Способ определения аутоантител к тромбоцитам


 


Владельцы патента RU 2488114:

Федеральное государственное учреждение "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" (RU)

Изобретение относится к области медицины, конкретно к методам диагностики аутоиммунных заболеваний крови человека. Способ заключается в определении процентного содержания тромбоцитов, покрытых иммуноглобулинами классов G и М, с использованием проточной цитометрии. Способ позволяет повысить точность диагностики иммунной тромбоцитопении, определить тактику лечения и контролировать его эффективность. Для анализа исследуют собственные тромбоциты и сыворотку крови больного, в качестве маркеров аутоиммунного процесса используют антитела, относящиеся к иммуноглобулинам классов G и М, при этом коэффициент аутосенсибилизции тромбоцитов рассчитывают как отношение количества Anti-Human IgG/IgM-позитивных клеток к числу клеток, фиксирующих CD41: значение коэффициента аутосенсибилизции тромбоцитов более 2% без инкубации с аутосывороткой и более 5% после инкубации с аутосывороткой расценивают как наличие у пациента антитромбоцитарных аутоантител, фиксированных на клетках и/или циркулирующих в плазме крови. 3 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, конкретно к методам диагностики аутоиммунных заболеваний крови человека. Способ заключается в определении процентного содержания тромбоцитов, покрытых иммуноглобулинами классов G и M, с использованием проточной цитометрии. Способ позволяет повысить точность диагностики иммунной тромбоцитопении, определить тактику лечения и контролировать его эффективность.

Изобретение относится к области медицины, конкретно к проточно-цитометрическому способу диагностики аутоиммунной тромбоцитопении. Для осуществления способа из периферической крови человека выделяют тромбоциты, окрашивают их мечеными моноклональными антителами к CD41, IgG, IgM человека и анализируют с помощью проточной цитометрии. Показатель аутосенсибилизации вычисляют как отношение числа IgG (IgM)-позитивных клеток к числу клеток, фиксирующих анти-CD41 антитела. Использование способа направлено на диагностику этиологии тромбоцитопении.

Снижение количества тромбоцитов в периферической крови человека может быть следствием воздействия ряда факторов, основными из которых являются образование аутоиммунных антитромбоцитарных антител, депрессия костномозгового кроветворения, диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови, сепсис, прием лекарственных средств, гемодилюция. Для решения вопроса о вовлечении иммунных механизмов в развитие тромбоцитопении необходимо определение аутоантител как фиксированных на поверхности клеток, так и циркулирующих в плазме крови. Результаты исследования применимы для определения тактики ведения больных и контроля эффективности кортикостероидной терапии.

Известен способ выявления антитромбоцитарных аутоантител иммуноферментным методом с нативными и модифицированными тромбоцитами (Зотиков Е.А., 2003). Однако использование данного метода для обнаружения аутоантител, фиксированных на собственных тромбоцитах больного, возможно только при числе тромбоцитов в периферической крови более 70×109/л. В то же время наибольшую диагностическую значимость имеет выявление аутоантител при низких значениях тромбоцитов в крови, т.к. именно эти состояния требуют медикаментозного лечения.

Известен способ определения антитромбоцитарных аутоантител, выполняющийся с помощью иммунофлуоресцентного теста с использованием сыворотки против иммуноглобулинов человека, меченой флуоресцирующим красителем (Катанджян Н.М., 1985). Недостатком метода является отсутствие автоматизации при оценке результатов исследования, что не исключает влияния субъективности.

Известен способ определения антител к тромбоцитам твердофазным методом (Capture-P) с образованием монослоя тромбоцитов с использованием специфического реагента Capture LISS и индикаторных эритроцитов. Недостатком данного способа является существенное затруднение при проведении исследования образцов крови больных с глубокой тромбоцитопенией (количество тромбоцитов в крови менее 20×109/л).

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ обнаружения антитромбоцитарных антител с помощью проточной цитометрии (Kohler М., 1996), при котором приготовленную суспензию тромбоцитов и лимфоцитов донора инкубируют с сывороткой крови реципиента, окрашивают моноклональными флуорисцентмечеными антителами и выявляют фиксированные на клетках антитела на проточном цитофлуориметре. Способ используется для определения иммунологической совместимости донора и реципиента по антигенам тромбоцитов и лимфоцитов перед трансфузией тромбоцитных концентратов. Данный способ, обладая высокой специфичностью и чувствительностью, позволяет получить результат в течение 2 часов, что имеет несомненное значение для практической трансфузиологии. Однако он применяется только для диагностики аллосенсибилизации больных и не предусматривает выявления антител аутологичной направленности.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание способа, позволяющего выявлять фиксированные и циркулирующие в плазме крови антитромбоцитарные аутоантитела, принадлежащие к иммуноглобулинам классов G и M. Предлагаемый способ определения фиксированных и циркулирующих антитромбоцитарных аутоантител повышает точность диагностики аутоиммунной тромбоцитопении, что, в сою очередь, позволяет:

- назначать адекватную медикаментозную терапию;

- проводить контроль эффективности лечения;

- отслеживать момент возникновения рецидива заболевания.

Для достижения указанного результата в соответствии с прототипом из периферической крови выделяют суспензию тромбоцитов, окрашивают их мечеными антителами к CD41 и Anti-Human IgG и анализируют с помощью проточной цитометрии. В отличие от прототипа, в котором проводится выделение клеток крови доноров и определение аллоантител в сыворотке крови реципиента, в предлагаемом способе выделяют тромбоциты больного, добавляют аутосыворотку крови пациента и исследуют фиксированные и циркулирующие антитромбоцитарные аутоантитела. Оценку результата проводят в соответствии с разработанными критериями нормы. В отличие от прототипа выделенные тромбоциты дополнительно окрашивают мечеными антителами Anti-Human IgM, что необходимо для диагностики аутоиммунного заболевания в начальной стадии. Коэффициент аутосенсибилизации тромбоцитов определяют по соотношению числа Anti-Human IgG- (или Anti-Human IgM) позитивных тромбоцитов и числа клеток, фиксирующих CD41.

Способ осуществляется следующим образом:

Вариант 1

1. Выделение суспензии тромбоцитов: 3 мл венозной крови собирают в пробирки с антикоагулянтом. Кровь разбавляют в 2 раза раствором Хенкса (НПО «Микроген» ТУ 9385-088-1423783-08), затем ее наслаивают на эквивалентный объем фиколл-урографина (плотность 1,078) (Фиколл 400 NPS400, Урографин 76% N ЛС-001850) в силиконированную пробирку с коническим дном и центрифугируют 15 мин при 1200 g. Клетки из интерфазного кольца собирают, добавляют 10 мл раствора Хенкса и центрифугируют 5 мин при 700 g. Супернатант удаляют, а осадок ресуспензируют в растворе Хенкса, доводя концентрацию тромбоцитов до 4-6×105/мкл.

2. Маркируют пробирки для каждого пациента в расчете на три пробы (A, B, C). Полученную суспензию тромбоцитов вносят по 100 мкл в каждую пробу. В пробу с маркировкой «C» добавляют 100 мкл аутосыворотки пациента и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем во все пробы добавляют по 5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) (Биоло T), содержащего 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) (Sigma). Центрифугируют 5 мин при 3000 g. Последнюю процедуру повторяют 2 раза. Осадок клеток ресуспензируют в 100 мкл PBS.

3. В пробирки первой пробы (А) вносят по 10 мкл моноклональных антител CD41-FITC (меченые флуоресцеинизотиоционатом) (Beckman Coulter IOTest pN IM0649V), в пробирки второй и третьей пробы (B, C) - по 100 мкл моноклональных антител Goat F(ab')2 Anti-Human IgG-FITC, предварительно разведенных в PBS в соотношении 1:20. Пробы инкубируют в темноте 20 минут. Затем добавляют по 5 мл буфера PBS+BSA, и центрифугируют 5 мин при 3000 g. Последнюю процедуру повторяют.

4. Образцы анализируют на проточном цитофлуориметре, оснащенном двумя флуоресцентными каналами и лазером (длина волны 488 нм). Анализ клеток в образце проводят по трем параметрам: интенсивности прямого и бокового (бидиректного) светорассеяния (линейная шкала), флуоресценции FITC.

Полученные данные регистрируют в табличном виде. Анализ результатов осуществляют в следующем порядке. С помощью известных технических средств строят график распределения клеток по интенсивности светорассеяния и флуоресценции FITC. При анализе пробы «А» на графике выбирают регион неповрежденных тромбоцитов и определяют количество клеток, окрашенных моноклональными антителами к CD41. Далее анализируют тот же регион, но в пробах «B» и «C», определяя количество клеток, окрашенных моноклональными антителами Anti-Human IgG. В каждом образце анализируют 2×105 тромбоцитов.

Коэффициент аутосенсибилизации определяют как отношение числа клеток, окрашенных Anti-Human IgG, к числу CD41-положительных клеток.

Установлено, что у 95% здоровых лиц (доноров компонентов крови) значение фиксированных антител не превышает 2%, циркулирующих антител - 5%.

Вариант 2

В постановке вместо моноклональных антител Goat F(ab')2 Anti-Human IgG-FITC используются антитела Mouse Anti-Human IgM-FITC (Clone UHB). Данный вариант, направленный на исследование аутоантител класса IgM, применяется при анализе крови пациентов, имеющих клиническую картину иммунной тромбоцитопении в остром периоде заболевания, у которых аутоиммунные антитромбоцитарные IgG антитела не выявляются.

Ниже приводятся клинические примеры.

Пример 1

Пациент С., 71 год. Обследование во время диспансеризации. Диагноз: тромбоцитопения неясной этиологии (количество тромбоцитов в периферической крови - 98×109/л). В таблице 1 приведен результат иммуногематологического исследования фиксированных и циркулирующих антитромбоцитарных аутоантител.

Заключение: Коэффициент аутосенсибилизации тромбоцитов соответствует значениям нормы. Данных за иммунную природу тромбоцитопении не получено.

Пример 2

Пациент А., 57 лет. Клинический диагноз: иммунная тромбоцитопения, впервые выявленная. Острое течение. Стационарное лечение с 15.03.10 по 30.03.10. Проводимая терапия: метипред по стандартной схеме. В таблице 2 приведен результат иммуногематологического исследования фиксированных и циркулирующих антитромбоцитарных аутоантител от 15.03.10.

Заключение: Выявлен высокий коэффициент аутосенсибилизации тромбоцитов без инкубации (4,9%) и после инкубации с аутосывороткой (42,8%), что характерно для тромбоцитопении иммунной этиологии.

В таблице 3 приведен результат иммуногематологического исследования фиксированных и циркулирующих антитромбоцитарных аутоантител от 30.03.10.

Заключение: Коэффициент аутосенсибилизии тромбоцитов соответствует значениям нормы. Получено иммуногематологическое подтверждение эффективности медикаментозной терапии.

Таблица 1
Проба Объект исследования Моноклональные антитела Количество MKA-позитивных клеток, % Коэффициент аутосенсибилизации
A Тромбоциты CD41 98,4
B Тромбоциты Anti-Human IgG 0,3 0,3
C Тромбоциты + аутосыворотка Anti-Human 0,04 0,04
Примечание. Количество тромбоцитов в периферической крови - 98×109/л.
Таблица 2
Проба Объект исследования Моноклональные антитела Количество MKA-позитивных клеток, % Коэффициент аутосенсибилизации
A Тромбоциты CD41 44,6
B Тромбоциты Anti-Human IgG 2,2 4,9
C Тромбоциты + аутосыворотка Anti-Human IgG 19,1 42,8
Примечание. Количество тромбоцитов в периферической крови - 5×109/л.
Таблица 3
Проба Объект исследования Моноклональные антитела Количество MKA-позитивных клеток, % Коэффициент аутосенсибилизации
A Тромбоциты CD41 89,9
B Тромбоциты Anti-Human IgG 1,2 1,3
C Тромбоциты + аутосыворотка Anti-Human IgG 1,4 1,6
Примечание. Количество тромбоцитов в периферической крови -200×109/л.

Список литературы:

1. Kohler М., Dittmann J., Legler T.J., Lynen R., Humpe A., Riggert J., Neumeyer H., Pies A., Panzer S., Mayr W.R. Flow cytometric detection of platelet-reactive antibodies and application in platelet crossmatching // Transfusion, 1996, 366: 250-255.

2. R.Hoffman, E.J.Benz, S.J.Shattil, B.Furie, H.J.Cohen, L.E.Silberstein, P.McGlave. Hematology: basic principles and practice / (edited by) - 3rd Edition, 2000, 2584 p.

3. G.F.Lucas and P.Metcalfe Platelet and granulocyte glycoprotein polymorphisms Transfusion Medicine, 2000, 10, 157-154

4. Annette Von Drygalski, M.D., Brian R.Curtis, M.S., Danial W. Bougie, Ph.D., et al. Vancomycin-Induced Immune Thrombocytopenia The New England Journal of Medicine pp.904-910

5. Головкина Л.Л., Кутьина, Пушкина Т.Д. и соавт. Гуморальный ответ на антигены тромбоцитов у больных заболеваниями системы крови при трансфузиях тромбоцитов. // Вестник гематологии. - 2009. - №2. - T.V. - С.13-14.

6. Зотиков Е.А., Бабаева А.Г., Головкина Л.Л. Тромбоциты и антитромбоцитарные антитела. - М.: Монолит, 2003. - 128 с.

7. Масчан А.А., Румянцев А.Г. Стимуляция продукции тромбоцитов: новый подход к лечению хронической иммунной тромбоцитопенической пурпуры. // Онкогематология. - 2009. - N1. - С.51-56.

8. Основы клинической иммунологии / Перевод с англ. - 5-е изд. - М: ГЭОТАР - Медия, 2008. - 416 с; ил.

9. Руководство по лабораторной гематологии / Б.Сисла; пер. с англ. Под общ. ред. А.И.Воробьева. - М.: Практическая медицина, 2011. - 352 с.: ил.

Способ определения аутоантител к тромбоцитам, включающий в себя выделение суспензии тромбоцитов, окраску моноклональными антителами и оценку на проточном цитофлуориметре, отличающийся тем, что для анализа используют собственные тромбоциты и сыворотку крови больного, причем в качестве маркеров аутоиммунного процесса используют антитела, относящиеся к иммуноглобулинам классов G и М, при этом коэффициент аутосенсибилизации тромбоцитов рассчитывают как отношение количества Anti-Human IgG/IgM-позитивных клеток к числу клеток, фиксирующих CD41: значение коэффициента аутосенсибилизации тромбоцитов более 2% без инкубации с аутосывороткой и более 5% после инкубации с аутосывороткой расценивают как наличие у пациента антитромбоцитарных аутоантител, фиксированных на клетках и/или циркулирующих в плазме крови.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области ветеринарии и касается способа получения антигена из сетарий. .
Изобретение относится к медицине, а именно неврологии, и может быть использовано для прогнозирования течения церебральной гипоксии-ишемии у новорожденных, рожденных от матерей при осложненном течении беременности и родов.

Изобретение относится к медицине, а именно к детской гастроэнтерологии, и может быть использовано для прогноза эффективности интерферонотерапии гепатита С. .
Изобретение относится к медицине, в частности к педиатрии, иммунологии, и может быть использовано для оценки эффективности антибактериальной терапии С. .

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно - к областям диагностической медицинской микробиологии, медицинской биохимии, прикладной иммунохимии и разработки диагностических тест-систем, касается разработки нового способа для высокочувствительного определения белка летального фактора сибирской язвы (LF) в инфицированных образцах биологического происхождения и окружающей среде.

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно - к областям диагностической медицинской микробиологии, медицинской биохимии, прикладной иммунохимии и разработки диагностических тест-систем, касается разработки нового способа для высокочувствительного определения белка летального фактора сибирской язвы (LF) в инфицированных образцах биологического происхождения и окружающей среде.
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу экспресс-диагностики антигенов энтеровирусов в цереброспинальной жидкости. .
Изобретение относится к акушерству и предназначено для прогнозирования преждевременных родов и внутриутробного инфицирования плода. .
Изобретение относится к области медицины, в частности к неврологии, а именно к способу прогнозирования развития нарушений витальных функций при синдроме Гийена-Барре (СГБ).
Изобретение относится к медицине, а именно к способу диагностики недифференцированной дисплазии соединительной ткани у лиц молодого возраста. .

Изобретение относится к медицине, в частности к гематологии, к лабораторным способам выявления степени скрытого повреждения эритроцитов и изучения физико-химического состояния консервированных эритроцитов.
Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано для определения риска развития туберкулеза центральной нервной системы у ВИЧ-инфицированных больных туберкулезом органов дыхания.

Изобретение относится к области медицины, в частности к пульмонологии, для экспресс-диагностики бронхо-легочных заболеваний. .

Изобретение относится к области биохимии. .

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимическим исследованиям в онкологии, и описывает способ прогнозирования возникновения рецидивов рака шейки матки, включающий биохимическое исследование суточной мочи больной, при котором в суточной моче определяют андростерон и этиохоланолон, вычисляют отношение между ними и при величине отношения 0,75 мг/сут и ниже прогнозируют рецидив болезни в первые 2 года, а при величине, превышающей 0,75 мг/сут, - длительный безрецидивный период до 10 лет и более.

Изобретение относится к области гидрометеорологии контроля окружающей среды и может быть использовано для определения концентрации нитратных соединений (взвешенных частиц) в атмосферном воздухе населенных мест.
Изобретение относится к медицине, а именно к общей хирургии, и используется для прогнозирования течения острого деструктивного панкреатита. .

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения наличия повреждений синцитиотрофобласта плаценты у беременных с герпес-вирусной инфекцией.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано для ранней диагностики острого коронарного синдрома без подъема сегмента ST (ОКС без ST).
Изобретение относится к медицине и предназначено для прогнозирования печеночной недостаточности после выполнения обширных резекций печени. .
Наверх