Способ приготовления лекарственного препарата, содержащего переносчик кислорода, стабильного при высоких температурах, и его применение

Группа изобретений относится к медицине, в частности, к способу получения лекарственного препарата, содержащего высокоочищенный и стабильный гемоглобин в качестве переносчика кислорода, препарату и способу оксигенации тканей. Способ включает разрушение промытых красных кровяных телец с помощью гипотонического лизиса, фильтрацию, экстракцию, ультрафильтрацию, колоночную хроматографию, повторную ультрафильтрацию для получения концентрированного раствора гемоглобина, не содержащего фосфолипидов и димеров, блокирование сульфгидрильных групп, создание поперечной сшивки с помощью бис-3,5-дибромсалицилфумарата, добавление N-ацетилцистеина, добавление к фармацевтически приемлемому носителю для получения лекарственного препарата. Способ оксигенации тканей включает использование полученного препарата и может использоваться при лечении рака. Группа изобретений позволяет получить высокоочищенный поперечно сшитый тетрамерный гемоглобин (опционально содержащий ≥70% сшивок типа β-β) с высокой эффективностью переноса кислорода, стабильный при высоких температурах и пригодный для использования у млекопитающих без риска поражения почек и сужения сосудов. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 13 пр., 9 табл., 18 ил.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

[0001] Данная заявка заявляет приоритет заявки на предварительный патент США №61/348,764, поданной 27 мая 2010 г., и заявки на патент США №13/013,847, поданной 26 января 2011 г., раскрытие сущности которых включено посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0002] Настоящее изобретение относится к способу приготовления лекарственного препарата, содержащего переносчик кислорода, стабильного при высоких температурах, и препаратам, полученным с помощью этого процесса. Настоящее изобретение также относится к использованию лекарственного препарата, содержащего переносчик кислорода, стабильного при высоких температурах, для лечения рака и расстройств, связанных с кислородным голоданием, и сохранения органов для людей и животных.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0003] Гемоглобин играет важную роль у большинства позвоночных в осуществлении газообмена между сосудистой системой и тканями. Он отвечает за перенос кислорода из дыхательной системы в клетки тела с помощью кровообращения, а также за перенос конечного продукта обмена веществ, диоксида углерода, из клеток тела в дыхательную систему, через которую диоксид углерода выводится из организма. Поскольку гемоглобин обладает этой функцией по переносу кислорода, его можно использовать в качестве эффективного поставщика кислорода, если его удастся стабилизировать ex vivo и использовать in vivo.

[0004] Природный гемоглобин является тетрамером, который обычно стабилен внутри красных кровяных телец. Однако, когда природный гемоглобин выделяют из красных кровяных телец, он становится нестабильным в плазме и распадается на два α-β-димера. Каждый из этих димеров имеет молекулярную массу около 32 кДа. Эти димеры могут вызывать значительные повреждения почек при их фильтрации через почки и выведении. Разрушение тетрамерной структуры также оказывает отрицательное влияние на устойчивость функционального гемоглобина в кровотоке.

[0005] Для предотвращения разрушения тетрамера недавние разработки в области обработки гемоглобина включают различные методики поперечного сшивания для создания внутримолекулярных связей в тетрамере, а также для создания межмолекулярных связей между тетрамерами для получения полимерного гемоглобина. Известный уровень техники постулирует, что полимерный гемоглобин является предпочтительной формой для увеличения времени полужизни гемоглобина в кровотоке. Однако, по данным авторов этого изобретения, полимерный гемоглобин в кровотоке более легко превращается в метгемоглобин. Метгемоглобин не может связывать кислород и поэтому не может обогащать ткани кислородом. Таким образом, поперечное сшивание, в соответствии с известным уровнем техники, приводящее к образованию полимерного гемоглобина, является проблемой. В технике существует потребность в методике, которая позволяет осуществлять внутримолекулярное поперечное сшивание для получения стабильных тетрамеров без одновременного образования полимерного гемоглобина.

[0006] Дополнительные проблемы, связанные с попытками стабилизации гемоглобина на известном уровне техники, включают в себя получение тетрамерного гемоглобина, содержащего неприемлемо высокий процент димеров; присутствие димеров делает гемоглобиновый препарат непригодным для введения млекопитающим. Димерная форма гемоглобина может вызывать тяжелые поражения почек в организме млекопитающих; эти поражения почек могут быть настолько тяжелыми, что могут привести к смерти. По этой причине в технике существует потребность в получении стабильного тетрамерного гемоглобина с низким содержанием его нежелательной димерной формы в конечном продукте.

[0007] Дополнительные проблемы, связанные с попытками получения стабильного гемоглобина на известном уровне техники, включают в себя присутствие белковых примесей, в частности, иммуноглобулина G, который может вызывать аллергические реакции у млекопитающих. По этой причине в технике существует потребность в процессе для получения стабильного тетрамерного гемоглобина, не содержащего белковых примесей.

[0008] Еще одной проблемой, связанной с применением препаратов гемоглобина, приготовленных на известном уровне техники, является сужение кровеносных сосудов после их переливания млекопитающим. Было отмечено, что это сужение кровеносных сосудов обусловлено связыванием эндотелиального релаксирующего фактора с реакционноспособными сульфгидрильными группами молекулы гемоглобина. По этой причине в технике существует потребность в получении стабилизированного тетрамерного гемоглобина, не вызывающего сужения кровеносных сосудов после его переливания.

[0009] В дополнение к перечисленным выше проблемам, в технике существует потребность в получении стабилизированного тетрамерного гемоглобина, не содержащего фосфолипидов, который можно было бы производить в промышленных масштабах.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[00010] Настоящее изобретение предлагает способ получения стабильного при высоких температурах, очищенного, поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина, пригодного для использования у млекопитающих без риска возникновения тяжелых поражений почек, отрицательного воздействия на сосуды и других тяжелых побочных эффектов (включая смерть). Настоящее изобретение также включает в себя стабильный при высоких температурах, очищенный, поперечно сшитый тетрамерный гемоглобин и применения этого гемоглобина для оксигенации in vivo и ex vivo тканей.

[00011] Способ включает в себя использование в качестве исходного материала цельной крови млекопитающих, включающей в себя, по меньшей мере, красные кровяные тельца и плазму. Красные кровяные тельца отделяются от плазмы в цельной крови млекопитающих, после чего фильтруются для получения фракции отфильтрованных красных кровяных телец. Фракция отфильтрованных красных кровяных телец промывается для удаления примесей плазменного белка. Промытые красные кровяные тельца разрушаются с помощью контролируемого гипотонического лизиса в течение времени, достаточного для лизиса красных кровяных телец, но недостаточного для лизиса белых кровяных телец, в аппарате для мгновенного цитолиза с пропускной способностью 50-1000 л/ч. Производится фильтрация для удаления, по меньшей мере, части отходов фильтрации из лизата. Первый раствор гемоглобина экстрагируется из лизата.

[00012] Процесс первой ультрафильтрации осуществляется с использованием ультрафильтрационного фильтра, сконфигурированного для удаления примесей с молекулярной массой, превышающей молекулярную массу тетрамерного гемоглобина, и последующего удаления любых вирусов и любые отходы фильтрации из первого раствора гемоглобина для получения второго раствора гемоглобина. Второй раствор гемоглобина подвергается проточной колоночной хроматографии для удаления из него белковых примесей, димерного гемоглобина и фосфолипидов для получения раствора гемоглобина, не содержащего фосфолипидов и с низким содержанием димеров. Процесс второй ультрафильтрации полученного раствора гемоглобина, не содержащего фосфолипидов и с низким содержанием димеров, осуществляется с использованием фильтра, сконфигурированного для удаления примесей с целью получения концентрированного раствора очищенного гемоглобина, не содержащего фосфолипидов и с низким содержанием димеров.

[00013] Сульфгидрильные группы молекул гемоглобина блокируются в концентрированном, очищенном растворе гемоглобина, не содержащем фосфолипидов и с низким содержанием димеров, с помощью сульфгидрильного реагента в полностью оксигенированной среде. Получаемые таким образом молекулы гемоглобина содержат, по меньшей мере, по одному цистеиновому остатку, включающему тиол-защитную группу таким образом, что молекулы гемоглобина не способны связывать эндотелиальный релаксирующий фактор в цистеиновом центре.

[00014] По меньшей мере α-α и/или β-β субъединицы в тиол-защищенном гемоглобине поперечно сшиты с помощью бис-3,5-дибромсалицилфумарата с образованием стабильного при высоких температурах, поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина без образования полимерного гемоглобина, таким образом, что молекулярная масса получаемого поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина равна 60-70 кДа. Подходящий физиологический буфер заменяется на поперечно сшитый тетрамерный гемоглобин. Любые остатки поперечно несшитого тетрамерного гемоглобина и любые другие остаточные химикаты удаляются с помощью тангенциальной поточной ультрафильтрации. К поперечно сшитому тетрамерному гемоглобину добавляется N-ацетилцистеин в концентрации 0,2-0,4% для поддержания содержания метгемоглобина на уровне менее 5%. Затем стабильный при высоких температурах тетрамерный гемоглобин, не содержащий фосфолипиды, с низким содержанием димеров, тиол-защищенный, поперечно сшитый, добавляется к фармацевтически приемлемому носителю; в качестве фармацевтически приемлемого носителя можно использовать физиологический буфер или воду.

[00015] После этой процедуры полученный гемоглобин опционально упаковывается в герметичные полиэтиленовые, этилвинилацетатные или этилен-винилоспиртовые (РЕ, EVA, EVOH) инфузионные пакеты. Упаковка предотвращает загрязнение кислородом, которое приводит к образованию неактивного метгемоглобина.

[00016] Стабильный при высоких температурах, поперечно сшитый гемоглобин, полученный вышеописанным способом, используется для лечения различных форм рака, в частности, лейкемии, колоректального рака, рака легких, рака молочных желез, рака носоглотки и рака пищевода. Механизм разрушения раковых клеток заключается в усиленной оксигенации опухолевых клеток, приводящей к повышению их чувствительности к радиации и химиотерапевтическим средствам. Стабильный при высоких температурах, поперечно сшитый тетрамерный гемоглобин также используется для сохранения тканей органов при трансплантации и для сохранения сердца в ситуациях, когда оно не получает необходимого снабжения кислородом in vivo, например при кислородном голодании тканей сердца.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

[00017] На фиг.1 показан сравнительный анализ аминокислотных последовательностей различных гемоглобинов.

[00018] На фиг.2 показана технологическая схема процесса по настоящему изобретению.

[00019] На фиг.3 дано схематическое изображение аппарата для мгновенного цитолиза, используемого в процессе по настоящему изобретению.

[00020] На фиг.4 показан график реакции гемоглобина с сульфгидрильным реагентом в оксигенированных и деоксигенированных средах.

[00021] На фиг.5 показаны результаты анализа на поперечно сшитый тетрамерный гемоглобин с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

[00022] На фиг.6 показаны результаты анализа на поперечно сшитый тетрамерный гемоглобин с помощью масс-спектрометрии с ионизацией методом электрораспыления (ESI-MS).

[00023] На фиг.7 показаны результаты спектроскопического анализа кругового дихроизма (КД) для (а) раствора очищенного гемоглобина и (b) поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина.

[00024] На фиг.8 показано хемосенситизирующее действие поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина in vitro.

[00025] На фиг.9 показано улучшение оксигенации в нормальной ткани при использовании поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина по настоящему изобретению.

[00026] На фиг.10 показано улучшение оксигенации в крайне гипоксической области опухоли при использовании поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина по настоящему изобретению.

[00027] На фиг.11 показаны изменения среднего артериального давления у крыс с тяжелым геморрагическим шоком после лечения стабилизированным поперечно сшитым тетрамерным гемоглобином по настоящему изобретению.

[00028] На фиг.12 показан профиль элюции для хроматографии на проточной колонке; раствор гемоглобина содержится в проточной фракции.

[00029] На фиг.13 схематически изображена система проточной хроматографии на колонке с карбометилцеллюлозой с ультрафильтрацией для производства в промышленных масштабах.

[00030] На фиг.14 показано сравнение сульфгидрильной реакции в оксигенированной среде и реакцией в деоксигенированной среде.

[00031] На фиг.15 показан график, демонстрирующий тепловую стабильность поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина по настоящему изобретению в сравнении с гемоглобином, получаемым в соответствии с известным уровнем техники.

[00032] На фиг.16 показано схематическое изображение инфузионного мешка для поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина по настоящему изобретению.

[00033] На фиг.17 показано схематическое изображение аппарата, используемого для тестирования образования метгемоглобина in vitro.

[00034] На фиг.18 показана скорость образования метгемоглобина для полимерного гемоглобина и гемоглобина по настоящему изобретению в аппарате, показанном на фиг.17.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[00035] Гемоглобин - это железосодержащий белок, осуществляющий перенос кислорода в красных кровяных тельцах крови млекопитающих и других животных. Гемоглобин демонстрирует характеристики как третичной, так и четвертичной структур белка. Большинство аминокислот в гемоглобине образует альфа-спирали, соединенные короткими неспиральными участками. Водородные связи стабилизируют спиральные участки в гемоглобине, создавая притяжение между различными участками молекулы, тем самым способствуя сворачиванию каждой полипептидной цепи в определенную форму. Молекула гемоглобина образована четырьмя глобулярными белковыми субъединицами. Каждая из этих субъединиц состоит из полипептидной цепи, образующей набор α-спиральных структурных участков, соединенных в структуру "миоглобинового фолдинга", внутри которой также содержится гемовая группа.

[00036] Гемовая группа состоит из атома железа, удерживаемого в гетероциклическом кольце, известном под названием порфирина. Атом железа одинаково связывается со всеми четырьмя атомами азота в центре порфиринового кольца, лежащими в одной плоскости. После этого кислород способен связываться с железосодержащим центром перпендикулярно плоскости порфиринового кольца. Таким образом, одна молекула гемоглобина способна связывать четыре молекулы кислорода.

[00037] У взрослых людей наиболее распространенной формой гемоглобина является тетрамерная форма, называемая гемоглобином А и состоящая из двух α-субъединиц и двух β-субъединиц, нековалентно связанных друг с другом, так что структура гемоглобина А обозначается α₂β₂. α-субъединицы и β-субъединицы состоят из 141 и 146 аминокислотных остатков соответственно. Размеры и структура α- и β-субъединиц очень сходны друг с другом. Каждая из этих субъединиц имеет молекулярную массу около 16 кДа; таким образом, молекулярная масса тетрамера составляет около 65 кДа. Четыре полипептидные цепи в тетрамере связаны друг с другом солевыми мостиками, водородными связями и гидрофобным взаимодействием. Структура бычьего гемоглобина сходна со структурой человеческого гемоглобина (90,14% идентичности в α-цепи; 84,35% идентичности в β-цепи). Различие между ними заключается в том, что две сульфгидрильные группы в бычьем гемоглобине находятся в положениях β Cys 93, тогда как в человеческом гемоглобине сульфгидрильные группы находятся в положениях α Cys 104, β Cys 93 и β Cys 112 соответственно. На фиг.1 показан сравнительный анализ аминокислотных последовательностей бычьего, человеческого, собачьего, свиного и лошадиного гемоглобинов, которые обозначены буквами В, Н, С, Р и Е соответственно. Аминокислотные остатки, различающиеся у различных видов, выделены серым цветом. Из фиг.1 видно, что человеческий гемоглобин обладает высоким процентом сходства с бычьим, собачьим, свиным и лошадиным гемоглобинами при сравнении их аминокислотных последовательностей.

[00038] В природном гемоглобине, содержащемся в красных кровяных тельцах, связь α-цепи с соответствующей ей β-цепью очень прочна и не разрушается при физиологических условиях. Однако связь одного αβ-димера с другим αβ-димером вне красных кровяных телец относительно слаба. Эта связь имеет тенденцию к расщеплению на два αβ-димера с массой около 32 кДа каждый. Эти нежелательные димеры достаточно малы, чтобы фильтроваться через почки и выделяться из организма, что потенциально может привести к поражению почек и существенному снижению времени внутрисосудистого удержания.

[00039] По этой причине для обеспечения эффективности и безопасности необходимо стабилизировать любой гемоглобин, который используется вне красных кровяных телец. Процесс получения стабилизированного гемоглобина описан ниже; краткое описание процесса по настоящему изобретению представлено на технологической схеме на фиг.2.

[00040] Первоначально, в качестве источника гемоглобина из красных кровяных телец, используется цельная кровь. Выбирается цельная кровь млекопитающих, включая, помимо прочего, человеческую, бычью, свиную, лошадиную и собачью цельную кровь. Красные кровяные тельца отделяются от плазмы, фильтруются и промываются для удаления примесей плазменного белка.

[00041] Для высвобождения гемоглобина из красных кровяных телец их клеточные мембраны лизируются. Хотя для лизиса красных кровяных телец можно использовать различные методики, в настоящем изобретении используется лизис в гипотонических условиях, способом, который можно строго контролировать, и в объемах, пригодных для организации производства в промышленных масштабах. Для этого для лизиса красных телец используется аппарат для мгновенного цитолиза, показанный на фиг.3. Гипотонический лизис создает лизатный раствор, содержащий гемоглобин и отходы фильтрации. Для обеспечения возможности организации производства в промышленных масштабах процесс лизиса тщательно контролируется так, чтобы обеспечивать лизис только красных кровяных телец при отсутствии лизиса белых кровяных телец или других клеток. В одном варианте осуществления размер аппарата для мгновенного цитолиза подбирается таким образом, чтобы красные кровяные тельца проходили через него приблизительно за 30 секунд, и аппарат для мгновенного цитолиза включает в себя статический смеситель. В качестве гипотонического раствора используется деионизованная и дистиллированная вода. Конечно, очевидно, что использование иных гипотонических растворов с другими концентрациями солей изменит время лизиса красных кровяных телец. Поскольку процедура контролируемого лизиса разрушает только красные кровяные тельца, но не белые кровяные тельца или клеточный материал, она позволяет минимизировать высвобождение токсичных белков, фосфолипидов и ДНК из белых кровяных телец и другого клеточного материала. Непосредственно через 30 секунд в лизат добавляется гипертонический раствор, т.е. после прохождения раствора, содержащего красные кровяные тельца, через блок статического смесителя в аппарате для мгновенного цитолиза. Получаемый гемоглобин характеризуется более высокой чистотой и содержит меньшие количества загрязнений, таких как нежелательные ДНК и фосфолипиды, чем гемоглобин, полученный с использованием других методик лизиса. Нежелательные нуклеиновые кислоты из белых кровяных телец и примеси фосфолипидов не обнаруживаются в получаемом растворе гемоглобина методом полимеразной цепной реакции (предел обнаружения = 64 пг) и методом ВЭЖХ (предел обнаружения = 1 мкг/мл) соответственно.

[00042] Выполняются две процедуры ультрафильтрации; первая удаляет примеси с молекулярными массами, превышающими молекулярную массу гемоглобина, и проводится перед осуществлением проточной колоночной хроматографии, а вторая удаляет примеси с молекулярными массами ниже, чем молекулярная масса гемоглобина, и проводится после осуществления проточной колоночной хроматографии. Последняя процедура ультрафильтрации также концентрирует получаемый гемоглобин. В некоторых вариантах осуществления для первой ультрафильтрации используется фильтр на 100 кДа, а для второй ультрафильтрации используется фильтра на 30 кДа.

[00043] Проточная колоночная хроматография используется для удаления белковых примесей в растворе очищенного гемоглобина, в частности, иммуноглобулин G, альбумин и карбоангидразу. В некоторых вариантах осуществления процедура колоночной хроматографии осуществляется с использованием одной или нескольких коммерчески доступных ионообменных колонок, например колонок с диэтилметилом, колонок с карбоксиметилцеллюлозой, гидроксиапатитных колонок и пр. Значение рН при колоночной хроматографии обычно составляет от 6 до 8,5. В одном варианте осуществления этап проточной хроматографии на колонке с карбоксиметилцеллюлозой используется для удаления белковых примесей при рН 8,0. Иммуноферментный анализ (ELISA) применяется для обнаружения белковых примесей и фосфолипидов, остающихся в образце после элюции с хроматографической колонки. Эта уникальная методика разделения с помощью проточной колоночной хроматографии позволяет использовать схему непрерывного разделения, что позволяет осуществлять производство в промышленных масштабах. Результаты ELISA показывают, что содержание этих примесей существенно низко в растворе элюируемого поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина (иммуноглобулин G: 44,3 нг/мл; альбумин: 20,37 нг/мл; карбоангидраза: 81,2 мкг/мл). Результаты удаления белковых примесей с использованием колонок различных типов при различных значениях рН приведены ниже в Таблице 1.

[00044]

Таблица 1
Удаление различных белковых примесей с использованием различных ионообменных колонок
Колонка (значение рН)	Процент удаления (%)
Диэтилметил (при рН 7,5)	Карбоангидраза	Альбумин	Иммуноглобулин G
Диэтилметил (при рН 7,8)	-	68	29,8
Карбоксиметилцеллюлоза	-	60	50,9
(при рН 6,2)	-	32	21,8
Карбоксиметилцеллюлоза
(при рН 8,0)	5,6	53,2	66,4
Гидроксиапатитная
(при рН 7,5)	4,5	23,5	22,8

[00045] Для предотвращения связывания эндотелиального релаксирующего фактора с цистеиновым центром молекулы гемоглобина, приводящего к нежелательному сужению кровеносных сосудов, гемоглобин подвергается реакции с сульфгидрильным реагентом в оксигенированных условиях. Это находится в прямом противоречии с постулатами известного уровня техники, в соответствии с которыми подчеркивалась необходимость проведения реакции между гемоглобином и сульфгидрильным реагентом в деоксигенированных условиях. Настоящее изобретение демонстрирует, что сульфгидрильный реагент реагирует быстрее и полностью с реакционноспособными сульфгидрильными группами гемоглобина в оксигенированных условиях. При реакции сульфгидрильного реагента с сульфгидрильными группами гемоглобина выделяется йодид. Таким образом, степень полноты реакции алкилирования можно отслеживать, измеряя высвобождение йодида. В эксперименте по определению зависимости хода реакции от времени реакция алкилирования проходит быстрее и более эффективно в оксигенированных условиях по сравнению с деоксигенированными условиями, как это видно из фиг.4 и фиг.14. Время, необходимое для прохождения реакции до конца, в оксигенированных условиях снижается до менее 5 ч по сравнению с деоксигенированными условиями. Меньшее время реакции очень важно для осуществления процесса в промышленных масштабах. Оно также уменьшает реакции с нежелательными примесями, которые могут оказывать отрицательное влияние на конечный продукт.

[00046] После завершения процесса сульфгидрильной реакции гемоглобин подвергается поперечному сшиванию типа α-α и/или β-β с использованием бис-3,5-дибромсалицилфумарата (DBSF). Для предотвращения образования полимерного гемоглобина ход этой реакции тщательно контролируется в деоксигенированной среде при молярном соотношении гемоглобина и DBSF от 1:2,5 до 1:4,0, в результате чего образующийся гемоглобин с поперечной сшивкой типа α-α и/или β-β является тетрамерным гемоглобином с молекулярной массой 60-70 кДа, что указывает на отсутствие полимерного гемоглобина. Выход реакции с DBSF является высоким, >99%, и концентрация димеров в конечном продукте является низкой; в контексте данного изобретения под низким содержанием димеров понимается их содержание менее 5% или, что более предпочтительно, менее 2%. В одном варианте осуществления поперечное сшивание проводится таким образом, что доля гемоглобина с поперечной сшивкой типа β-β превышает 50% от общего количества поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина. В другом варианте осуществления поперечное сшивание проводится таким образом, что доля гемоглобина с поперечной сшивкой типа β-β составляет 60% и более от общего количества поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина. Более того, можно таким образом подобрать условия, что доля гемоглобина с поперечной сшивкой типа β-β будет превышать 70% от общего количества тетрамерного гемоглобина. По некоторым данным, гемоглобин с поперечной сшивкой типа β-β может иметь более низкую аффинность к кислороду, чем тетрамерный гемоглобин с поперечной сшивкой типа α-α. Таким образом, могут существовать ситуации, в которых более высокий процент содержания гемоглобина с поперечной сшивкой типа β-β может быть предпочтительнее высокого содержания гемоглобина с поперечной сшивкой типа α-α для увеличения эффективности переноса кислорода. Кроме того, получение гемоглобина с поперечной сшивкой типа β-β может приводить к образованию меньшего количества димеров α-β, что будет способствовать уменьшению почечной токсичности.

[00047] К тетрамерному гемоглобину с поперечной сшивкой типа α-α и/или β-β добавляется N-ацетилцистеин в концентрации 0,2-0,4% для поддержания содержания метгемоглобина на уровне ниже 5%.

[00048] В зависимости от конечного назначения гемоглобина, очищенный, поперечно сшитый тетрамерный гемоглобин по настоящему изобретению опционально упаковывается в герметичную упаковку в деоксигенированной среде. Упаковка, используемая в настоящем изобретении, обеспечивает стабильность тетрамерного гемоглобина с поперечной сшивкой типа α-α и/или β-β в течение более 2 лет. Напротив, в оксигенированных условиях гемоглобин по настоящему изобретению быстро, всего за несколько дней, превращается в неактивный метгемоглобин. В соответствии с известным уровнем техники, растворы гемоглобина упаковывались в пакеты для крови из ПВХ или стерикона, которые обладают высокой проницаемостью для кислорода, что уменьшает срок годности продукта.

[00049] Во многих вариантах осуществления настоящего изобретения лекарственный препарат, содержащий переносчик кислорода в форме поперечно сшитого гемоглобина, вводится с помощью внутривенной инъекции. По этой причине конструкция его упаковки и выбранный для нее материал определены с учетом его предполагаемого применения для внутривенных инъекций. Для уменьшения проницаемости для газов и предотвращения образования неактивного метгемоглобина используется многослойная упаковка из материала на основе EVA/EVOH. 100-мл инфузионный мешок, предназначенный для использования с очищенным и поперечно сшитым гемоглобином по настоящему изобретению, изготавливается из пятислойного ламинированного материала на основе EVA/EVOH толщиной 0,4 мм, проницаемость для кислорода у которого при комнатной температуре равна 0,006-0,132 см³ на 100 квадратных дюймов за 24 ч на одну атмосферу. Данный материал относится к пластикам Класса VI (в соответствии с определением Фармакопеи США 1988 года), который соответствует тестам на биологическую активность in vivo и физико-химическому тесту, а также пригоден для изготовления инфузионных мешков для внутривенных инъекций. Эта первичная упаковка особенно полезна для защиты раствора тетрамерного гемоглобина с поперечной сшивкой типа α-α и/или β-β от долгосрочного воздействия кислорода, нарушающего его стабильность и со временем приводящего к ухудшению его лечебных свойств.

[00050] В качестве вторичной защиты продуктов крови используется обертка из алюминиевой фольги, защищающая от возможных протечек воздуха и поддерживающая продукт в деоксигенированном состоянии. При этом, однако, существует опасность возникновения проколов в алюминиевой обертке, нарушающих ее герметичность и делающих продукт нестабильным. По этой причине в настоящем изобретении в качестве вторичной упаковки используется внешняя оболочка из алюминированного пластика, предотвращающая оксигенацию содержимого и защищающая его от воздействия света. Структура внешней оболочки включает в себя 0,012-мм слой полиэтилентерефталата (PET), 0,007-мм слой алюминия (AL), 0,015-мм слой нейлона (NY) и 0,1-мм слой полиэтилена (РЕ). Пленка оболочки имеет толщину 0,14 мм; ее проницаемость для кислорода при комнатной температуре равняется 0,006 см³ на 100 квадратных дюймов за 24 ч на одну атмосферу. Такая вторичная упаковка увеличивает время стабильности гемоглобина, тем самым увеличивая срок годности продукта.

[00051] Для анализа и характеризации тетрамерного гемоглобина с поперечной сшивкой типа α-α и/или β-β используются высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), масс-спектрометрия с ионизацией методом электрораспыления (ESI-MS) и спектроскопия кругового дихроизма (КД). Для продукта, полученного из бычьей крови, на фиг.5 показан состав продукта в форме распределения молекулярных масс, определенного с помощью ВЭЖХ. Аналитический метод на основе ВЭЖХ используется для определения содержания тетрамеров и димеров соответственно. Подвижная фаза для ВЭЖХ содержит хлорид магния (0,75 М), что позволяет разделять димер, поперечно несшитый тетрамер и стабилизированный тетрамер с поперечной сшивкой типа α-α и/или β-β. Раствор хлорида магния способствует диссоциации гемоглобина на димеры приблизительно в 30 раз сильнее, чем раствор хлорида натрия с той же ионной силой.

[00052] ESI-MS позволяет анализировать очень крупные молекулы. Данная методика ионизации позволяет анализировать соединения с большой молекулярной массой за счет ионизации белков и последующего разделения этих ионизированных белков на основании соотношения их массы к их заряду. Таким образом, данная методика позволяет точно определять молекулярную массу белков и взаимодействие этих белков с другими молекулами. На фиг.6 показаны результаты анализа с помощью ESI-MS, которые свидетельствуют, что молекулярная масса стабилизированного тетрамера равна 65 кДа. Спектры КД в дальнем ультрафиолете в диапазоне длин волн от 190 до 240 нм отражают вторичные структуры глобиновой части гемоглобина. На фиг.7 близкое соответствие спектров очищенного и поперечно сшитого гемоглобина свидетельствует о сохранении правильного фолдинга цепей гемоглобина даже после поперечного сшивания с помощью DBSF. Результаты исследования КД говорят о том, что поперечно сшитый гемоглобин содержит около 42% альфа-спиралей, 38% бета-слоев, 2,5% бета-изгибов и 16% случайных клубков. Это дополнительно подтверждает, что поперечное сшивание с помощью DBSF для образования поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина не влияет на вторичную структуру гемоглобина.

[00053] Очищенный поперечно сшитый тетрамерный гемоглобин, полученный с помощью процесса по настоящему изобретению, имеет молекулярную массу 60-70 кДа и содержит, по меньшей мере, один цистеиновый остаток, который включает тиол-защитную группу, что делает такой гемоглобин неспособным связываться с эндотелиальным релаксирующим фактором через цистеиновый центр. Кроме того, поперечно сшитый тетрамерный гемоглобин не обладает пирогенными свойствами и не содержит эндотоксинов (<0,05 ЭЕ/мл) и стромы (<1%).

[00054] Процесс по настоящему изобретению применим для крупномасштабного промышленного производства поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина. Кроме того, поперечно сшитый тетрамерный гемоглобин в сочетании с фармацевтическим носителем (например, водой, физиологическим буфером, в капсулах) пригоден для использования у млекопитающих.

[00055] Поперечно сшитый тетрамерный гемоглобин по настоящему изобретению используется для оксигенации тканей, для лечения рака, для лечения нарушений, связанных с кислородным голоданием, в частности геморрагического шока, и для сохранения сердца в условиях с низким содержанием кислорода (например, трансплантатов сердца). Дозировка поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина подбирается в диапазоне концентраций приблизительно 0,3-1,3 г/кг.

[00056] Для использования для лечения рака лекарственный препарат, содержащий переносчик кислорода, по настоящему изобретению используется в качестве агента для оксигенации тканей, позволяющего улучшить оксигенацию опухолевой ткани и тем самым повысить ее чувствительность к химическим агентам (например, химиотерапевтическим средствам) и чувствительность к радиации.

[00057] Фиг.8 демонстрирует повышение химической чувствительности клеток раковых опухолей после использования препарата, содержащего поперечно сшитый тетрамерный гемоглобин, in vitro. Пять различных линий раковых клеток (A) Jurkat (лейкемия), (В) HKESC1 (рак пищевода), (С) COLO205 (рак толстой кишки), (D) A549/Cisp (рак легких) и (Е) MCF-7/ADM (рак молочных желез) подвергались лечению различными химиотерапевтическими средствами либо самостоятельно, либо в комбинации с поперечно сшитым тетрамерным гемоглобином по настоящему изобретению. Подавление роста опухолевых клеток определялось с помощью анализа чувствительности опухолевых клеток к химиотерапевтическим средствам с использованием АТФ (АТР-ТСА) (для клеточных линий Jurkat, COLO205, A549/Cisp и MCF-7/ADM) или с помощью анализа пролиферации клеток с использованием МТТ (для клеточной линии HKESC1). Результаты показывают, что при добавлении изобретенного поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина химическая чувствительность многократно повышалась у всех линий раковых клеток, в том числе у двух клеточных линий, A549/Cisp и MCF-7/ADM, обладающих высокой устойчивостью к химиотерапии. Результаты, приведенные на фиг.8, показывают, что в результате повышения химической чувствительности при добавлении поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина эффективность лечения против клеток лейкемии, рака пищевода, рака легких, рака толстой кишки и рака молочных желез очень сильно возрастает.

[00058] Кроме того, в данном изобретении продемонстрирована способность изобретенного поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина улучшать оксигенацию в нормальных тканях (фиг.9) и в крайне гипоксических опухолевых тканях (фиг.10) (человеческая карцинома носоглотки (CNE2)). Репрезентативный график изменения содержания кислорода в ткани человеческого ксенотрансплантата CNE2 приведен на фиг.10. Парциальное давление кислорода в опухолевой массе отслеживалось напрямую с помощью волоконнооптического кислородного сенсора (производства компании «Oxford Optronix Limited»), подсоединенного к системе микропозиционирования (производства компании «DTI Limited»). После внутривенного введения поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина в дозировке 1,2 г/кг медианное значение pO₂ через 3 ч повысилось с 0,2 мм рт.ст. до 3,9 мм рт.ст., а через 6 ч - до 10,6 мм рт.ст. Даже в наиболее гипоксичных участках лекарственный препарат, содержащий переносчик кислорода, по настоящему изобретению значительно повысил кислородный потенциал. Никакие другие аналогичные коммерчески доступные продукты или существующие технологии не обладают столь высокой эффективностью по сравнению с лекарственным препаратом, содержащим переносчик кислорода, приготовленным по настоящему изобретению.

[00059] При использовании для лечения нарушений, связанных с кислородным голоданием, и для сохранения сердца лекарственный препарат, содержащий переносчик кислорода, по настоящему изобретению служит в качестве заменителя крови, обеспечивая доставку кислорода в орган-мишень. В некоторых вариантах осуществления препарат используется в качестве кардиоплегического раствора для сохранения сердца.

[00060] Среднее артериальное давление меняется в крысах с тяжелым гемморрагическим шоком (см. Пример 12b) после лечения поперечно сшитым тетрамерным гемоглобином по настоящему изобретению в дозировке 0,5 г/кг, как это показано на фиг.11. У крыс с тяжелым гемморрагическим шоком среднее артериальное давление возвращалось на безопасный и стабильный уровень и поддерживалось на уровне ниже исходного значения после лечения стабилизированным поперечно сшитым тетрамерным гемоглобином. После лечения гемоглобином по настоящему изобретению время реакции на возвращение среднего артериального давления к норме было даже меньше, чем после введения цельной крысиной крови, которое использовалось в качестве положительного контроля. Вышеописанные результаты свидетельствуют, что вазоактивное событие после переливания изобретенного гемоглобина оказывает положительное воздействие на поддержание стабильного и гемодинамического состояния. Ранее использовавшиеся переносчики кислорода на основе гемоглобина часто приводили к сужению сосудов. Например, по сообщению Katz et al., 2010, продукт Hemopure® («Biopure Co.», США) повышал среднее артериальное давление (до 124±9 мм рт.ст.) по сравнению с его исходным значением (96±10 мм рт.ст.).

[00061] Использование изобретенного гемоглобина для инфузий повышало процент выживания в модели шока у мышей (с 18% до 75%) и у собак породы бигль (с 46% до 97%). Процент выживания в животной модели тяжелого гемморрагического шока значительно повышался при инфузионном введении различных количеств поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина (см. Пример 12). Таким образом, изобретенный гемоглобин может использоваться для лечения геморрагического шока.

ПРИМЕРЫ

[00062] В приведенных ниже примерах описаны отдельные конкретные варианты осуществления данного изобретения. Они ни в коем случае не ограничивают объем этого изобретения.

[00063] Пример 1

[00064] Процесс в целом

[00065] Схематическое изображение технологической схемы процесса по настоящему изобретению показано на фиг.2. Цельная бычья кровь собирается в закрытую стерильную емкость/мешок, содержащий 3,8% (по соотношению веса к объему) раствор тринатрия цитрата, используемого в качестве антикоагулянта. Сразу после этого кровь тщательно перемешивается с раствором тринатрия цитрата для предотвращения ее сворачивания. Красные кровяные тельца отделяются от плазмы и других меньших клеток крови с помощью механизма афереза. Для этого используется «устройство для промывки клеток» с одноразовым гамма-стерилизованным барабаном центрифуги. Красные кровяные тельца промываются равным объемом солевого раствора, содержащего 0,9% (по соотношения веса к объему) хлорида натрия.

[00066] Промытые красные кровяные тельца лизируются для высвобождения содержащегося в них гемоглобина с помощью контролируемого гипотонического шока, разрывающего их клеточную мембрану. Для этого используется специальный аппарат для мгновенного цитолиза красных кровяных телец, показанный на фиг.3. После лизиса красных кровяных телец молекулы гемоглобина отделяются от других белков с помощью тангенциальной поточной ультрафильтрации с использованием мембранного фильтра на 100 кДа. Гемоглобин в фильтрате собирается для проточной колоночной хроматографии и затем дополнительно концентрируется до концентрации в 12-14 г/дл с помощью мембранного фильтра на 30 кДа. Колоночная хроматография осуществляется для удаления белковых примесей.

[00067] Концентрированный раствор гемоглобина первоначально модифицируется с использованием сульфгидрильного реагента (с помощью реакции алкилирования) в условиях естественной оксигенации, а затем его компоненты реагируют с DBSF с образованием стабильных молекул тетрамерного гемоглобина с поперечной сшивкой типа α-α и/или β-β.

[00068] Пример 2

[00069] Время и контролируемый гипотонический лизис и фильтрация

[00070] Свежесобранная цельная бычья кровь транспортируется в прохладных условиях. Красные кровяные тельца отделяются от плазмы с помощью устройства для промывки клеток, а затем с помощью фильтрации через 0,65-мкм фильтр. После промывки фильтрата красных кровяных телец 0,9% солевым раствором фильтрат разрушается с помощью гипотонического лизиса. Гипотонический лизис осуществляется с помощью аппарата для мгновенного цитолиза, изображенного на фиг.3. Конструкция аппарата для мгновенного цитолиза включает в себя статический смеситель, помогающий осуществлению лизиса клеток. Суспензия красных кровяных телец с контролируемым содержанием гемоглобина (12-14 г/дл) смешивается с 4 объемами очищенной воды для создания гипотонического шока на клеточных мембранах красных кровяных телец. Длительность гипотонического шока контролируется для предотвращения нежелательного лизиса белых кровяных телец и тромбоцитов. Гипотонический раствор проходит через блок статического смесителя в аппарате для мгновенного цитолиза приблизительно за 30 секунд. Через 30 секунд шок останавливается путем смешивания лизата в тот момент, когда он выходит из статического смесителя, с 1/10 объема гипертонического буфера. В качестве гипертонического раствора используется 0,1 М фосфатного буфера с 7,4% NaCl и рН 7,4. Аппарат для мгновенного цитолиза, показанный на фиг.3, способен обрабатывать от 50 до 1000 л лизата в час и, предпочтительно, по меньшей мере, 300 л в час в режиме непрерывной работы.

[00071] После лизиса красных кровяных телец их лизат фильтруется через 0,22-мкм фильтр для получения раствора гемоглобина. Нуклеиновые кислоты из белых кровяных телец и примеси фосфолипидов не обнаруживаются в получаемом растворе гемоглобина методом полимеразной цепной реакции (предел обнаружения = 64 пг) и методом ВЭЖХ (предел обнаружения = 1 мкг/мл) соответственно. Первая ультрафильтрация через фильтр на 100 кДа выполняется для удаления примесей с молекулярными массами выше, чем у гемоглобина. После этого для дальнейшей очистки раствора гемоглобина используется проточная колоночная хроматография. Затем выполняется вторая ультрафильтрация с фильтром на 30 кДа для удаления примесей с молекулярными массами ниже, чем у гемоглобина, и для концентрации.

[00072] Пример 3

[00073] Изучение удаления вирусов на растворе гемоглобина, не содержащем стромы

[00074] Для демонстрации безопасности продукта по настоящему изобретению была продемонстрирована способность к удалению вирусов для (1) этапа диафильтрации через 0,65-мкм фильтр, и для (2) этапа ультрафильтрации через 100-кДа фильтр с помощью валидационного исследования с использованием вирусов. Оно осуществлялось путем намеренного добавления в уменьшенные версии этих двух процессов различных модельных вирусов (вируса энцефаломиокардита, вируса псевдобешенства, вируса бычьей вирусной диареи и бычьего парвовируса). В этом исследовании использовались 4 типа вирусов (см. ниже в Таблице 2). Эти вирусы отличаются друг от друга по своим биофизическим и структурным особенностям и обладают различной устойчивостью к различным физическим и химическим агентам и способам лечения.

[00075]

[00076] Схема валидационного исследования с использованием вирусов кратко изложена ниже в Таблице 3.

[00077]

Таблица 3
Диафильтрация	Ультрафильтрация
Промывка клеток ↓	Добавление вируса ↓
Добавление вируса ↓	Ультрафильтрация ↓
Диафильтрация ↓	Вирусные тесты
Вирусные тесты

[00078] Краткое изложение результатов уменьшения титра для 4 вирусов при (1) диафильтрации через 0,65-мкм фильтр и при (2) ультрафильтрации через 100-кДа фильтр приведено ниже в Таблице 4. Все четыре типа вирусов, BVDV, BPV, EMCV и PRV, эффективно удалялись и при диафильтрации через 0,65-мкм фильтр, и при ультрафильтрации через 100-кДа фильтр.

[00079]

Таблица 4
Вирусы	BVDV	BPV	EMCV	PRV
Прогон	1	2	1	2	1	2	1	2
Диафильтрация через 0,65-мкм фильтр	2,69	3,20	3,73	3,53	3,25	≥3,90	2,67	2,63
Ультрафильтрация через 100-кДа фильтр	≥4,68	≥4,38	5,87	5,92	3,60	3,43	≥6,05	3,27
Кумулятивный максимум	≥7,88	9,65	≥7,50	≥8,72
Кумулятивный минимум	≥7,07	9,40	6,68	5,90
Пояснение:
≥ Остаточной инфекционной способности обнаружено не было.

[00080] Пример 4

[00081] Проточная колоночная хроматография

[00082] Колонка с карбоксиметилцеллюлозой (серийно выпускаемая компанией «GE healthcare») используется для дальнейшего удаления любых белковых примесей. В качестве начального буфера используется 20 ммоль натриево-ацетатного буфера (рН 8,0), а в качестве буфера элюции - 20 ммоль натриево-ацетатного буфера с 2 моль NaCl (рН 8,0). После уравновешивания колонки с карбоксиметилцеллюлозой начальным буфером на колонку наносится образец белка. Несвязанные белковые примеси вымываются, по меньшей мере, 5 объемами колонки начального буфера. Элюция осуществляется 8 объемами колонки 25% буфера элюции (0-0,5 моль NaCl). Профиль элюции показан на фиг.12; раствор гемоглобина содержится во фракции проскока.

[00083] Чистота проточной фракции анализируется с помощью ELISA. Полученные результаты представлены ниже в Таблице 5.

[00084]

Таблица 5
	Белковые примеси
Иммуноглобулин G	Карбоангидраза	Альбумин
До колонки с карбоксиметилцеллюлозой	1320 нг/мл	860,3 мкг/мл	435,2 нг/мл
Проточная фракция (содержащая гемоглобин)	44,3 нг/мл	81,2 мкг/мл	20,4 нг/мл

[00085] Так как раствор гемоглобина содержится в протоке хроматографической колонки с карбоксиметилцеллюлозой при рН 8 (а не в элюате), этот способ очистки является удобным для непрерывного производства в промышленных масштабах. Первая система ультрафильтрации подключена напрямую к системе проточной хроматографии на колонке с карбоксиметилцеллюлозой, а гибкая трубка для проточной фракции может подключаться ко второй системе ультрафильтрации для организации производства в промышленных масштабах. Схема промышленного производственного процесса показана на фиг.13.

[00086] Пример 5

[00087] Сульфгидрильная реакция и поперечная сшивка

[00088] (5а) Сульфгидрильная реакция

[00089] В настоящем изобретении реакция между гемоглобином и сульфгидрильным реагентом проводится в оксигенированной среде, в отличие от постулатов известного уровня техники, в соответствии с которыми реакция обычно проводилась в инертной атмосфере, например в атмосфере азота. Для алкилирования свободных сульфгидрильных групп гемоглобина к нему добавляется алкилирующий сульфгидрильный реагент. В этом воплощении молярное соотношение гемоглобина к сульфгидрильному реагенту составляет от 1:2 до 1:4. Эта реакция способна предотвращать связывание эндотелиального релаксирующего фактора, реагирующего с сульфгидрильными группами молекул гемоглобина. Было показано, что эндотелиальный релаксирующий фактор связывается с реакционноспособными сульфгидрильными группами на молекулах гемоглобина, что может приводить к повышению кровяного давления, наблюдающемуся после введения ранних поколений переносчиков кислорода на основе гемоглобина. Окончание сульфгидрильной реакции можно отслеживать, измеряя высвобождение продукта или остаточного сульфгидрильного реагента (с помощью УФ-спектрометрии на длине волны 265 нм). На фиг.14 показано сравнение между реакцией в оскигенированной среде и реакцией в деоксигенированной среде. Из фиг.14 следует, что остаточное содержание сульфгидрильного реагента выходит на постоянный уровень после проведения реакции в течение 3 ч в оксигенированной среде в эксперименте по изучению зависимости хода этой реакции от времени. Напротив, в деоксигенированной среде остается большое количество непрореагировавшего сульфгидрильного реагента. Выход сульфгидрильной реакции в оксигенированной среде является высоким (92,7%) при ее проведении в течение 4 ч.

[00090] (5b) Реакция поперечной сшивки для получения стабильных тетрамеров

[00091] Реакция поперечной сшивки типа α-α и/или β-β проводится в деоксигенированной среде. К раствору гемоглобина добавляется бис-3,5-дибромсалицилфумарат (DBSF) для получения поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина, который включает поперечную сшивку типа α-α и/или β-β в структуре тетрамера. Опционально в структуре тетрамера также может возникать некоторое количество поперечных сшивок типа α-β.

[00092] В этом варианте осуществления молярное соотношение гемоглобина и DBSF составляет от 1:2,5 до 1:4,0. Процедура стабилизации с помощью DBSF позволяет получить стабильную форму тетрамерного гемоглобина (с молекулярной массой 65 кДа) и предотвратить его диссоциацию на димеры (с молекулярной массой 32 кДа), которые выводятся через почки. В этом процессе поперечной сшивки образуется только тетрамерный гемоглобин; полимерный гемоглобин в нем не образуется. Данный процесс осуществляется в инертной азотной атмосфере для предотвращения окисления железа в гемоглобине до трехвалентного состояния, приводящего к образованию физиологически неактивного метгемоглобина. Полнота прохождения реакции с DBSF отслеживается путем измерения остаточного содержания DBSF с помощью ВЭЖХ. Выход реакции гемоглобина с DBSF является высоким, >99%.

[00093] В одном варианте осуществления реакция поперечной сшивки осуществляется в деоксигенированной среде (содержание растворенного кислорода <0,1 мг/л) при комнатной температуре (15-25°С). В раствор гемоглобина добавляется DBSF для получения поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина; определение характеристик поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина осуществляется так, как это описано ниже. Следует отметить, что это определение характеристик основано только на одном конкретном варианте осуществления. Доли и типы поперечных сшивок в тетрамерном гемоглобине можно контролировать, варьируя количество используемого DBSF, время реакции и ее температуру, а также другие параметры процесса.

[00094] При изменении молярного соотношения гемоглобина и DBSF до 1:5,0 процент выхода октамерной формы гемоглобина (с молекулярной массой 130 кДа) резко возрастает до 18%.

[00095] (5b-1) Электрофоретический анализ поперечно сшитого гемоглобина с использованием 15% SDS-PAGE.

[00096] Раствор поперечно сшитого гемоглобина смешивался с равным объемом восстановительного буфера для образцов (62 ммоль Tris-HCl (pH 6,8), 10% (в объемном отношении) глицерина, 5% (в объемном отношении) меркаптоэтанола и 2,3% (в отношении веса к объему) додецилсульфата натрия) и нагревался до 95°С в течение 10 мин. Образцы разделялись с использованием слаб-электрофореза в полиакриламидном геле с 15% разделяющим гелем 4% концентрирующим гелем. Электрофорез проводился при постоянной силе тока в 60 мА. После окончания электрофореза полиакриламидный гель окрашивался с помощью раствора, содержащего 0,1% (в отношении веса к объему) Кумасси голубого R350, 20% (в объемном отношении) метанола и 10% (в объемном отношении) уксусной кислоты. Интенсивности белковых полос, выраженные в единицах черного света (BLU), количественно определялись с использованием программного пакета Quantity One от компании «Bio-Rad».

[00097] (5b-2) Трипсиновое расщепление белковых полос, вырезанных из 15% SDS-PAGE

[00098] Белковые полосы были вырезаны из геля SDS-PAGE, нарезаны на кубики (1×1 мм) и отмыты от красителя в растворе, содержавшем 10% метанола и 10% уксусной кислоты. Отмытые от красителя кусочки геля были восстановлены в растворе 10 ммоль ДТТ с 25 ммоль NH₄CO₃ и алкилированы с помощью 55 ммоль раствора йодацетамида в 25 ммоль NH₄CO₃ в течение 45 мин в темноте, а затем было произведено расщепление белка в геле с использованием раствора модифицированного трипсина с концентрацией 20 нг/мкл в 25 ммоль NH₄CO₃ при 37°С в течение ночи. После окончания трипсинового расщепления полученные пептиды были экстрагированы из геля с помощью диффузии в раствор с 50% (в объемном отношении) ацетонитрила и 1% (в объемном отношении) трифторуксусной кислоты (TFA).

[00099] (5b-3) Анализ белковых полос с помощью время-пролетной масс-спектрометрии с лазерной ионизацией и диссоциации с использованием матрицы (MALDI-TOF MS) после их расщепления трипсином.

[000100] Расщепленные трипсином пептиды, экстрагированные из кубиков геля, были нанесены на мишень Anchorchip, на которую предварительно наносился 1 мкл матричного раствора (2 мг/мл НССА (альфа-циано-4-гидроксикоричная кислота), насыщенной в 50% ацетонитриле/ 0,1% TFA), и высушены на воздухе. После высушивания участок, на который были нанесены пептиды, был промыт раствором 10 ммоль монофосфатного буфера, после чего была проведена рекристаллизация с использованием смеси этанола, ацетона и 0,1% TFA (в соотношении 6:3:1). Анализ методом MALDI-TOF MS проводился с использованием аппарата Bruker Autoflex III (компания «Bruker Daltonic GmbH», Бремен, Германия), работавшего в режиме отражения, в диапазоне соотношений массы к заряду (m/z) от 800 до 3500 Да; остальные параметры были установлены следующим образом: источник ионов 25 кВ для фингерпринта массы пептидов (PMF), и рефлектор 26,3 кВ для PMF. Была осуществлена внешняя калибровка с использованием калибровочного стандарта Bruker Peptide Mix. Пики с соотношением S/N>4 автоматически маркировались с помощью программы Flex-Analysis (компания «Bruker Daltonic GmbH, Бремен, Германия). Масс-спектрометрические данные дополнительно анализировались с помощью программных пакетов MASCOT 2.2.04 и Biotools 2.1 (компания «Bruker Daltonic GmbH», Бремен, Германия), и полученные данные сравнивались с белками млекопитающих, внесенными в безызбыточную базу данных Национального центра биотехнологической информации (NCBlnr). Для осуществления поисков в базе данных использовались следующие параметры: моноизотопная точность массы <250 чнм, исходный заряд +1, пропущенные расслоения 1, карбамидометилирование цистеина как фиксированная модификация, окисление метионина как вариабельная модификация. Результаты с белковым скором выше 67 (p=0,05) на основании PMF считались положительной идентификацией. Прочие критерии для уверенной идентификации включали в себя требование, чтобы соответствие белка покрывало, по меньшей мере, 15% последовательности и чтобы соответствие имелось по меньшей мере для 4 пептидов.

[000101] После комбинирования результатов анализов, полученных с помощью (а) 15% SDS-PAGE и (b) MALDI-TOF MS, был определен состав поперечно сшитого гемоглобина. Из этих результатов следует, что ≥70% поперечно сшитого гемоглобина содержали сшивки типа β-β.

[000102] Пример 6

[000103] Поддержание низкого уровня содержания неактивного метгемоглобина в продукте после приготовления препарата

[000104] При сравнении с другими фармацевтическими продуктами, содержащими переносчики кислорода, и продуктами, полученными способами, изложенными в патентах США №7494974 В2 и №7504377 В2, продукт данного изобретения имеет низкие уровни содержания неактивных молекул метгемоглобина. В этом варианте осуществления к поперечно сшитому тетрамерному гемоглобину добавляется антиоксидант, например N-ацетилцистеин в количестве 0,2%. Если антиоксидант не добавляется, то неактивный метгемоглобин обнаруживается в высоких количествах (12-20%). Продукт данного изобретения имеет низкий уровень содержания неактивного метгемоглобина (<5%) и устойчив при высоких температурах, что увеличивает его эффективность при его использовании для лечения.

[000105] Для демонстрации стабильности продукта данного изобретения было проведено тестирование его тепловой устойчивости при 80°С. Полученные результаты показаны на фиг.15. Продукт, изготовленный в соответствии с патентами США №7494974 и №7504377, демонстрирует высокое содержание метгемоглобина (22-28%). Продукт настоящего изобретения, однако, демонстрирует низкий уровень содержания метгемоглобина (<5%).

[000106] Пример 7

[000107] Упаковка и стабильность продукта

[000108] Поскольку продукт настоящего изобретения стабилен в деоксигенированных условиях, важно, чтобы его упаковка обладала минимальной проницаемостью для газов. Для внутривенного применения продукта предполагается использовать специально разработанный 100-мл инфузионный мешок, изготовленный из ламинированного материала на основе пяти слоев EVA/EVOH толщиной 0,4 мм, у которого проницаемость для кислорода при комнатной температуре составляет от 0,006 до 0,132 см³ на 100 квадратных дюймов за 24 ч на одну атмосферу. Данный материал относится к пластикам Класса VI (в соответствии с определением Фармакопеи США 1988 года), который соответствует тестам на биологическую активность in vivo и физико-химическому тесту, а также пригоден для изготовления инфузионных мешков для осуществления внутривенных инъекций (следует отметить, что из этого материала могут быть изготовлены упаковки и других типов в зависимости от того, для чего предполагается использовать изобретенный продукт). Поверх первичной упаковки (инфузионного мешка) также используется вторичная упаковка в форме внешней оболочки из алюминированного пластика, обеспечивающая дополнительную защиту путем минимизации воздействия света и диффузии кислорода. Структура этой внешней оболочки включает в себя: 0,012-мм слой полиэтилентерефталата (PET), 0,007-мм слой алюминия (AL), 0,015-мм слой нейлона (NY) и 0,1-мм слой полиэтилена (РЕ). Пленка внешней оболочки имеет толщину 0,14 мм; ее проницаемость для кислорода при комнатной температуре равняется 0,006 см³ на 100 квадратных дюймов за 24 ч на одну атмосферу. Схематическое изображение инфузионного мешка представлено на фиг.16. Общая проницаемость для кислорода каждого инфузионного мешка из настоящего изобретения при комнатной температуре равняется 0,0025 см³ за 24 ч на одну атмосферу.

[000109] Было проведено исследование стабильности вышеописанного упаковочного материала при температуре 40°С и относительной влажности воздуха 75%. Полученные результаты приведены ниже в Таблице 6. Эти результаты свидетельствуют, что данный упаковочный материал обеспечивает поддержание низкого уровня содержания метгемоглобина в течение длительного времени.

[000110]

Исследование стабильности

Условия: Температура 40±2°С; Относительная влажность воздуха 75±5%.

Таблица 6
Упаковочный материал	Временные точки, месяцы	Тестируемые параметры
		Общее содержание Hb	Содержание Met-Hb	Содержание Oxy-Hb	Содержание эндотоксина
(г/дл)	(%)	(%)	(ЭЕ/мл)
Инфузионный мешок и внешняя оболочка из алюминированного пластика	0	6,3	3,2	7,3	0,02
	1	6,3	1,0	6,8	<0,02
	2	6,4	0,8	6,4	<0,02
	3	6,3	0,8	6,6	<0,02
6	6,3	0,6	5,2	0,02

[000111] Пример 8

[000112] Изучение токсичности

[000113] Были проведены эксперименты для оценки потенциальной токсичности очищенного поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина по настоящему изобретению. 10 самцов крыс линии Sprague-Dawley были распределены по трем группам: 3 в контрольную группу, 3 в низкодозовую группу и 4 в высокодозовую группу. Нормальный солевой раствор (в качестве контроля), очищенный поперечно сшитый тетрамерный гемоглобин в низкой дозировке (5,52 г/кг) и очищенный поперечно сшитый тетрамерный гемоглобин в высокой дозировке (6,90 г/кг), соответственно, вводились крысам с помощью непрерывного внутривенного вливания в яремную вену; скорость вливания была равна 3 мл/кг/ч. Режим применения препарата описан ниже в Таблице 7. Поперечно сшитый тетрамерный гемоглобин вводился крысам в течение срока длительностью до 33,3 ч. Состояние животных тщательно отслеживалось в течение 9 дней.

[000114]

Таблица 7
Исследуемые группы	Контрольная (n=3)	Низкодозовая (n=3)	Высокодозовая (n=4)
День - 7-День - 6	Хирургическая операция на животных, затем инфузионное введение NS в течение 24 ч
День - 5-День - 1	Ежедневные инъекции гепарина
День 0	Рандомизация и акклиматизация, инфузионное введение NS в течение 24 ч
День 1	Сбор материалов для метаболического анализа (воды и мочи) Инфузионное введение NS	Сбор материалов для метаболического анализа (воды и мочи) Введение Hb в течение 26,7 ч, затем введение NS в течение 21,3 ч	Сбор материалов для метаболического анализа (воды и мочи) Введение Hb в течение 33,3 ч, затем введение NS в течение 14,7 ч
День 2	Сбор материалов для метаболического анализа (воды и мочи)
День 3	Сбор материалов для метаболического анализа (воды и мочи)
День 4	Прекращение введения NS
День 5	Удаление защитного корсета и запечатывание катетера, возвращение животных в нормальные клетки
День 8	Перемещение животных в метаболические клетки для сбора мочи и регистрации потребления ими воды
День 9	Сбор материалов для метаболического анализа (воды и мочи) Умерщвление оставшихся животных Сбор крови (для получения как сыворотки, так и плазмы) Сохранение основных органов в формалине
* NS: нормальный солевой раствор, Hb: поперечно сшитый тетрамерный гемоглобин.

[000115] В День 9 у всех изучавшихся животных отбирались образцы крови для клинического патологического исследования. Моча для анализов мочи отбиралась со Дня 0 по День 3 и в День 9. Окончательная аутопсия проводилась в День 9. Оценивавшиеся параметры включали в себя результаты клинических наблюдений, массу тела животных, изменения массы тела, потребление воды, результаты клинических патологических исследований (гематологических, анализов клинической биохимии и анализов мочи), массы органов, соотношения масс органов к массе тела, соотношения масс органов к массе мозга, макропатологические данные и гистопатологические данные. Лечение поперечно сшитым тетрамерным гемоглобином по настоящему изобретению не приводило к смерти животных или выявлению отрицательных клинических изменений и не оказывало сколько-нибудь значительного влияния на изменения массы тела и потребление воды у крыс.

[000116] Не было выявлено никаких явных изменений в гематологических и клинико-химических параметрах, связанных с лечением. Исследование мочи показало, что в День 2 концентрации хлорид-иона и калия в моче в группе, получавшей препарат, было ниже, чем в контрольной группе. В День 2 и в День 3 в группах, получавших препарат, наблюдалось кровяное окрашивание, более высокие концентрации белка в моче и большее число красных кровяных телец в моче по сравнению с контрольной группой. Все эти изменения вскоре вновь возвращались к норме. Никаких существенных различий в соотношении массы легких к массе тела обнаружено не было. Во время данного исследования ни одной неожиданной смерти животных и никаких явных клинических признаков токсичности зафиксировано не было. Кроме того, макропатологический и гистологический анализ не выявил никаких значительных аномалий ни в каких органах, включая легкие, сердце, печень, селезенку и почки (которые можно было бы приписать токсическим побочным эффектам инфузионного введения).

[000117] Пример 9

[000118] Сохранение сердца

[000119] Поперечно сшитый тетрамерный гемоглобин может применяться в качестве кардиоплегического раствора в модели сохранения сердца во время сердечно-легочного шунтирования у собак породы бигль. 18 собак породы бигль были случайным образом разделены на 3 группы: контрольную, группу, получавшую раствор Св. Томаса (STS), и группу, получавшую 0,1% раствор поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина. Сердечно-легочное шунтирование осуществлялось стандартным способом, канюли вводились в восходящую аорту, верхнюю и нижнюю полые вены и в левый желудочек для продувки. Кроме контрольной группы, группе, получавшей чистый STS (группе STS), и группе, получавшей 0,1 г/дл поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина (группе 0,1% Hb), вливание осуществлялось в корень аорты после ее пережимания, обеспечивавшего остановку сердца, продолжавшуюся в течение 120 мин. Во время реперфузии проводилось измерение показателей сердечной деятельности, включая минутный сердечный выброс, давление в легочной артерии, давление заклинивания в легочной артерии, среднее артериальное давление, центральное венозное давление и частоту сердечных сокращений, а также газы крови, и их сравнение с их исходными значениями. Также проводилось измерение высвобождения сердечных ферментов, в частности креатинкиназы MB, лактатдегидрогеназы и тропонина-1, в качестве суррогатных маркеров поражения сердца. Проводилось окрашивание гематоксилином и эозином и определение содержания воды в сердце для выявления морфологических и патологических изменений в миокарде через 120 мин после реперфузии.

[000120] В исходных условиях результаты измерения показателей сердечной деятельности, потребления кислорода и высвобождения сердечных ферментов были сходными во всех 3 группах. Во время реперфузии частота сердечных сокращений, минутный сердечный выброс и центральное венозное давление были очень сильно понижены в группе STS по сравнению с контрольной группой, однако частота сердечных сокращений, минутный сердечный выброс/ центральное венозное давление и потребление кислорода в сердце были в высокой степени сохранены в группе 0,1% Hb, и эти значения были сходны с теми, которые были зафиксированы в контрольной группе. Введение поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина в STS также очень сильно уменьшало высвобождение лактатдегидрогеназы, креатинкиназы MB и тропонина-I по сравнению с группой STS. Более того, набухание клеток, жировые изменения и гиалиновые изменения были значительно менее выражены в группе 0,1% Hb по сравнению с группой STS. Значения других параметров, включая давление в легочной артерии, давление заклинивания в легочной артерии, среднее артериальное давление и содержание воды в сердце, не имели выраженных различий между 3 группами. В этом исследовании результаты всех измерений для группы 0,1% Hb не имели значительных отличий от результатов для контрольной группы. Введение 0,1 г/дл тетрамерного гемоглобина с поперечными внутримолекулярными связями в STS во время сердечно-легочного шунтирования оказывало более выраженное кардиопротективное действие, чем STS (который в настоящее время используется в качестве стандартного кардиоплегического раствора), и исход также был сравним с контрольной группой,

[000121] Пример 10

[000122] Исследования оксигенации в нормальных и раковых тканях

[000123] (10а) Улучшение оксигенации в нормальных тканях

[000124] Было проведено несколько исследований оксигенации нормальных тканей с использованием поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина (см. фиг.9). Было проведено сравнительное фармакокинетическое и фармакодинамическое исследование на буйволовых крысах. Инбредным самцам буйволовых крыс индивидуально вводили раствор поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина из расчета 0,2 г/кг или ацетатный буфер Рингера (контрольной группе) с помощью внутривенной инъекции. Зависимость концентрации гемоглобина в плазме крови от времени определялась с помощью фотометра Hemocue™ через 1, 6, 24 и 48 ч и сравнивалась с его начальными показаниями. Данный метод основан на фотометрическом измерении содержания гемоглобина, при котором концентрация гемоглобина напрямую определяется в г/дл. Парциальное давление кислорода (pO₂) в мышце задней лапы буйволовых крыс измерялось напрямую с помощью аппарата для отслеживания оксигенации тканей и температуры Oxylab™ (производства компании «Oxford Optronix Limited»). Крысы анестезировались внутрибрюшинным введением раствора пентабарбитала из расчета 30-50 мг/кг, после чего кислородный сенсор вводился им в мышцу. Все данные по значениям pO₂ регистрировались с помощью системы для сбора данных Datatrax2 (производства компании «World Precision Instrument») в режиме реального времени.

[000125] Как видно из фиг.9, инъекция раствора поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина из расчета 0,2 г/кг демонстрирует корреляцию между фармакокинетическими (концентрацией гемоглобина в плазме) и фармакодинамическими (снабжением мускульной ткани кислородом) свойствами раствора изобретенного поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина. Важно отметить, что значительное повышение оксигенации наблюдалось в течение более длительного времени, чем повышение уровня содержания гемоглобина в плазме. Концентрация гемоглобина в плазме показана на графике (А), а снабжение мышцы кислородом - на графике (В).

[000126] (10b) Улучшение оксигенации в крайне гипоксических областях опухолей

[000127] Улучшение оксигенации в крайне гипоксических областях опухолей оценивалось с использованием модели ксенотрансплантата человеческой карциномы носоглотки (CNE2). Клеточная линия CNE2 была получена в Лаборатории генетики рака Университета Гонконга. Приблизительно 1×10⁶ раковых клеток были введены подкожно 4-6-недельным инбредным мышам линии BALB/c AnN-nu (голым). Когда ксенотрансплантат опухоли достигал диаметра в 8-10 мм, парциальное давление кислорода в опухолевой массе напрямую отслеживалось с помощью аппарата для отслеживания оксигенации тканей и температуры Oxylab™ (производства компании «Oxford Optronix Limited»). Парциальное давление кислорода в различных участках ткани измерялось с помощью полностью компьютеризированной системы микропозиционирования PTS30 (производства компании «Discovery Technology International»). Все данные по значениям pO₂ регистрировались с помощью системы для сбора данных Datatrax2 (производства компании «World Precision Instrument») в режиме реального времени. Когда значения pO₂ стабилизировались, в хвостовую вену мышей вводили раствор изобретенного поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина из расчета 1,2 г/кг, после чего проводилось измерение оксигенации ткани. Полученные результаты демонстрируют значительное повышение оксигенации в наиболее гипоксической области опухоли. После внутривенного введения раствора поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина из расчета 1,2 г/кг медианное значение pO₂ увеличилось с 0,2 мм рт.ст. до 3,9 мм рт.ст. (через 3 ч) и до 10,6 мм рт.ст. (через 6 ч) соответственно (см. фиг.10).

[000128] Пример 11

[000129] Исследование лечения рака (химиосенсибилизирующее действие поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина)

[000130] Химиосенсибилизирующее действие изобретенного поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина было оценено на различных линиях раковых клеток. Линия клеток лейкемии (Jurkat), линия клеток рака толстой кишки (COLO205), устойчивая к цисплатину линия клеток рака легких (A549/Cisp) и устойчивая к адриамицину линия клеток рака молочных желез (MCF-7/ADM) были получены в Институте рака Китайской академии медицинских наук. 8000 клеток линии Jurkat, 4000 клеток линии COLO205, 3000 клеток линии A549/Cisp и 3000 клеток линии MCF-7/ADM были помещены по отдельности (в трех повторах) в 96-луночный планшет. После прикрепления к субстрату клетки инкубировались при 37°С с различными химиотерапевтическими агентами поодиночке или в сочетании с раствором поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина в концентрации 0,5 мг/мл. Клетки линии Jurkat подвергались воздействию сульфата винкристина в концентрациях 0,31, 0,63, 1,25, 2,5, 5 и 10 мкг/мл; клетки линии COLO205 подвергались действию 5-фторурацила в концентрациях 0,78, 1,56, 3,13, 6,25 и 12,5 мкг/мл; клетки линии A549/Cisp подвергались воздействию цисплатина в концентрациях 0,39, 0,78, 1,56, 3,13, 6,25 и 12,5 мкг/мл, а клетки линии MCF-7/ADM подвергались воздействию адриамицина в концентрациях 0,39, 0,78, 1,56, 3,13, 6,25 и 12,5 мкг/мл. После завершения инкубации подавление роста раковых клеток определялось с использованием анализа чувствительности опухолевых клеток к химиотерапевтическим средствам с использованием АТФ (АТР-ТСА).

[000131] Линия клеток рака пищевода HKESC-1 была получена в Лаборатории генетики рака Университета Гонконга. 2000 раковых клеток помещались в 96-луночный планшет. После прикрепления к субстрату клетки инкубировались при 37°С с цисплатином поодиночке в концентрациях 0,08, 0,4, 2, 10 и 50 мкг/мл, или в комбинации с раствором поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина в концентрации 3 мг/мл. После завершения инкубации цитотоксичность оценивалась с использованием анализа пролиферации клеток с использованием МТТ. Полученные результаты свидетельствуют, что добавление изобретенного поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина значительно повышает чувствительность к химиотерапевтическим средствам у различных линий раковых клеток, включая клетки линий A549/Cisp и MCF-7/ADM, обладающих высокой устойчивостью к химиотерапии (см. фиг.8).

[000132] Пример 12

[000133] Лечение тяжелого острого геморрагического шока

[000134] (12а) Лечение тяжелого острого геморрагического шока у собак породы бигль

[000135] Изобретенный поперечно сшитый тетрамерный гемоглобин был использован в качестве реанимационного средства в модели тяжелого острого геморрагического шока у собак породы бигль. 60 собак породы бигль были случайным образом разделены на 4 группы, по 15 собак в каждой группе, для которых были использованы разные реанимационные средства.

[000136] Группа 1: декстран (отрицательный контроль)

[000137] Группа 2: аутокровь животного (положительный контроль)

[000138] Группа 3: низкодозовое лечение (0,35 г поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина на килограмм массы тела)

[000139] Группа 4; среднедозовое лечение (1,05 г поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина на килограмм массы тела)

[000140] Тяжелый острый геморрагический шок создавался путем удаления цельной крови животного в количестве 50 мл на килограмм массы тела. Через 10 мин после наступления геморрагического шока животным инфузионно вводили декстран (50 мл/кг), их аутокровь (50 мл/кг) или различные дозы поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина (5 мл/кг или 15 мл/кг). Скорость введения поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина была установлена равной 10 мл/кг/ч; после лечения за всеми экспериментальными животными вели наблюдение в течение 7 дней. В число параметров, отслеживавшихся и анализировавшихся во время исследования, входили выживание животных, масса тела, результаты электрокардиографии (ЭКГ), кровяное давление, частота сердечных сокращений, частота дыхания, температура тела, концентрация гемоглобина в плазме крови, гематологические показатели, газ артериальной крови, результаты анализов мочи, клиническая биохимия, сворачивание крови, физические состояния и побочные эффекты. Среди прочих показателей выживание животных было принято в качестве основного показателя эффективности лечения. После семи дней лечения в группе, получавшей поперечно сшитый тетрамерный гемоглобин, выживаемость животных была значительно выше, чем в контрольной группе и в группе, получавшей аутокровь (как это видно из Таблицы 8, приводимой ниже).

[000141]

[000142] Исследование на модели геморрагического шока у собак

Таблица 8
Группа	Число выживших животных после 7 дней (n=15)	Доля выживших животных после 7 дней, %
Декстран (отрицательный контроль)	7	46
Аутокровь собак	12	80
Низкодозовое лечение гемоглобином	14	97
Среднедозовое лечение гемоглобином	15	100

[000143] (12b) Лечение тяжелого острого гемморрагического шока у крыс

[000144] Изобретенный поперечно сшитый тетрамерный гемоглобин также был использован в качестве реанимационного средства в модели тяжелого острого гемморрагического шока у крыс. 80 крыс линии Sprague-Dawley были случайным образом разделены на 5 групп, по 16 крыс в каждой группе, для которых были использованы разные реанимационные средства.

[000145] Группа 1: лактатный раствор Рингера (отрицательный контроль)

[000146] Группа 2: аутокровь животного (положительный контроль)

[000147] Группа 3: низкодозовое лечение (0,1 г поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина на килограмм массы тела)

[000148] Группа 4: среднедозовое лечение (0,3 г поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина на килограмм массы тела)

[000149] Группа 5: высокодозовое лечение (0,5 г поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина на килограмм массы тела)

[000150] Тяжелый острый геморрагический шок создавался путем удаления 50% цельной крови животного, что соответствовало приблизительно 35 мл на килограмм массы тела.

Через 10 мин после наступления гемморрагического шока животным инфузионно вводили лактатный раствор Рингера, их аутокровь или различные дозы поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина (0,1 г Hb/кг, 0,3 г Hb/кг или 0,5 г Hb/кг). Скорость введения поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина была установлена равной 5 мл/ч; после лечения за всеми экспериментальными животными вели наблюдение в течение 24 ч. В число параметров, отслеживавшихся и анализировавшихся во время исследования, входили выживание животных, гемодинамика, механика миокарда, минутный сердечный выброс, работа сердца, газ крови, снабжение тканей кислородом и потребление кислорода в тканях, кровоснабжение тканей и кислородный потенциал (в печени, почках и мозге), работа печени и почек, вязкость крови и скорость регулирования дыхания в митохондриях (в печени, почках и мозге). Среди прочих показателей выживание животных было принято в качестве основного показателя эффективности лечения. После 24 ч наблюдения в группе, получавшей изобретенный поперечно сшитый тетрамерный гемоглобин, выживаемость животных была значительно выше, чем в контрольной группе и в группе, получавшей аутокровь (как это видно из Таблицы 9, приводимой ниже).

[000151]

Таблица 9
Группы	Число выживших животных после 24 ч (n=16)	Доля выживших животных после 24 ч, %
Отрицательный контроль	3	18,75
Низкодозовое лечение (0,1 г Hb/кг)	6	37,5
Среднедозовое лечение (0,3 г Hb/кг)	8	50
Высокодозовое лечение (0,5 г Hb/кг)	12	75
Аутокровь крыс	10	62,5
*Hb: поперечно сшитый тетрамерный гемоглобин.

[000152] Пример 13: Изучение образования метгемоглобина in vitro

[000153] В соответствии с известным уровнем техники считалось, что раствор полимеризованного гемоглобина с высокой молекулярной массой является предпочтительным, поскольку такой гемоглобин дольше сохраняется в кровотоке. Поэтому стабилизированный поперечно сшитый тетрамерный гемоглобин по настоящему изобретению сравнивался с полимеризованным гемоглобином с высокой молекулярной массой in vitro для анализа их устойчивости в условиях, имитирующих кровообращение. Тестовая система изображена на фиг.17. В перепускном контуре для измерения образования метгемоглобина А - емкость для образца, В - патрубок для слива образца, С -насос, D - контактор Liqui-Cel, Е - патрубок для отбора проб и F - патрубок для введения образцов. Производилось сравнение зависимости образования метгемоглобина от времени для раствора поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина по настоящему изобретению и для коммерчески доступного продукта (Oxyglobin®), содержащего приблизительно 68% полимерной фракции (молекулярная масса ≥ 128000). Перед началом эксперимента все образцы были разбавлены до концентрации в 5 г/дл, и 50 мл разбавленного образца вводили в емкость для образца через патрубок для введения образцов. Скорость работы жидкостного насоса была установлена равной 30 мл/мин, и образцу давали заполнить контур в системе. На протяжении всего эксперимента температура емкости с образцом поддерживалась равной 37°С. Для измерения содержания метгемоглобина 0,2-мл пробы тестового образца отбирались из патрубка для отбора проб для осуществления кооксиметрии (с помощью аппарата IL-682 производства компании «Instrumentation Laboratory»). После этого сжатый воздух пропускался через мембранный контактор Liqui-Cel со скоростью 2,0 мл/мин для инициации оксигенации образцов. Через каждые 30 мин производился отбор 0,2-мл проб. После обработки в течение 5 ч доля метгемоглобина в растворе изобретенного поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина и в коммерчески доступном продукте (Oxyglobin®) повысилась до 8,7% и 16,4% соответственно. Эти результаты показывают, что скорость образования неактивного метгемоглобина для полимерного гемоглобина гораздо выше, чем для изобретенного поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина (см. фиг.18).

[000154] Хотя вышеизложенное изобретение было описано в отношении различных вариантов осуществления, список этих вариантов осуществления не является исчерпывающим. Многочисленные вариации и модификации будут очевидны для специалистов в данной области. Подобные вариации и модификации считаются включенными в рамки приводимой ниже формулы изобретения.

1. Способ приготовления лекарственного препарата, содержащего высокоочищенный и стабильный при высоких температурах переносчик кислорода; лекарственный препарат, содержащий переносчик кислорода, включающий в себя гемоглобин; способ, включающий в себя:
a) получение цельной крови млекопитающих, включающей в себя, по меньшей мере, красные кровяные тельца и плазму;
b) отделение красных кровяных телец от плазмы в цельной крови млекопитающих;
c) фильтрацию красных кровяных телец, отделенных от плазмы, для получения фракции отфильтрованных красных кровяных телец;
d) промывку фракции отфильтрованных красных кровяных телец для удаления примесей плазматических белков для получения промытых красных кровяных телец;
e) разрушение промытых красных кровяных телец с помощью контролируемого гипотонического лизиса за время, достаточное для лизиса красных кровяных телец, но недостаточное для лизиса белых кровяных телец, в аппарате для мгновенного цитолиза с пропускной способностью 50-1000 л/ч для получения раствора, состоящего из лизата разрушенных красных кровяных телец;
f) выполнение фильтрации для удаления по меньшей мере части отходов фильтрации из полученного лизата;
g) экстракцию первого раствора гемоглобина из лизата;
h) выполнение первой процедуры ультрафильтрации с использованием ультрафильтрационного фильтра, предназначенного для удаления примесей с молекулярной массой, превышающей молекулярную массу тетрамерного гемоглобина, для дальнейшего удаления любых вирусов и остаточных отходов фильтрации из первого раствора гемоглобина для получения второго раствора гемоглобина;
i) выполнение проточной колоночной хроматографии для второго раствора гемоглобина для удаления фосфолипидов, белковых примесей и димерного гемоглобина для получения раствора гемоглобина, не содержащего фосфолипиды и с низким содержанием белковых примесей и димеров;
j) выполнение второй процедуры ультрафильтрации для раствора гемоглобина, не содержащего фосфолипиды и с низким содержанием белковых примесей и димеров с использованием фильтра, предназначенного для удаления примесей, позволяющего получить концентрированный раствор очищенного гемоглобина, не содержащий фосфолипиды и с низким содержанием белковых примесей и димеров;
k) блокирование сульфгидрильных групп молекул гемоглобина в концентрированном растворе очищенного гемоглобина, не содержащем фосфолипиды и с низким содержанием белковых примесей и димеров, с помощью сульфгидрильного реагента в полностью оксигенированной среде, получаемые таким образом молекулы гемоглобина содержат, по меньшей мере, по одному цистеиновому остатку, включающему тиолзащитную группу, в результате чего молекулы гемоглобина становятся неспособны связывать эндотелиальный релаксирующий фактор через цистеиновый центр;
l) создание поперечной сшивки в гемоглобине с тиолзащитными группами с помощью бис-3,5-дибромсалицилфумарата для получения стабильного при высоких температурах поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина без образования полимерного гемоглобина, в результате чего молекулярная масса получаемого поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина составляет 60-70 кДа, и он состоит практически исключительно из неполимерного поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина;
m) замена полученного поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина на подходящий физиологический буфер;
n) удаление любых остаточных количеств поперечно не сшитого тетрамерного гемоглобина и любых остаточных химикатов с помощью промывки;
о) добавление N-ацетилцистеина в концентрации 0,2-0,4% к поперечно сшитому тетрамерному гемоглобину для поддержания содержания метгемоглобина на уровне ниже 5% и
р) добавление поперечно сшитого тетрамерного гемоглобина с тиолзащитными группами, с низким содержанием димеров, не содержащего полимерный гемоглобин и фосфолипиды и стабильного при температурах до 80°С, к фармацевтически приемлемому носителю.

2. Способ приготовления лекарственного препарата, содержащего переносчик кислорода, по п.1, в котором конструкция аппарата для мгновенного цитолиза включает в себя статический смеситель.

3. Способ приготовления лекарственного препарата, содержащего переносчик кислорода, по п.1, в котором упомянутый поперечно сшитый тетрамерный гемоглобин получают из бычьего, свиного, собачьего или лошадиного гемоглобина.

4. Способ приготовления лекарственного препарата, содержащего переносчик кислорода, по п.1, в котором для колоночной хроматографии используются одна или несколько катионообменных колонок и анионообменных колонок.

5. Способ приготовления лекарственного препарата, содержащего переносчик кислорода, по п.4, в котором ионообменными колонками являются одна или несколько колонок с диэтиламиноэтилцеллюлозой, колонок с карбоксиметилцеллюлозой и/или гидроксиапатитных колонок.

6. Способ приготовления лекарственного препарата, содержащего переносчик кислорода, по п.1, в котором поперечное сшивание в гемоглобине с помощью бис-3,5-дибромсалицилфумарата включает в себя, по меньшей мере, поперечное сшивание типа α-α и/или β-β.

7. Способ приготовления лекарственного препарата, содержащего переносчик кислорода, по п.6, в котором условия для поперечного сшивания выбираются таким образом, что доля поперечных сшивок типа β-β составляет свыше 50% от числа всех поперечных сшивок.

8. Способ приготовления лекарственного препарата, содержащего переносчик кислорода, по п.6, в котором условия для поперечного сшивания выбираются таким образом, что доля поперечных сшивок типа β-β составляет свыше 60% от числа всех поперечных сшивок.

9. Способ приготовления лекарственного препарата, содержащего переносчик кислорода, по п.6, в котором условия для поперечного сшивания выбираются таким образом, что доля поперечных сшивок типа β-β составляет свыше 70% от числа всех поперечных сшивок.

10. Способ приготовления лекарственного препарата, содержащего переносчик кислорода, по п.1, в котором фармацевтически приемлемым носителем является физиологический буфер или вода.

11. Способ приготовления лекарственного препарата, содержащего переносчик кислорода, по п.1, дополнительно включающий в себя упаковку полученного препарата в многослойный гибкий инфузионный мешок, обладающий проницаемостью для кислорода менее 0,0025 см³ за 24 ч при условиях окружающей среды.

12. Лекарственный препарат, содержащий высокоочищенный и стабильный при высоких температурах переносчик кислорода, включающий в себя гемоглобин, состоящий в основном из поперечно сшитого неполимерного тетрамерного гемоглобина, полученного способом по п.1.

13. Способ оксигенации тканей, включающий в себя поступление препарата по п.12 в ткань in vivo или ex vivo.