Конъюгаты госсипола и натрийкарбоксиметилцеллюлозы, способы их получения и противовирусные средства на их основе
Владельцы патента RU 2499002:
ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НИАРМЕДИК ПЛЮС" (RU)
Изобретение относится к области фармакологии и медицины и касается конъюгата госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой с молекулярной массой 780-180000 Да при соотношении госсипол: натрийкарбоксиметилцеллюлоза (1-5):(99-95) масс.% и содержанием низкомолекулярной фракции с молекулярной массой от 780 Да до 1500 Да до 20% и высокомолекулярной фракции с молекулярной массой от 1500 Да до 180000 Да до 80%, конъюгата госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой с молекулярной массой от 780 до 1500 Да при соотношении госсипол: натрийкарбоксиметилцеллюлоза (0,35-1,76):(99,65-98,24) масс.%, конъюгата госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой с молекулярной массой от 1500 Да до 180000 Да при соотношении госсипол: натрийкарбоксиметилцеллюлоза (0,65-3,23):(99,35-96,77) масс.% и способов их получения. Кроме того, изобретение относится к противовирусным средствам на основе указанных конъюгатов и фармацевтическим композициям, содержащим конъюгаты. 12 н. и 9 з.п. ф-лы, 5 табл., 3 ил.
Изобретение относится к области фармацевтики и медицины и касается новых конъюгатов госсипола и натрийкарбоксиметилцеллюлозы, способов их получения и противовирусных средств на их основе.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Известно, что низкомолекулярный полифенол - госсипол стимулирует синтез интерферона в организме животных и обладает противовирусной активностью [АС СССР No.721103].
Сам госсипол имеет ряд недостатков - плохая растворимость в воде, высокая токсичность и сравнительно низкая противовирусная активность, и, как следствие, невысокий химико-терапевтический индекс (ХТП).
Поэтому исследования специалистов были направлены на разработку новых производных госсипола, сохраняющих его полезные свойства индуктора интерферона и лишенные недостатков, присущих самому госсиполу.
На основе госсипола и его производных были созданы и внедрены в практику различные препараты противовирусного (линимент госсипола), антигерпетического (мазь мегосина), иммуносупрессивного (таблетки батридена), антихламидийного (таблетки гозалидона) и интеферониндуцирующего действия.
В качестве одного из направлений модификации госсипола было выбрано создание его коньюгатов с полимерной матрицей. Данный выбор был обусловлен тем, что свободный госсипол токсичен, а госсипол в связанной с белками форме, образующейся в процессе технологической обработки семян хлопчатника, для организма млекопитающих нетоксичен.
В фармацевтической практике остается потребность в разработке препаратов на основе госсипола, которые при сохранении и усилении полезных свойств госсипола не обладали бы токсичностью и были бы удобны в применении для различных терапевтических и профилактических целей.
Известно производное госсипола и натрийкарбоксиметицеллюлозы, обладающее интерферониндуцирующим и противовирусным действием, представляющее собой гетероцепной полимер с характеристической вязкостью 0,06-0,1, полученный окислением натрийкарбоксиметицеллюлозы с последующим взаимодействием с госсиполом (RU 2002755). Защитное действие препарата подтверждено в исследованиях на мышах, зараженных инфекциями вируса энцефаломиокардита, гриппа и гепатита.
Известно также производное госсипола, представляющее собой натриевую соль сополимера производного госсипола (госсиполята натрийкарбоксиметилцеллюлозы) и карбоксиметилцеллюлозы с молекулярной массой 120000-130000 Да и степенью замещения 0,35-0,80, обладающее противовирусным действием в отношении вирусов ОРВИ, гриппа и герпеса (RU 2270708).
Задачей изобретения является расширение ассортимента противовирусных средств, обладающих высоким уровнем терапевтической эффективности.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к конъюгату госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой, обладающему противовирусным действием, охарактеризованному молекулярной массой 780-180000 Да при соотношении госсипол:натрийкарбоксиметилцеллюлоза (1-5):(99-85)% масс. и содержащему не более 20% масс. низкомолекулярной фракции с молекулярной массой от 780 до 1500 Да и не более 80% масс. высокомолекулярной фракции с молекулярной массой от 1500 до 180000 Да.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой, обладающему противовирусным действием и охарактеризованному молекулярной массой от 780 до 1500Да при соотношении госсипол:натрийкарбоксиметилцеллюлоза (0,35-1,76):(99,65-98,24)% масс., а также к конъюгату госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой, обладающему противовирусным действием и охарактеризованному молекулярной массой от 1500 Да до 180000 Да при соотношении госсипол: натрийкарбоксиметилцеллюлоза (0,65-3,23):(99,35-96,77)% масс.
Конъюгат госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой, характеризующийся молекулярной массой 780-180000Да при соотношении госсипол:натрийкарбоксиметилцеллюлоза (1-5):(99-85)% масс. и содержащий не более 20% масс. низкомолекулярной фракции с молекулярной массой от 780 до 1500 Да и не более 80% масс. высокомолекулярной фракции с молекулярной массой от 1500 до 180000 Да, может быть получен способом, включающим взаимодействие водного раствора натрийкарбоксиметилцеллюлозы со степенью замещения (0,35-0,8) с водным раствором иодной кислоты при массовом соотношении натрийкарбоксиметилцеллюлозы и иодной кислоты (25-35):(0,5-5) с последующими стадиями осаждения диальдегида натрийкарбоксиметилцеллюлозы путем обработки реакционной смеси смесью подкисленного водного раствора иодистого натрия и ацетона, выделения и обработки полученного диальдегида натрийкарбоксиметилцеллюлозы госсиполоуксусной кислотой в смеси водного раствора щелочи и ацетона с получением целевого продукта. При этом на первой стадии в результате реакции окисления происходит раскрытие глюкопиранозного цикла NaКМЦ с образованием диальдегида КМЦ. Поскольку легче окисляются незамещенные циклы NaКМЦ, то количество образовавшихся диальдегидных групп в них будет больше, чем в замещенных. Поэтому на второй стадии присоединения госсипола к диальдегиду КМЦ незамещенные циклы будут содержать больше госсипола, чем замещенные.
Конъюгат госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой, охарактеризованный молекулярной массой от 780 до 1500Да при соотношении госсипол:натрийкарбоксиметилцеллюлоза (0,35-1,76): (99,65-98,24)% масс., может быть получен способом, включающим разделение описанного выше конъюгата госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой молекулярной массой 780-180000 Да методом эксклюзионной хроматографии и выделение фракции с молекулярной массой от 780 Да до 1500 Да.
Конъюгат госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой, охарактеризованный молекулярной массой от 1500 Да до 180000 Да при соотношении госсипол:натрийкарбоксиметилцеллюлоза (0,65-3,23):(99,35-96,77)% масс., может быть получен способом, включающим разделение описанного выше конъюгата госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой молекулярной массой 780-180000 Да методом эксклюзионной хроматографии и выделение фракции с молекулярной массой от 1500 Да до 180000 Да соответственно.
Все описанные выше способы являются объектами настоящего изобретения.
Кроме того, еще одним объектом настоящего изобретения является противовирусное средство, представляющее собой конъюгат госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой с молекулярной массой 780-180000 Да при соотношении госсипол: натрийкарбоксиметилцеллюлоза (1-5):(99-85)% масс., содержащий не более 20% масс. низкомолекулярной фракции с молекулярной массой от 780 Да до 1500 Да и не более 80% масс. высокомолекулярной фракции с молекулярной массой от 1500 Да до 180000 Да.
Еще одним другим объектом настоящего изобретения является противовирусное средство, представляющее собой конъюгат госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой с молекулярной массой от 780 до 1500 Да при соотношении госсипол: натрийкарбоксиметилцеллюлоза (0,35-1,76):(99,65-98,24)% масс.
Еще одним другим объектом настоящего изобретения является противовирусное средство, представляющее собой конъюгат госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой с молекулярной массой от 1500 Да до 180000 Да при соотношении госсипол: натрийкарбоксиметилцеллюлоза (0,65-3,23):(99,35-96,77)% масс.
Предложенные в настоящем изобретении противовирусные средства предназначены для применения в терапии больных вирусными заболеваниями, в том числе, гриппом или гепатитом С. Так, в частности, противовирусные средства согласно настоящему изобретению можно применять в комплексной терапии больных гепатитом С и гриппом. Наиболее предпочтительно применять противовирусные средства на основе конъюгатов, которые получены способами согласно настоящему изобретению.
Другим объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, обладающая противовирусным действием, включающая в качестве активного компонента терапевтически эффективное количество конъюгата госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой с молекулярной массой 780-180000 Да при соотношении госсипол: натрийкарбоксиметилцеллюлоза (1-5): (99-85)% масс., содержащего не более 20% масс. низкомолекулярной фракции с молекулярной массой от 780 Да до 1500 Да и не более 80% масс. высокомолекулярной фракции с молекулярной массой от 1500 Да до 180000 Да, и фармацевтически приемлемые добавки.
Еще одним другим объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, обладающая противовирусным действием, включающая в качестве активного компонента терапевтически эффективное количество конъюгата госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой с молекулярной массой от 780 до 1500 Да при соотношении госсипол:натрийкарбоксиметилцеллюлоза (0,35-1,76):(99,65-98,24)% масс.
Еще одним другим объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, обладающая противовирусным действием, включающая в качестве активного компонента терапевтически эффективное количество конъюгата госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой с молекулярной массой от 1500 Да до 180000 Да при соотношении госсипол: натрийкарбоксиметилцеллюлоза (0,65-3,23):(99,35-96,77) масс.%.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению предназначены для применения в терапии больных вирусными заболеваниями, в частности, гриппом или гепатитом С.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы настоящего изобретения разработали способ, который обеспечивает получение конъюгата госсипола и натрийкарбоксиметилцеллюлозы с широким диапазоном молекулярных масс, что неожиданно привело к обеспечению высокого уровня противовирусной активности конъюгата, в особенности его низмолекулярной фракции.
Получение предложенного в настоящем изобретении конъюгата госсипола и натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (ГКМЦ), характеризующегося молекулярной массой 780-180000 Да при соотношении госсипол:натрийкарбоксиметилцеллюлоза (1-5):(99-85)% масс. и содержащему не более 20% масс. низкомолекулярной фракции с молекулярной массой от 780 до 1500 Да и не более 80% масс. высокомолекулярной фракции с молекулярной массой от 1500 до 180000 Да, осуществляют следующим образом.
Водный раствор иодной кислоты (предпочтительно с концентрацией 1-25% масс.) добавляют к сильно разбавленному водному раствору натрийкарбоксиметилцеллюлозы (NaКМЦ), предпочтительно с концентрацией 7-10% масс., в массовом соотношении (0,5-5):(25-35) и проводят взаимодействие при перемешивании, предпочтительно в течение 3-4 часов. Полученную реакционную смесь обрабатывают смесью подкисленного водного раствора иодистого натрия и ацетона с последующим осаждением полученного диальдегида натрийкарбоксиметилцеллюлозы (ДАКМЦ). В этом случае предпочтительно использовать смесь (60-67)%-ного раствора NaI, (32-38)%-ного раствора HCl и ацетона в массовом соотношении (2:1:26). Полученный осадок ДАКМЦ отфильтровывают и многократно промывают водно-ацетоновой смесью, взятой в массовом соотношении от 1:4 до 3:7 и, в заключении, чистым ацетоном. Затем ДАКМЦ растворяют в водно-щелочном растворе и добавляют приготовленный заранее раствор госсиполуксусной кислоты (ГУК). Для приготовления раствора ГУК предпочтительно использовать смесь (30-36)%-ного водного раствора NaOH, ацетона и воды, взятые в массовом соотношении (1:100:4). Реакцию можно проводить при комнатной температуре, но более предпочтительно осуществлять взаимодействие при нагревании до 25-38°С, в течение 5-30 мин. Затем, добавляют дополнительную порцию ацетона, перемешивают еще 1-2 ч. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и доводят рН до значения 12. Полученный продукт промывают большим количеством ацетона, отфильтровывают и высушивают.
Авторы настоящего изобретения полагают, что предложенные в настоящем изобретении условия обработки водного раствора натрийкарбоксиметилцеллюлозы водным раствором иодной кислоты (массовое соотношение натрийкарбоксиметилцеллюлозы и иодной кислоты (25-35):(0,5-5)) в сочетании с проведением стадии осаждения и выделения диальдегида натрийкарбоксиметилцеллюлозы и особыми условиями его взаимодействия с госсиполом (обработка госсипол уксусной кислотой в смеси водного раствора щелочи и ацетона) позволяют получить конъюгат госсипола и натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы с широким диапазоном молекулярных масс от 780-180000 Да что, в свою очередь, как это будет показано ниже, обеспечивает высокую терапевтическую эффективность целевого продукта (для сравнения продукт, описанный в RU 2270708, имеет существенно более узкий диапазон молекулярных масс 120000-130000 Да). Кроме того, в отличие от известного способа получения натриевой соли производного госсипола и карбоксиметилцеллюлозы (RU 2270708) предложенный в настоящем изобретении способ получения ГКМЦ позволяет избежать использования в качестве растворителя изопропилового спирта, примеси которого являются трудно удаляемыми и загрязняют целевой продукт.
Получение предложенного в настоящем изобретении конъюгата госсипола и натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (конъюгат НМ), охарактеризованного молекулярной массой от 780 до 1500 Да при соотношении госсипол:натрийкарбоксиметилцеллюлоза (0,35-1,76): (99,65-98,24)% масс., проводят путем разделения ГКМЦ методом эксклюзионной хроматографии и выделения фракции с молекулярной массой от 780 Да до 1500 Да.
Получение предложенного в настоящем изобретении конъюгата госсипола и натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (конъюгат ВМ), охарактеризованного молекулярной массой от 1500 Да до 180000 Да при соотношении госсипол:натрийкарбоксиметилцеллюлоза (0,65-3,23):(99,35-96,77)% масс., проводят путем разделения ГКМЦ методом эксклюзионной хроматографии и выделения фракции с молекулярной массой от 1500 Да до 180000 Да.
Предложенные в настоящем изобретении фармацевтические композиции могут быть получены с использованием стандартных методик объединения активного компонента и фармацевтически приемлемых добавок и представлены в виде различных лекарственных форм в зависимости от выбранного способа их применения. Для перорального приема фармацевтическую композицию можно использовать в виде таблеток, капсул или суспензий. Кроме того, для ректального приема можно использовать суппозитории. Количество активного компонента в фармацевтической композиции может варьировать в широком диапазоне в зависимости от различных факторов, хорошо известных специалистам в области фармацевтики. В качестве фармацевтически приемлемых добавок можно использовать обычно применяемые для вышеуказанных лекарственных форм вещества. Например, в таблетках в качестве наполнителя можно использовать крахмал, например, картофельный крахмал, стеарат кальция или магния, сахар молочный и другие фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению предназначены для применения в терапии больных вирусными заболеваниями, в частности, гриппом или гепатитом С. Схема лечения (режим и доза введения препарата) выбирается специалистом, исходя из тяжести заболевания, состояния и возраста пациента. Например, для лечения гриппа назначают по 2 таблетки три раза в день (9 час., 14 час. и 20 час.) в течение первых 2-х дней, затем по 1 таблетке 3 раза в день в течение последующих 2-х дней. Суммарная доза препарата на 1 пациента за 4 дня составляет 18 таблеток.
Например, для лечения гепатита С назначают по 2 таблетки три раза в день (9 час., 14 час. и 20 час.) в течение 5 дней. Суммарная доза препарата на 1 пациента составляет 30 таблеток.
В предпочтительно варианте предложенная фармацевтическая композиция может иметь следующий состав, в % масс.:
| Коньюгат ГКМЦ | - 10,00-25,00 |
| Картофельный крахмал | - 9,00-21,00 |
| Кальция стеарат | - 0,60-1,35 |
| Лудипресс (лактоза моногидрат, повидон, кросповидон) | - до 100 |
Далее представлены примеры получения предложенных конъюгатов госсипола и натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, физико-химические характеристики полученных продуктов и результаты изучения их биологической активности.
ПРИМЕРЫ ПОЛУЧЕНИЯ ГКМЦ
Образцы ГКМЦ получали следующим образом. Водный раствор иодной кислоты (1-25% масс.) добавляли к сильно разбавленному водному раствору NaКМЦ (7-10% масс.) в массовом соотношении (0,5-5):(25-35) при перемешивании в течение 3-4 ч. В полученную реакционную смесь добавляли смесь водного раствора NaI (концентрация 64,9% масс.), 36%-ного водного раствора HCl и ацетона в массовом соотношении (2:1:26) и проводили осаждение полученного диальдегида натрийкарбоксиметилцеллюлозы (ДАКМЦ). Осадок отфильтровывали и многократно промывали водно-ацетоновой смесью взятой в массовом соотношении от 1:4 до 3:7 и, в заключении, чистым ацетоном. Полученный ДАКМЦ растворяли в водно-щелочном растворе и добавляли приготовленный заранее раствор госсиполуксусной кислоты (ГУК) (34%-ный водный раствор NaOH, ацетон и вода, взятые в массовом соотношении 1:100:4). Реакцию проводили при температуре 25-38°С в течение 5-30 мин. Затем добавляли дополнительную порцию ацетона и перемешивали в течение 1-2 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и доводили рН до значения 12. Полученный продукт промывали большим количеством ацетона, отфильтровывали и высушивали. Получали порошок светло-коричневого цвета, представляющий собой конъюгат госсипола и натрийкарбоксиметилцеллюлозы с молекулярной массой 780-180000 Да при соотношении госсипол:натрийкарбоксиметилцеллюлоза (1-5): (99-85) масс.%, содержащий не более 20% низкомолекулярной фракции с молекулярной массой от 780 Да до 1500 Да и не более 80% высокомолекулярной фракции с молекулярной массой от 1500 Да до 180000 Да. Выход продукта составил 60% в пересчете на исходную NaКМЦ. Физико-химические показатели промежуточного (ДАКМЦ) и целевого (ГКМЦ) продуктов приведены в таблицах 1 и 2 соответственно.
| Таблица 1 Физико-химические показатели ДАКМЦ |
||||
| ДАКМЦ | Физико-химические показатели | |||
| Серия | рН, ммоль/г | УФ спектр (дифференциальный изоконцентрационный спектр), нм | Массовая доля альдегидных групп, мг/г | Приведенная вязкость, мг/г |
| 1 | 3,4 | max - 289 min - 235 |
10,5 | 28,7 |
| 2 | 3,5 | max - 291 min - 235 |
10,4 | 26,9 |
| 3 | 3,3 | max - 291 min - 234 |
9,5 | 29,3 |
| Таблица 2 Физико-химические показатели ГКМЦ |
|||
| ГКМЦ | Физико-химические показатели | ||
| серия | рН, ммоль/г | УФ спектр, (дифференциальный изоконцентрационный спектр), нм | Растворимость в воде (0,1г/мл в течение 10 мин) |
| 1 | 10,60 | max - 244, 285, 376 min - 226, 267, 318 |
Полностью растворим |
| 2 | 10,59 | max - 244, 285, 375 min - 226, 268, 318 |
Полностью растворим |
| 3 | 10,62 | max - 243, 284, 376 min - 227, 267, 319 |
Полностью растворим |
Сравнение представленных в таблицах 1 и 2 физико-химических показателей промежуточного продукта ДАКМЦ и целевого продукта ГКМЦ показывает практически полное конъюгирование ароматической (госсипол) и полимерной (натрийкарбоксиметилцеллюлоза) частей. Об этом свидетельствует изменение значений max и min поглощения в дифференциальных изоконцентрационных УФ спектрах, характерных для ДАКМЦ и ГКМЦ снятых на спектрофотомерте в кювете толщиной слоя в 10 мм в области от 220 до 700 нм, а также полная растворимость ГКМЦ в воде, в то время как ДАКМЦ в воде практически не растворим.
С помощью метода гельпроникающей хроматографии (ГПХ) было установлено, что молекулярная масса (ММ) ГКМЦ варьирует в пределах 780-180000 Да. Анализ ММ ГКМЦ проводили на хроматографе фирмы Waters, снабженном дифференциальным рефрактометрическим детектором “Waters 2414” и спектрофотометрическим детектором с диодной матрицей “PDA 996”. Использовали набор из двух колонок “Ultrahydrogel 250” и “Ultrahydrogel 1000”, в качестве элюента - водный 0,25 N аммиачно-ацетатный буферный раствор (pH~9), скорость элюирования 0,6 мл/мин. Регистрацию спектров проводили в интервале длин волн от 220 нм (нижний предел прозрачности буферного раствора) до 600 нм. Результаты приведены на Фиг. 1
На Фиг. 2 приведен график зависимости содержания госсипола ((D300/Iref)103) от молекулярной массы ГКМЦ (LgM) для пяти полученных образцов. По соотношению интенсивности поглощения в УФ-области спектра и интенсивности сигнала рефрактометрического детектора установлено, что звенья, содержащие госсипол в образцах ГКМЦ распределены по цепи неравномерно, а именно, концентрация этих звеньев возрастает при уменьшении молекулярной массы.
Образец ГКМЦ условно разделяли на фракции по молекулярным массам, как это показано на Фиг.3 и для каждой фракции определяли относительное содержание госсипола. Результаты представлены в Таблице 3.
| Таблица 3 Распределение госсипола во фракциях ГКМЦ с различной молекулярной массой |
|||
| Интервал масс. долей фракций, % | Интервал молеку-лярных масс, Да | Доля госсипола (% от суммы) | Препаративно выделенные фракции |
| 0-10 | 180000-53500 | 7,5 | ВМ |
| 10-30 | 53500-28900 | 14,9 | |
| 30-50 | 28900-16900 | 15,1 | |
| 50-70 | 16900-8450 | 16,0 | |
| 70-90 | 8450-1270 | 19,0 | |
| НМ | |||
| 90-100 | 1270-780 | 27,5 |
Из Таблицы 3 видно, что почти половина звеньев, содержащих госсипол сосредоточена в 30% от всего образца (в низкомолекулярной части с ММ<9000), причем, почти треть - в самой низкомолекулярной фракции (ММ~1000 и меньше), доля которой составляет всего 10%.
ПРИМЕРЫ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТОВ НМ и ВМ
Препаративное разделение ГКМЦ на низкомолекулярную (от 780 Да до 1500 Да) и высокомолекулярную (от 1500 Да до 180000 Да) фракции проводили методом эксклюзионной хроматографии, используя в качестве носителя Bio-Gel P-2 (предел эксклюзии 1,6 кДа). Колонку 1,5×35 см с носителем уравновешивали водой MQ. Для калибровки колонки использовали цитохром С (свободный объем колонки) и шестиводный хлорид хрома (полный объем колонки). Навеску ГКМЦ 150-170 мг растворяли в 0,6 мл воды MQ и центрифугировали при 13400 об/мин в течение 5 мин. Полученный раствор ГКМЦ наносили на колонку и проводили изократическую элюцию водой MQ со скоростью 1 мл/мин, собирая фракции по 2 мл. Выход фракций из колонки оценивали визуально (желто-коричневое окрашивание) и по оптической плотности фракций при 254 нм. Фракцию, выходящую в начале свободного объема (высокомолекулярную), представляющую собой конъюгат госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой с молекулярной массой от 1500 Да до 180000 Да при соотношении госсипол: натрийкарбоксиметилцеллюлоза (0,65-3,23):(99,35-96,77)% масс. (конъюгат ВМ), и фракцию, выходящую в конце полного объема (низкомолекулярную), представляющую собой конъюгат госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой с молекулярной массой от 780 до 1500 Да при соотношении госсипол:натрийкарбоксиметилцеллюлоза (0,35-1,76):(99,65-98,24)% масс. (конъюгат НМ), собирали и использовали для дальнейшего тестирования биологической активности.
ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КОНЪЮГАТОВ
Противовирусную активность ГКМЦ и его фракций (конъюгаты НМ и ВМ) в отношении вируса гепатита С изучали на экспериментальной модели инфекции, вызванной вирусом гепатита С. Использовали высоко-патогенный штамм вируса гепатита С (ВГС), выделенный из крови ВГС инфицированного пациента, страдающего гепатоклеточной карциномой, в сыворотке крови которого были обнаружены антитела к ВГС и РНК ВГС. Исследования конъюгатов согласно настоящему изобретению проводили в культурах клеток почки зеленой мартышки (Vero), выращенных в виде однодневного монослоя в 48-луночных панелях. Культуры клеток Vero обрабатывали различными концентрациями конъюгатов сразу после адсорбции вируса.
Результаты экспериментов учитывали способность конъюгатов защищать инфицированные клетки от цитопатогенного действия ВГС; в этом случае результаты учитывали на 6-й, 7-й дни, когда в контрольных, инфицированных ВГС без добавления конъюгата культурах развивались максимальные цитопатические изменения. В этом случае подсчитывали % жизнеспособных клеток в монослое, обработанном и необработанном конъюгатом. Полученные результаты представлены в таблице 4.
| Таблица 4 Способность ГКМЦ и его фракций (конъюгаты НМ и ВМ) защищать культуры клеток Vero от цитопатического действия вируса гепатита С |
|||||||||
| Концентрация препарата, (мг) | Доза вируса, ТЦД 50 | ||||||||
| 100,0 | 10,0 | 1,0 | |||||||
| % погибших культур клеток Vero в монослое | |||||||||
| ГКМЦ | ВМ* | НМ** | ГКМЦ | ВМ | НМ | ГКМЦ | ВМ | НМ | |
| 0,25 | 100 | 100 | 0 | 70 | 0 | 0 | 25 | 0 | 0 |
| 0,12 | 100 | 100 | 0 | 100 | 100 | 0 | 40 | 75 | 0 |
| Контроль (без препарата) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 50 | 75 | 25 |
| ВМ* - фракция с ММ от 1500 Да до 180000 Да, НМ**- фракция с ММ от 780 Да до 1500 Да |
Таким образом, изучение противовирусного действия фракции с ММ от 780 Да до 1500 Да (конъюгат НМ) показало, что при использовании конъюгата в дозе 0,25 и 0,12 мг приводит к 100%-ной защите клеток Vero от литического действия вируса гепатита С. Защита клеток от вируса гепатита С фракцией с ММ от 1500 Да до 180000 Да (конъюгат ВМ) проявляется значительно хуже и наблюдается зависимость от используемой дозы конъюгата.
Исследование противовирусной активности препарата ГКМЦ и его фракций (конъюгаты НМ и ВМ) в отношении гриппозной инфекции А/H5N1 также проводили на модели клеточной культуры Vero. В предварительных исследованиях было показано, что максимальная активность изучаемых конъюгатов наблюдается при введении их в культуру за 24 часа до заражения клеток. Учет результатов проводили на пятый день после инфицирования клеток. Результаты представлены в таблице 5.
| Таблица 5 Влияние ГКМЦ и его фракций (конъюгаты НМ и ВМ) на жизнеспособность клеток Vero, инфицированных вирусом гриппа А/H5N1 |
|||||||
| Доза вируса, ТЦД 50 = 10,0 | |||||||
| Концентрация препаратов (мг/мл) | 1,0 | 0,5 | 0,25 | 0,12 | 0,06 | 0,03 | Контроль (без препарата) |
| % выживших клеток | |||||||
| ГКМЦ | 65 | 65 | 5 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| НМ* | 80 | 80 | 80 | 80 | 30 | 0 | 0 |
| ВМ* | 45 | 30 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| ВМ* - фракция с ММ от 1500Да до 180000 Да, НМ**- фракция с ММ от 780 Да до 1500 Да |
Как видно из приведенных данных, НМ защищает клетки лучше, чем ГКМЦ, в то время как ВМ обладает наименее выраженной активностью.
Таким образом, эффективное противовирусное действие ГКМЦ обеспечивается за счет расширения диапазона ММ продукта, что, в свою очередь, позволяет получить и выделить низкомолекулярную фракцию с высоким содержанием госсипола в составе коньюгата, которая обладает очень высокой противовирусной активностью.
1. Конъюгат госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой, обладающий противовирусным действием, характеризующийся молекулярной массой 780-180000 Да при соотношении госсипол: натрийкарбоксиметилцеллюлоза (1-5):(99-95) мас.% и содержащий не более 20% низкомолекулярной фракции с молекулярной массой от 780 Да до 1500 Да и не более 80% высокомолекулярной фракции с молекулярной массой от 1500 Да до 180000 Да.
2. Конъюгат госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой, обладающий противовирусным действием и характеризующийся молекулярной массой от 780 до 1500 Да при соотношении госсипол: натрийкарбоксиметилцеллюлоза (0,35-1,76):(99,65-98,24) мас.%.
3. Конъюгат госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой, обладающий противовирусным действием и характеризующийся молекулярной массой от 1500 Да до 180000 Да при соотношении госсипол: натрийкарбоксиметилцеллюлоза (0,65-3,23):(99,35-96,77) мас.%.
4. Способ получения конъюгата госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой по п.1, включающий взаимодействие водного раствора натрийкарбоксиметилцеллюлозы с водным раствором йодной кислоты при массовом соотношении натрийкарбоксиметилцеллюлозы и иодной кислоты (25-35):(0,5-5) с последующими стадиями осаждения диальдегида натрийкарбоксиметилцеллюлозы путем обработки реакционной смеси смесью подкисленного водного раствора иодистого натрия и ацетона, выделения и обработки полученного диальдегида натрийкарбоксиметилцеллюлозы госсиполоуксусной кислотой в смеси водного раствора щелочи и ацетона с получением целевого продукта.
5. Способ получения конъюгата госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой по п.2, включающий разделение конъюгата госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой, охарактеризованного в п.1 или полученного способом по п.4, методом эксклюзионной хроматографии и выделение фракции с молекулярной массой от 780 Да до 1500 Да.
6. Способ получения конъюгата госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой по п.3, включающий разделение конъюгата госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой, охарактеризованного в п.1 или полученного способом по п.4, методом эксклюзионной хроматографии и выделение фракции с молекулярной массой от 1500 Да до 180000 Да соответственно.
7. Противовирусное средство, представляющее собой конъюгат госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой с молекулярной массой 780-180000 Да при соотношении госсипол: натрийкарбоксиметилцеллюлоза (1-5):(99-95) мас.%, содержащий до 20 мас.% низкомолекулярной фракции с молекулярной массой от 780 Да до 1500 Да и до 80 мас.% высокомолекулярной фракции с молекулярной массой от 1500 Да до 180000 Да.
8. Противовирусное средство по п.7, предназначенное для лечения гриппа.
9. Противовирусное средство по п.7, предназначенное для лечения гепатита С.
10. Противовирусное средство по п.7, представляющее собой конъюгат госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой, полученный способом по п.4.
11. Противовирусное средство, представляющее собой конъюгат госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой с молекулярной массой от 780 до 1500 Да при соотношении госсипол: натрийкарбоксиметилцеллюлоза (0,35-1,76):(99,65-98,24) мас.%.
12. Противовирусное средство по п.11, предназначенное для лечения гриппа.
13. Противовирусное средство по п.11, предназначенное для лечения гепатита С.
14. Противовирусное средство по п.11, представляющее собой конъюгат госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой, полученный способом по п.5.
15. Противовирусное средство, представляющее собой конъюгат госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой с молекулярной массой от 1500 Да до 180000 Да при соотношении госсипол: натрийкарбоксиметилцеллюлоза (0,65-3,23):(99,35-96,77) мас.%.
16. Противовирусное средство по п.15, предназначенное для лечения гриппа.
17. Противовирусное средство по п.15, предназначенное для лечения гепатита С.
18. Противовирусное средство по п.15, представляющее собой конъюгат госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой, полученный способом по п.6.
19. Фармацевтическая композиция, обладающая противовирусным действием, содержащая в качестве активного компонента терапевтически эффективное количество конъюгата по п.1 и фармацевтически приемлемые добавки.
20. Фармацевтическая композиция, обладающая противовирусным действием, содержащая в качестве активного компонента терапевтически эффективное количество конъюгата по п.2 и фармацевтически приемлемые добавки.
21. Фармацевтическая композиция, обладающая противовирусным действием, содержащая в качестве активного компонента терапевтически эффективное количество конъюгата по п.3 и фармацевтически приемлемые добавки.
