иммунного статуса иммунокомрометированных больных с помощью иммуномодуляторов будет препятствовать формированию госпитальных штаммов возбудителей, увеличит эффективность лечения больных и сократит сроки пребывания их в стационаре.

Способ моделирования предупреждения формирования госпитальных штаммов, отличающийся тем, что экспериментальным животным мышам линии СВА с ожоговой травмой на фоне грибковой и бактериальной инфекций, сопровождающейся резким угнетением антиинфекционной защиты, три дня подряд с интервалом 24 ч между инъекциями вводят внутримышечно «Галавит» 1 раз в сутки в дозе 200 мкг/мышь и «Лидокаин» внутримышечно 1 раз в сутки в дозе 8 мкг/кг массы тела.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, а именно к бактериальному сенсору для детекции изменения pH. .
Изобретение относится к области микробиологии, биотехнологии и может быть использовано для оценки способности бактерий к биохимической детоксикации микотоксинов с целью последующего включения наиболее перспективных видов и штаммов в пробиотические препараты направленного действия - на биотрансформацию микотоксинов.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано в клинической практике для прогнозирования развития бактериального осложнения стафилококковой этиологии после гриппа.
Изобретение относится к области медицины, а именно клинической микробиологии. .

Изобретение относится к области биологии, может быть использовано для экологического мониторинга и оценки водоемов. .
Изобретение относится к ветеринарной медицине, касается скрининга (поиска) пробиотических препаратов против кислотоустойчивых микроорганизмов и может быть использовано для скрининга (поиска) пробиотических препаратов против нокардиоформных актиномицетов in vivo.

Изобретение относится к биохимии. .
Изобретение относится к медицинской микробиологии, дерматовенерологии и лабораторной диагностике и представляет собой контрольный штамм Neisseria gonorrhoeae, предназначенный для внутрилабораторного контроля качества исследований при проведении лабораторной диагностики гонококковой инфекции культуральным методом.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению штамма - продуцента н-бутанола, используемого в качестве органического растворителя, биотоплива и основы для синтеза многих промышленно ценных органических соединений.

Изобретение относится к микробиологии и генетике и касается получения штамма, обладающего повышенной чувствительностью к антибиотикам различных классов, несущего индуцированную N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидином (НГ) мутацию в последовательности гена opcP1, ответственного за экспрессию перового белка с молекулярной массой 36 kDa.

Изобретение относится к полимерной композиции и может быть использовано при производстве пластмассовых изделий для хранения пищевых продуктов. .

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для профилактики заболеваний, вызываемых Pasteurella trehalosi и Mannheimia haemolytica. .
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам выделения чистой культуры микроорганизмов из патологического материала. .

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности при производстве альфа-амилазы, применяемой в различных областях промышленности и сельского хозяйства для осахаривания (гидролиза) крахмалосодержащего сырья, а именно в хлебопечении, спиртовой, пивоваренной, кондитерской и крахмалопаточной промышленности (выработка паток, сиропов, глюкозы), в текстильной, бумажной промышленности, при производстве моющих средств.
Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано для культивирования дифтерийных микробов в искусственных питательных средах при бактериологической диагностике дифтерии.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению штамма-продуцента н-бутанола, используемого в качестве органического растворителя, биотоплива и основы для синтеза многих промышленноценных органических соединений.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и касается аттенуированных бактерий В.pertussis, содержащих нокаутную мутацию в гене dnt и продуцирующих нетоксическую, иммунологически активную, токсоидную форму коклюшного токсина, их применению в качестве живой и инактивированной вакцин и вектора для поливалентной вакцины.

Изобретение относится к биотехнологии и сельскохозяйственному производству, в частности к грибоводству. .
Наверх