Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с противоопухолевой активностью


 


Владельцы патента RU 2458985:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт клинической иммунологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИКИ" СО РАМН) (RU)

Изобретение раскрывает способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с активностью против клеток колоректального рака. Из периферической крови пациентов больных колоректальным раком выделяют прилипающую фракцию мононуклеарных клеток (МНК) и культивируют их в среде определенного состава для получения незрелых дендритных клеток (ДК). В процессе культивирования к последним добавляют опухолевый антиген (лизат аутологичных опухолевых клеток), а затем рчФНО-α для созревания незрелых ДК. Полученные зрелые антиген-активированные ДК культивируют с неприлипшей фракцией МНК в присутствии провоспалительных цитокинов рчИЛ-12 и рчИЛ-18. Использование способа генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с противоопухолевой активностью обеспечивает высокую цитотоксичность противоопухолевых клеток и, как следствие, эффективность иммунного ответа по Т-хелпер 1 типу на антигены колоректального рака. 1 табл.

 

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, а именно к способам генерации антиген-специфических клеток с цитостатической активностью против клеток колоректального рака.

В основе развития онкологического процесса лежит снижение эффективности иммунной защиты, в частности снижение функциональной активности клеток, участвующих в противоопухолевой защите (цитотоксических Т-лимфоцитов, натуральных киллерных и дендритных клеток и др.). Традиционное лечение колоректального рака основано на хирургическом методе лечения и радио-химиотерапии, направленное на элиминацию опухолевых клеток. Используемые методы лечения колоректального рака не устраняют причину развития опухоли и не влияют на патогенетические механизмы прогрессирования опухолевого роста. При этом известно, что опухолевые клетки обладают иммуносупрессивной активностью, что ведет к нарушению дифференцировки иммунокомпетентных клеток и их функционального состояния, а в итоге к несостоятельности противоопухолевого иммунного ответа (Yang L., Carbone D.P. Tumor-host immune interactions and dendritic cell dysfunction // Adv. Cancer Res.- 2004. - Vol.92.- P. 13-27). Развитие новых эффективных подходов лечения онкологических заболеваний опирается на использование собственных механизмов защиты организма и их возможной модуляции. В настоящее время активно исследуется возможность применения новых методов иммунокоррекции у онкологических больных, в частности, использования дендритных клеток для создания или модуляции специфического противоопухолевого иммунного ответа. Дендритные клетки (ДК) - гетерогенная по происхождению, морфологии и выполняемым функциям популяция иммунокомпетентных клеток, которые принимают участие практически во всех видах иммунных реакций. ДК являются основными антигенпрезентирующими клетками, что обусловливает их непосредственное и важнейшее участие в формировании эффективного специфического иммунного ответа, кроме того, ДК обладают способностью продуцировать провоспалительные цитокины (ФНО-альфа, ИФН-гамма, ИЛ-1, ИЛ-12 и др.), что приводит к активации функций других иммунокомпетентных клеток, участвующих в противоопухолевой защите.

По мере дифференцировки (созревания) изменяется функциональное состояние дендритных клеток. Так на стадии незрелых дендритных клеток они эффективно захватывают антигены, в основном, посредством эндоцитоза и микропиноцитоза, но при этом их способность стимулировать Т-клетки ограничена. На стадии терминальной дифференцировки (зрелости) дендритные клетки способны презентировать антиген Т-лимфоцитам и активировать их, продуцируя соответствующие гуморальные факторы. То есть ДК, обладая уникальными механизмами захвата/представления антигена наивным Т-клеткам и активируя их, определяют направленность и эффективность иммунных реакций в организме.

Эффективность использования ДК объясняется, во-первых, тем, что на сегодня достаточно хорошо изучены молекулярные механизмы участия ДК в формировании иммунного ответа и, во-вторых, протоколы получения ДК и модуляции с их помощью иммунного ответа, выглядят наиболее изученными и «прозрачными» с точки зрения контроля всех этапов этого метода клеточной терапии.

Описан способ (прототип), при котором незрелые ДК получали из моноцитов прилипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК) периферической крови больных колоректальным раком путем культивирования в полной среде с добавлением рекомбинантного человеческого гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (рчГМ-КСФ) и интерлейкина-4 (рчИЛ-4) в течение 6 дней. Затем получали антиген-активированные дендритные клетки путем слияния (fusion) незрелых дендритных клеток и аллогенных опухолевых клеток с применением полиэтиленгликоля и в течение последующих 3 дней культивировали в присутствии рчГМ-КСФ и рчИЛ-4. Далее в течение 7 дней антиген-активированные дендритные клетки сокультивировали с Т-клетками в присутствии рекомбинантного человеческого ИЛ-2 (рчИЛ-2). Была показана стимуляция цитотоксической способности Т-клеток (цитотоксический тест) и увеличение количества ИФН-γ-продуцирующих клеток (Koido S., Hara E., Homma S., Torii A., Mitsunaga M., Yanagisawa S., Toyama Y., Kawahara H., Watanabe M., Yoshida S., Kobayashi S., Yanaga K., Fujise K., Tajiri H. Streptococcal preparation OK-432 promotes fusion efficiency and enhances induction of antigen-specific CTL by fusion of dendritic cells and colorectal cancer cells // J.Immunol. - 2007. - Vol.178. - P.613-622).

Недостатком данного подхода является длительный срок культивирования дендритных клеток (9 дней), для которого требуется использование большого количества рекомбинантных цитокинов (рчГМ-КСФ, рчИЛ-4 и рчИЛ-2), что ведет к значительному удорожанию технологии. Использованные аллогенные опухолевые клетки несут чужеродные антигены, на которые возможно и формируется ответ, при этом остается не известным, будут ли таким образом активированные клетки проявлять цитотоксическую активность против собственных опухолевых антигенов и клеток, соответственно. Кроме того, эффективность цитотоксичности клеток, достигнутая в прототипе, не превышают 40%.

Направленность развития протективного ответа зависит от многих факторов, в том числе от баланса про- и противовоспалительных цитокинов. Известно, что провоспалительный цитокин ИЛ-12 обладает широкой биологической активностью, стимулирует цитотоксические и НК-клетки, активирует дифференциацию CD4+ Т-лимфоцитов по 1 типу, индуцирует продукции NO макрофагами, тем самым потенцирует противоопухолевый иммунитет. Прововоспалительный цитокин ИЛ-18 является фактором, индуцирующим продукцию ИФН-γ Т- и НК-клетками, усиливая противоопухолевый цитотоксический ответ. Показано, что при совместном применении ИЛ-12 и ИЛ-18 наблюдается наиболее выраженная стимуляция продукции ИНФ-γ и перфорин-зависимой цитотоксичности НК-клеток, пролиферация Т-лимфоцитов, что позволяет максимально возможно стимулировать эффекторное звено иммунитета против опухоли (Baxevanis C.N., Gritzapis A.D., Papamichail M. In vivo antitumor activity of NKT cells activated by the combination of IL-12 and IL-18 // J. Immunol - 2003. - Vol.l71 (6). - P.2953-9).

Задачей настоящего изобретения является создание эффективного и экономичного способа генерации антиген-специфических цитотоксических клеток из клеток периферической крови больных колоректальным раком.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в следующем.

Мононуклеарные клетки неприлипающей фракции периферической крови больных колоректальным раком культивируют с антиген-активированными дендритными клетками, полученными из моноцитов прилипающей фракции МНК. Антигенную активацию ДК проводят с помощью аутологичных опухолевых клеток, а для созревания ДК используют рекомбинантный человеческий провоспалительный цитокин - фактор некроза опухоли (рчФНО-α). Таким образом, для эффективной модуляции противоопухолевой защиты необходимо повысить потенциал цитотоксической активности мононуклеарных антиген-специфических клеток использованием рекомбинантного человеческого интерлейкина (рчИЛ-12 и рчИЛ-18) при совместном культивировании зрелых антиген-активированных ДК и МНК.

Совместное культивирование неприлипающей фракции МНК и зрелых ДК проводят в присутствии рчИЛ-12 и рчИЛ-18.

Принципиальным отличием разработанного способа от прототипа является использование рчИЛ-12 и рчИЛ-18 при сокультивировании ДК и МНК, что повышает эффективность необходимых для стимуляции и поддержания направленной дифференцировки нативных Т-клеток в Т-хелперы 1 типа, а также применение протоколов активации и созревания ДК, включающих использование аутологичных опухолевых антигенов и рчФНО-α, что активирует ДК против собственных опухолевых антигенов, в результате цитотоксический ответ усиливается до 59,5% против 40% у прототипа. Стадия получения зрелых антиген-активированных ДК сокращается до 3-х суток.

Предлагаемое изобретение повышает эффективность генерации цитотоксических клеток, а также позволяет сократить сроки сокультивирования ДК и МНК, что в итоге приводит к снижению стоимости способа.

Техническим результатом изобретения является генерация in vitro антиген-специфических клонов Т-клеток с активностью Т-хелперов 1 типа, необходимых для формирования эффективного противоопухолевого ответа.

Изобретение осуществляется следующим образом.

Выделенные из периферической крови больных колоректальным раком прилипающая фракция мононуклеарных клеток культивируются в концентрации 1 млн/мл в полной среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES, 5×10-5 мМ 2-меркаптоэтанола, 80 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл ампициллина в атмосфере 5% CO2 при 37°C с добавлением рчГМ-КСФ (50 нг/мл) и рчИЛ-4 (100 нг/мл). Через 48 часов культивирования к полученным незрелым ДК добавляется опухолевый антиген (лизат аутологичных опухолевых клеток) в дозе 100 мкг/мл, а еще через 24 часа для созревания незрелых дендритных клеток в течение последующих 24 часов вносится рчФНО-α в дозе 25 нг/мл.

Полученные дендритные клетки культивируются с неприлипшей фракцией мононуклеарных клеток в соотношении 1:10 с добавлением рчИЛ-12 в дозе 10 нг/мл и рчИЛ-18 в дозе 100 нг/мл.

Для определения модуляции цитотоксической активности Т-лимфоцитов с помощью полученных ДК оценивали гибель опухолевых клеток в цитотоксическом тесте. Для этого к мононуклеарным клеткам больного, которые предварительно сокультивировали с антиген-активированными ДК, добавляли аутологичные опухолевые клетки. Цитотоксичность оценивали по увеличению содержания внутриклеточного фермента лактатдегидрогеназы в кондиционной среде в результате гибели опухолевых клеток. Показано достоверное повышение значения цитотоксичности, что служит показателем активации противоопухолевых цитотоксических клеток, необходимых для уничтожения опухолевых клеток (табл.1).

Таблица 1. Цитотоксический ответ мононуклеарных клеток больных колоректальным раком, культивированных с антиген-активированными ДК и интерлейкином-12 и интерлейкином-18 in vitro (n=10).

Группы Цитотоксичности (%)
МНК 6,4±2,1
МНК + рчИЛ-12 + рчИЛ-18 25,9±5,6*#
МНК + ДК (без антигена) 28,1±5,3*#
МНК + ДК (с антигеном) 39,6±5,6*#
МНК + ДК (с антигеном) + рчИЛ-12 + рчИЛ-18 59,9±7,8*
Примечание: МНК - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток
МНК + рчИЛ-12 + рчИЛ-18 - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток, культивированные в присутствии рчИЛ-12 и рчИЛ-18
МНК + ДК (без антигена) - МНК, культивированные с ДК, которым не представлялся опухолевый антиген
МНК + ДК (с антигеном) - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся опухолевый антиген
МНК + ДК (с антигеном) + рчИЛ-12 + рчИЛ-18 - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся опухолевый антиген с добавлением рчИЛ-12 и рчИЛ-18.
* - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК.
# - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК + ДК (с антигеном) + рчИЛ-12 + рчИЛ-18

Совместное культивирование ДК и МНК больных колоректальным раком в сочетании с рчИЛ-12 и рчИЛ-18 является эффективным способом генерации специфических цитотоксических клеток мононуклеарного происхождения, что проявляется в усилении их цитотоксического противоопухолевого ответа. Использование рекомбинантного человеческого ИЛ-12 и ИЛ-18 для усиления индукции ответа Т хелперов 1 типа статистически достоверно увеличивает цитотоксический потенциал мононуклеарных клеток in vitro. Таким образом, в результате проведенных исследований разработан способ генерации противоопухолевых цитотоксических клеток с помощью антиген-активированных аутологичных дендритных клеток и рчИЛ-12 и рчИЛ-18 in vitro.

Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с противоопухолевой активностью, заключающийся в совместном культивировании неприлипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК), выделенных из периферической крови больных колоректальным раком с дендритными клетками (ДК), активированными опухолевым антигеном, полученными из моноцитов прилипающей фракции МНК, отличающийся тем, что для совместного культивирования берут зрелые ДК, полученные добавлением к антиген-активированным с помощью аутологичных опухолевых клеток незрелым ДК провоспалительного цитокина ФНО-α, а совместное культивирование неприлипающей фракции МНК и зрелых антиген-активированных ДК проводят в присутствии рекомбинантного человеческого интерлейкина-12 и рекомбинантного человеческого интерлейкина-18.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к исследованиям противоопухолевого действия препаратов in vitro, и может быть использовано в экспериментальной онкологии.

Изобретение относится к области биотехнологии. .
Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии и касается получения нового штамма гибридных клеток Mus. .

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к средствам для регенерации кожи и слизистых оболочек, и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к коллагеновой пленке и способу ее изготовления. .

Соединение, предназначенное для стимуляции пути передачи сигнала через il-15rбета/гамма, с целью индуцировать и/или стимулировать активацию и/или пролиферацию il-15rбета/гамма-положительных клеток, таких как nk-и/или t-клетки, нуклеиновая кислота, кодирующая соединение, вектор экспрессии, клетка-хозяин, адъювант для иммунотерапевтической композиции, фармацевтическая композиция и лекарственное средство для лечения состояния или заболевания, при котором желательно повышение активности il-15, способ in vitro индукции и/или стимуляции пролиферации и/или активации il-15rбета/гамма-положительных клеток и способ получения in vitro активированных nk-и/или t-клеток // 2454463
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению стимуляторов пути передачи сигнала через IL-15Rбета/гамма, и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения иммортализованной клетки человека, стабильно трансфицированной последовательностью нуклеиновой кислоты, стабильно трансфицированной иммортализованной клетке человека, полученной данным способом, способу рекомбинантной продукции целевого белка человека и применению вектора трансфекции.

Изобретение относится к соединению формулы (I): или к его фармацевтически приемлемой соли, где -A-(R1)a означает группу; -B-(R2)b означает группу, указанную в п.1 формулы, R3 означает водород; Х означает СН2 или О; и Y означает CH2.

Изобретение относится к новым соединениям формулы (VI): или его фармацевтически приемлемым солям; где n равно 0, 1, 2 или 3; R1 означает-ОН, Н; R2a означает ОН, -СН3, при условии, что по меньшей мере один из R1 и R2a является -OH; R3 означает Cl, Br, циклопропил, разветвленный C3-5алкил; R4a означает Н; R8 означает Н; где фрагмент: может быть одной из групп В8, В35, В36, В37, В38, В39, В40, В41, В42, В43, В45, В46, В48, В54, В56, В58, В59, В61, В62, В71, В72, В74, В75, В76, В77, В78, В79, В80, В81, В82, В84, В86, В87, В88, В89, В90, В91, В93, В94, В95, В96, В97, В98, В99, В100 и В101, где значения раскрыты в пункте 1 формулы.

Изобретение относится к гомо- и гетеро-полиаминокислотным производным фуллерена формулы C60(H)x{NH(CH 2)nCOO-}x{NH3 +(L)COOH}x, где n=2-5, х=3, L=-(CH 2)m, где m=1-5, либо -СО(CH2) kCH(NH2)-, где k=1-2, которые обладают активностью против вируса герпеса, вируса гепатита С, вирусов гриппа различной природы, ВИЧ, а также противоопухолевой и противопсориатической активностью.

Изобретение относится к медицине, онкологии, и может быть использовано при хирургическом лечении рака языка. .

Изобретение относится к новым соединениям формулы (I) или их фармацевтически приемлемым солям, возможно в виде (1S)-изомеров, обладающих свойствами ингибитора семейства поло-подобных киназ(серино-треониновых киназ) PLK1.

Изобретение относится к новым гидратированным N-фуллерен-аминокислотам общей формулыC60(Н)3{NH(СН 2)nCOOH}3·xH2O, где С60 представляет фуллерен, n=5-7, x=8-10, которые обладают активностью против вируса герпеса, вирусов гриппа различной природы, ВИЧ, а также противоопухолевой и противопсориатической активностью.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии и радиологии, и может быть использовано для лечения лимфом Ходжкина IIA стадии. .

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и касается способа лечения при раке мочевого пузыря. .

Изобретение относится к области фармакологии, медицины и биотехнологии, конкретно к препаратам, способным связывать человеческий фактор некроза опухоли (TNF ). .
Наверх