Способ оценки цитотоксической активности лимфоцитов натуральных киллеров



 


Владельцы патента RU 2514019:

Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение "Научный центр психического здоровья" Российской Академии Медицинских Наук (RU)

Изобретение относится медицине, а именно к клинической иммунологии, и может быть использовано для оценки цитотоксической активности лимфоцитов натуральных киллеров (НК) по клеткам-мишеням К-562, оставшимся недеградированными после контакта с НК лимфоцитами. Для этого выделяют НК лимфоциты в составе мононуклеарных клеток из периферической крови пациентов. Проводят постановку цитотоксического теста, основанного на инкубации НК лимфоцитов и клеток-мишеней К-562. При этом клетки-мишени К-562 не метят 3Н-уридином. Оценивают цитотоксическую активность НК лимфоцитов с помощью подсчета количества оставшихся недеградированными клеток-мишеней на автоматическом счетчике и анализаторе клеток, настроенном на выявление клеток диаметром от 15 до 40 мкм. После чего рассчитывают индекс цитотоксичности по формуле

. Изобретение обеспечивает безопасность для здоровья исследователя, а также укорочение времени исследования. 3 табл., 12 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, в частности к клинической иммунологии, и касается способа оценки цитотоксической активности (ЦА) лимфоцитов натуральных киллеров, (НК)-лимфоцитов, в периферической крови больных и здоровых, основанного на подсчете числа недеградированных клеток-мишеней К-562 после их контакта с НК-лимфоцитами на автоматическом счетчике и анализаторе клеток. Изобретение может быть использовано в медицинской иммунодиагностике при комплексном обследовании больных с целью выявления у них изменений цитотоксической активности лимфоцитов натуральных киллеров; его применение также возможно в лечебной практике с целью коррекции выявленных изменений этого звена иммунитета у больных с психопатологической симптоматикой и при различных соматических заболеваниях, в первую очередь злокачественных новообразованиях и заболеваниях инфекционной природы.

Известен колориметрический способ оценки ЦА НК-лимфоцитов в периферической крови, основанный на окрашивании мертвых клеток-мишеней трипановым синим или аламаром синим в результате повышения проницаемости их мембраны после контакта в цитотоксическом тесте с НК-лимфоцитами (Анфалова Т.В., Казанский Д.Б., Хромых Л.М. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2003; (9):3 56-360). Этот способ является неточным, так как при подсчете окрашенных клеток могут учитываться вместе с клетками-мишенями и погибшие клетки крови.

Известен также радиоактивный способ оценки, который основан на измерении количества радиоактивной Н-РНК в клетках-мишенях, оставшихся недеградированными после контакта в цитотоксическом тесте с НК-лимфоцитами. В качестве клеток-мишеней, адаптированных к НК, используют клетки миелолейкоза человека линии К-562, которые перед постановкой цитотоксического теста обрабатывают 3H-уридином (Рыкова М.П., Спиранде И.В., Зедгенидзе М.С. и др. Иммунология. 1981; 3: 88-90, прототип). Сущность этого способа заключается в том, что при постановке цитотоксического теста к мононуклеарным клеткам, выделенным из периферический крови больных и здоровых и состоящим из моноцитов и пула лимфоцитов, 10-15% от которого составляют НК-лимфоциты, добавляют клетки-мишени К-562, которые предварительно метят в течение часа радиоактивной меткой по 3Н-уридиному и еще в течение часа трижды отмывают от невключившейся радиоактивной метки большими объемами среды 199. После инкубации в течение 16-18 часов взвесь клеток осаждают с помощью вакуумного насоса и харвестера, предназначенного для сбора клеток методом фильтрации на фильтрах, на специальные стекловолокнистые фильтры. Фильтры высушивают в течение 6-18 часов, затем переносят во флаконы со сцинтилляционной жидкостью и оставляют еще на 6-18 часов для выхода β-частиц в жидкость. После этого подсчитывают уровень радиоактивности проб на β-счетчике.

Недостатком этого способа является длительность и сложность его проведения, а также опасность для здоровья исполнителя. А именно, оценка ЦА НК является многоэтапной, занимает по продолжительности 2-3 дня и требует применения большого количества дорогостоящих приборов и специфических материалов, таких как харвестр, вакуумный насос, β-счетчик, сцинтилляционные флаконы, стекловолокнистые фильтры, а также связана с использованием вредных для организма веществ, таких как сцинтилляционная жидкость и радиоактивная метка, для работы с которыми необходимо использование вытяжного шкафа. Кроме того, для работы с радиоактивностью необходимо разрешение санэпидстанции на оборудование специального радиоактивного блока, состоящего из отдельного помещения с вытяжным шкафом, холодильником и сейфом для хранения радиоизотопов.

Целью изобретения является упрощение способа оценки ЦА НК-лимфоцитов, а именно, уменьшение времени оценки, его стоимости и трудоемкости, а также возможность сделать его безопасным для исследователя, так как в этом случае исключается применение сцинтилляционной жидкости и радиоактивных компонентов. Отсутствие радиоактивной метки исключает также необходимость получения разрешения санэпидстанции для работы с радиоактивными веществами.

Это достигается тем, что, во-первых, в отличие от известного способа в предлагаемом способе в цитотоксическом тесте к мононуклеарным клеткам добавляют клетки-мишени К-562, не обработанные 3H-уридином и РНКазой. Во-вторых, для оценки ЦА НК-лимфоцитов используется вместо нескольких приборов только один прибор - автоматический счетчик и анализатор клеток, настроенный на выявление клеток, диаметр которых находится в диапазоне от 15 до 40 мкм. Это соответствует диаметру клеток-мишеней К-562, который превышает диаметр самых крупных клеток крови - моноцитов, диаметр которых не достигает 15 мкм. С помощью этого прибора оценивают уровень ЦА НК-лимфоцитов по числу клеток-мишеней К-562, недеградированных после контакта с НК-лимфоцитами. В-третьих, этап оценки цитотоксической активности НК занимает всего 10-15 минут вместо 2-3 дней при оценке известным способом. В-четвертых, предлагаемый способ оценки цитотоксической активности НК-лимфоцитов полностью исключает применение опасной для здоровья исследователя радиоактивной метки, в связи с чем исчезает необходимость оборудования специального радиоактивного блока.

Способ оценки цитотоксической активности НК-лимфоцитов по прототипу заключается в следующем.

1) Для постановки цитотоксического теста в качестве клеток-мишеней для НК лимфоцитов используют клетки миелолейкоза человека линии К-562 (Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского, РАМН), поддерживаемые ин витро в среде RPMI-1640 (ФГУП «ПИПВЭ имени М.П. Чумакова РАМН), с добавлением 10% фетальной сыворотки (Defined Fetal Bovine Serum фирмы Hyclone, USA) и 10% глютамина.

2) Перед постановкой цитотоксического теста 3 мл взвеси клеток-мишеней К-562 в концентрации 1-4×106 в 1 мл среды 199 помещают в центрифужную пробирку, добавляют 0,3 мл рабочего раствора 3Н-уридина (3 мкКи/мл, удельная радиоактивность 24 Ки/мМ, Институт молекулярной генетики РАН). Клетки помещают в термостат при 37°С на один час. По истечении этого времени клетки трижды отмывают от не включившейся в них радиоактивной метки большими объемами среды 199 с помощью центрифугирования при 1100-1200 об/мин и 4°С в течение 10 мин; затем разводят до концентрации 105/мл. По времени эта процедура занимает еще один час.

3) Для деградации не включившегося в клетки-мишени К-562 3H-уридина к ним добавляют панкреатическую рибонуклеазу А (РНКазу, РЕАХИМ НПО «Биолар), которая разрезает 3'-конец неспаренных цитидиловых и уридиловых нуклеотидов, катализируя их деградацию^

4) Мононуклеарные клетки, в состав которых входят моноциты и общий пул лимфоцитов, 10-15% от которого составляют НК-лимфоциты, выделяют из периферической крови больных в градиенте плотности фиколл-верографина с уд. пл. 1,077, разводят их средой 199 (ФГУП «ПИПВЭ имени М.П. Чумакова РАМН) до концентрации 4×106/мл.

5) Постановку цитотоксического теста осуществляют в специальных 96-луночных круглодонных полистироловых планшетах, у которых объем лунки составляет 0,25 мл (завод «Медполимер», Санкт-Петербург); в лунки с опытными пробами вносят 0,05 мл среды 199, 0,05 мл полной среды 199, обогащенной 10% эмбриональной телячьей сывороткой и 10% раствором глютамина, затем добавляют в соотношении 20:1 0,05 мл взвеси мононуклеарных клеток и 0,1 мл обработанных 3H-уридином и РНКазой клеток-мишеней К-562. В лунки с контрольными пробами вместо мононуклеарных клеток добавляют 0,05 мл среды 199. Каждую опытную и контрольную пробы ставят в 2-х или 3-х параллелях.

6) Планшеты инкубируют в термостате в течение 16-18 часов при температуре 37°С и 5% СО2.

7) После инкубации клетки переносят с помощью многоканального харвестера, прибора, предназначенного для сбора клеток методом фильтрации на фильтрах (Combi cell Harvester Skatron, England), и вакуумного насоса (фирма Millipore) из планшетов на специальные стекловолокнистые фильтры (Skatron, Filter Mat for 12 well Cell Harvesters, England) и отмывают натрий-фосфатным буфером от невключившейся метки.

8) Фильтры высушивают на воздухе в течение 6-18 часов, после чего помещают в сцинтилляционные флаконы (Beckman, USA). В вытяжном шкафу с помощью диспенсера (Brinkmann, Germany) наливают в каждый флакон по 3 мл сцинтилляционной жидкости ЖС-8 (Институт монокристалл, Украина) и оставляют еще на 6-18 часов для выхода β-частиц в сцинтилляционную жидкость.

9) После этого сцинтилляционные флаконы помещают в жидкостной сцинтилляционный счетчик β-частиц (MicroBeta trilux, PerkinElmer Inc.) и подсчитывают число радиоактивных импульсов в каждом флаконе.

10) В формулу для расчета цитотоксической активности НК-лимфоцитов вносят значения радиоактивности, полученные во флаконах с опытными и контрольными образцами, и выражают результат в виде индекса цитотоксичности (ИЦ) в %, который рассчитывают по формуле:

И Ц = ( 1 - Ч и с л о и м п у л ь с о в в о п ы т н о й т е с т - я ч е й к е Ч и с л о и м п у л ь с о в в к о н т р о л ь н о й т е с т - я ч е й к е ) × 1 0 0 %

Предлагаемый способ. Оценку цитотоксической активности НК-лимфоцитов на автоматическом счетчике и анализаторе клеток с помощью подсчета числа недеградированных после контакта с НК клеток-мишеней К-562, осуществляли следующим образом.

1) Для постановки цитотоксического теста в качестве клеток-мишеней для НК-лимфоцитов использовали клетки миелолейкоза человека линии К-562 (Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского, РАМН), поддерживаемые ин витро на среде RPMI-1640 (ФГУП «ПИПВЭ имени М.П. Чумакова РАМН), с добавлением 10% фетальной сыворотки (Defined Fetal Bovine Serum фирмы Hyclone, USA) и 10% глютамина.

2) Клетки-мишени перед постановкой цитотоксического теста не метили Н-уридином, вследствие чего исчезала необходимость обработки их РНКазой; отмывали один раз большим количеством среды 199 (ФГУП «ПИПВЭ имени М.П. Чумакова РАМН) с помощью центрифугирования при 1100-1200 об/мин и 4°С в течение 10 мин и разводили до концентрации 1х10 /мл средой 199.

3) Мононуклеарные клетки, в состав которых входили моноциты и общий пул лимфоцитов, 10-15% от которого составляют НК-лимфоциты, выделяли из периферической крови больных в градиенте плотности фиколл-верографина с уд. пл. 1,077, разводили средой 199 до концентрации 4×106/мл.

4) Постановку цитотоксического теста осуществляли в специальных 96-луночных круглодонных полистироловых планшетах с объемом лунки 0,25 мл (завод «Медполимер», Санкт-Петербург). В лунки с опытными пробами к 0,05 мл среды 199 добавляли 0,05 мл полной среды 199, обогащенной 10% эмбриональной телячьей сывороткой и 10% раствором глютамина; затем в соотношении 20:1 добавляли 0,05 мл взвеси мононуклеарных клеток и 0,1 мл не обработанных 3H-уридином и РНКазой клеток-мишеней К-562. В лунки с контрольными пробами вместо мононуклеарных клеток добавляли 0,05 мл среды 199. Каждую опытную и контрольную пробы ставили в 2-х или 3-х параллелях.

5) Планшеты инкубировали в термостате в течение 16-18 часов при температуре 37°С и 5% СО2.

6) После инкубации содержимое лунок двух или трех параллелей каждой пробы с помощью автоматической пипетки переносили из планшета для культивирования в пластиковые пробирки типа "Ependorf" и тщательно перемешивали.

7) Из каждой пробирки отбирали 100 мкл клеточной взвеси и разводили в 10 мл жидкости для разведения проб в специальных акуветах объемом 20 мл (акуветы и жидкость для разведения проб поставляются с прибором).

8) Акуветы помещали в автоматический счетчик и анализатор клеток (Beckman Coulter, USA), с помощью которого подсчитывали число недеградированных после контакта с НК-лимфоцитами клеток-мишеней К-562.

9) При анализе подсчитанных клеток учитывали только те клетки, диаметр которых находился в диапазоне от 15 до 40 мкм. Так как диаметр самых крупных мононуклеарных клеток крови, а именно моноцитов, не более 15 мкм, а диаметр клеток-мишеней К-562 более 15 мкм, то клетки, подсчитанные на приборе в диапазоне от 15 до 40 мкм, относили именно к клеткам К-562.

10) В формулу для расчета ЦА НК вносили значения, полученные на приборе, то есть, число клеток-мишеней в пробах с опытными и контрольными образцами, и выражали результат также в виде индекса цитотоксичности (ИЦ) в %, который рассчитывали по формуле:

И Ц = ( 1 - Ч и с л о к л е т о к - м и ш е н е й в о п ы т н о й т е с т - я ч е й к е Ч и с л о к л е т о к - м и ш е н е й в к о н т р о л ь н о й т е с т - я ч е й к е ) × 1 0 0 %

Процедура оценки ЦА НК на приборе является менее трудоемкой, экономичной и безопасной для здоровья исследователя, так как занимает по продолжительности 10-15 минут, не требует применения большого количества приборов, радиоактивных веществ и сцинтилляционной жидкости, как в прототипе.

Субъекты и параметры исследований.

У 16 больных шизофренией с первым приступом эндогенного психоза в возрасте от 18 до 25 лет (средний возраст - 20,8±0,4) проводили сравнительный анализ двух способов оценки цитотоксической активности НК-лимфоцитов: по измерению уровня 3H-уридина в клетках-мишенях К-562, то есть по прототипу, и по числу клеток-мишеней К-562, как в предлагаемом способе. Всех больных обследовали один раз до назначения им психотропной терапии. Исследования проводили на мононуклеарных клетках, выделенных из периферической венозной крови больных в градиенте плотности фиколл-верографина с плотностью 1,077 и состоящих из моноцитов и пула лимфоцитов, 10-15% от которых составляют НК-лимфоциты.

Поскольку оба способа оценки ЦА НК-лимфоцитов связаны с клетками-мишенями К-562, оставшимися недеградированными в результате цитолитического действия на них НК-лимфоцитов, целью исследования было продемонстрировать, что результаты, полученные с помощью предлагаемого способа, аналогичны результатам, полученным с помощью известного способа. Для подтверждения идентичности полученных результатов цитотоксический тест при обоих способах оценки ЦА НК-лимфоцитов ставили в разных вариантах: в культуре клеток в общей группе больных и в подгруппах больных с низким и высоким уровнем активности НК; в культуре клеток без моноцитов, которые удаляли с помощью адгезии в пластиковых чашках в течение одного часа при 37°С и 5% СО2; в культуре клеток с добавлением серотонина в концентрации 10-6 и 10-7 М.

Статистические вычисления

Все статистические исследования проводили, используя StatSoft (USA), версию 6. При сравнении различных групп использовали критерий U Манна-Уитни. Корреляционный анализ проводили с использованием критерия Spearman Rank R.

Примеры.

Пример 1 (по прототипу).

Пример 2 (предлагаемый способ).

Пример 3.

Аналогично примерам 1 и 2, но с добавлением перед постановкой цитотоксического теста серотонина в концентрации 10-6 М к взвеси клеток-мишеней К-562 и мононуклеарных клеток больных в общей группе.

Пример 4

Аналогично примерам 1 и 2, но с добавлением перед постановкой цитотоксического теста серотонина в концентрации 10-7 М к взвеси клеток-мишеней К-562 и мононуклеарных клеток больных в общей группе.

Пример 5

Аналогично примерам 1 и 2, но с удалением моноцитов из взвеси мононуклеарных клеток больных в общей группе перед постановкой цитотоксического теста.

Пример 6

Аналогично примерам 1 и 2, но с оценкой ЦА НК в подгруппе больных с высоким уровнем ЦА НК.

Пример 7

Аналогично примеру 6, но с добавлением перед постановкой цитотоксического теста серотонина в концентрации 10-6 М к взвеси клеток-мишеней К-562 и мононуклеарных клеток в подгруппе больных с высоким уровнем ЦА НК.

Пример 8

Аналогично примеру 6, но с добавлением перед постановкой цитотоксического теста серотонина в концентрации 10-7 М к взвеси клеток-мишеней К-562 и мононуклеарных клеток в подгруппе больных с высоким уровнем ЦА НК.

Пример 9

Аналогично примерам 1 и 2, но с оценкой ЦА НК в подгруппе больных с низким уровнем ЦА НК.

Пример 10

Аналогично примеру 9, но с добавлением перед постановкой цитотоксического теста серотонина в концентрации 10-6 М к взвеси клеток-мишеней К-562 и мононуклеарных клеток в подгруппе больных с низким уровнем ЦА НК.

Пример 11

Аналогично примеру 9, но с добавлением перед постановкой цитотоксического теста серотонина в концентрации 10-7 М к взвеси клеток-мишеней К-562 и мононуклеарных клеток в подгруппе больных с низким уровнем ЦА НК.

Пример 12

Аналогично примеру 9, но с удалением перед постановкой цитотоксического теста моноцитов из взвеси мононуклеарных клеток в подгруппе больных с низким уровнем ЦА НК.

Краткое описание чертежей.

В таблице 1 представлены данные сравнительного анализа двух способов оценки цитотоксической активности НК-лимфоцитов в общей группе больных. Можно видеть, что значения уровня цитотоксической активности НК, определяемого радиоактивным способом, как в примере 1, и подсчетом числа клеток-мишеней К-562 на анализаторе, как в примере 2, представляют собой практически одинаковые величины. При статистической обработке результатов эти данные были полностью подтверждены, то есть значимые различия между средними значениями определяемых показателей обнаружены не были (p>0,05). Подтверждением правильности полученных результатов служило выявление статистически значимых позитивных корреляций между уровнем цитотоксической активности НК-лимфоцитов, определяемым в недеградированных мишенях К-562 радиоактивным способом, с одной стороны, и их числом (Spearman r=0,6; p<0,05), с другой стороны.

В таблице 2 представлены данные сравнительного анализа двух способов оценки цитотоксической активности НК в общей группе больных с добавлением в культуры клеток перед постановкой цитотоксического теста серотонина в концентрации 10-6 и 10-7 М и удалением перед постановкой цитотоксического теста моноцитов из взвеси мононуклеарных клеток. Из таблицы видно, что значения ЦА НК-лимфоцитов, определяемой по уровню радиоактивности в недеградированных клетках-мишенях К-562 на β-счетчике и подсчетом их числа на анализаторе, практически одинаковы во всех вариантах постановки цитотоксического теста. Статистическая обработка результатов полностью подтвердила эти данные, то есть значимые различия между средними значениями определяемых показателей выявлены не были (p>0,05). Корреляционный анализ также подтвердил схожесть результатов, полученных с помощью оценки ЦА НК радиоактивным способом и на анализаторе в разных вариантах постановки цитотоксического теста. А именно, был выявлен высокий уровень позитивной корреляционной связи между результатами, полученными двумя способами в культурах клеток с добавлением серотонина в концентрации 10-6 и 10-7 М (Spearman r=0,81; p<0,001) и с удалением из взвеси мононуклеарных клеток моноцитов (r=0,95; p<0,001).

В Таблице 3 представлены результаты сравнительного анализа двух способов оценки ЦА НК-лимфоцитов в подгруппах больных с высоким и низким уровнем этой активности, а также при добавлении перед постановкой цитотоксического теста серотонина в концентрации 10-6 и 10-7 М в культуры клеток больных в каждой подгруппе и удалении перед постановкой цитотоксического теста моноцитов из взвеси мононуклеарных клеток больных с низким уровнем ЦА НК. Из таблицы видно, что значения уровня ЦА НК-лимфоцитов, определяемого радиоактивным способом на β-счетчике и подсчетом их числа на анализаторе, практически одинаковы во всех вариантах постановки цитотоксического теста. Статистическая обработка результатов также подтвердила эти данные, то есть значимые различия между средними значениями показателей, определяемых радиоактивным способом и на анализаторе, в разных вариантах постановки цитотоксического теста выявлены не были (p>0,05). При этом выявлялся высокий уровень позитивных корреляционных связей между значениями цитотоксической активности НК, полученными с помощью оценки по уровню 3H-уридина в недеградированных мишенях и на анализаторе по числу оставшихся мишеней (Spearman r=0,81; p<0,001).

Таким образом, предложен новый безопасный и экономичный по времени и по затратам способ оценки цитотоксической активности НК-лимфоцитов. Сравнительный анализ двух способов оценки цитотоксической активности НК-лимфоцитов в общей группе больных с помощью подсчета уровня радиоактивности в недеградированных клетках-мишенях К-562 и подсчета их числа на автоматическом счетчике и анализаторе клеток выявил полную идентичность полученных результатов, которая подтверждалась во всех вариантах постановки цитотоксического теста. При этом предлагаемый способ является более простым и коротким в исполнении, так как требует использования всего одного прибора вместо нескольких и занимает по времени 10-15 минут против 2-х-3-х дней, необходимых для оценки цитотоксической активности НК радиоактивным способом. Важным преимуществом предлагаемого способа оценки является также безопасность для здоровья исследователя, так как ее проведение не требует использования радиоактивной метки и сцинтилляционной жидкости. Известно, что НК-лимфоциты являются первой линией защиты организма человека и животных от разного рода чужеродных воздействий, к которым относятся инфекционные агенты и собственные трансформированные клетки. Основываясь на этом, можно предположить, что использование простого и безопасного способа оценки ЦА НК-лимфоцитов найдет широкое применение в качестве тест-системы для выявления снижения активности этого важного звена естественного иммунитета у больных с психопатологической симптоматикой и различными соматическими заболеваниями, в первую очередь злокачественными новообразованиями и заболеваниями инфекционной природы, а также при проведении скрининговых обследований с целью выявления среди населения групп людей с риском развития этих заболеваний.

Таблица 1
Способ оценки цитотоксической активности НК Число больных в общей группе ЦА НК, ИЦ, %
По уровню 3H-уридина в клетках-мишенях 16 31,4±3,5
(По прототипу Пример 1)
По числу клеток-мишеней 16 37,1±5,6
(Предлагаемый способ Пример 2)
Таблица 2
Варианты опыта Число больных в общей группе ЦА НК, ИЦ, %
Оценка по уровню 3H-уридина в клетках-мишенях (По прототипу) Оценка на анализаторе по числу клеток-мишеней (Предлагаемый способ)
Пример 1 Пример 2
С добавлением серотонина в концентрации 10×10-6 М 14 28,3±4,7 29,5±6,5
Пример 3
С добавлением серотонина в концентрации 10×10-7 М 14 34,8±4,5 33,6±5,2
Пример 4
Без моноцитов 21,0±4,4
Пример 5 9 20,8±5,2
Таблица 3
Варианты опыта Число больных ЦА НК, ИЦ, %
Оценка по уровню 3H-уридина в клетках-мишенях (По прототипу Пример 1) Оценка на анализаторе по числу клеток-мишеней (Предлагаемый способ Пример 2)
В подгруппе больных с высоким уровнем ЦАНК
С моноцитами 7 43,8±4,2 46,7±8,7
Пример 6
С добавлением серотонина в концентрации
10-6 М
6 45,4±2,6 43,8±9,7
Пример 7
С добавлением серотонина в концентрации
10-7 М
6 46,1±3,9 47,6±6,7
Пример 8
В подгруппе больных с низким уровнем ЦАНК
С моноцитами 9 27,9±6,1 21,7±2,1
Пример 9
С добавлением серотонина в концентрации
10-6 М
8 18,5±6,0 15,5±3,6
Пример 10
С добавлением серотонина в концентрации
10-7 М
8 20,3±5,4 26,4±5,7
Пример 11
Без моноцитов Пример 12 7 20,4±5,1 19,3±5,5

Способ оценки цитотоксической активности лимфоцитов натуральных киллеров осуществляют по клеткам-мишеням К-562, оставшимся недеградированными после контакта с НК-лимфоцитами, включает выделение НК-лимфоцитов в составе мононуклеарных клеток из периферической крови пациентов, постановку цитотоксического теста, основанного на инкубации НК-лимфоцитов и клеток-мишеней К-562, отличающийся тем, что используют клетки-мишени К-562, которые не метят 3H-уридином, и цитотоксическую активность НК-лимфоцитов оценивают с помощью подсчета числа оставшихся недеградироваными клеток-мишеней на автоматическом счетчике и анализаторе клеток, настроенном на выявление клеток диаметром от 15 до 40 мкм, после чего рассчитывают индекс цитотоксичности (ИЦ), в %, по формуле:



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины, в частности к радиационной биологии, и может быть использовано для ранней диагностики тяжести и прогнозирования исхода острого лучевого поражения.
Изобретение относится к медицине, а именно к способу диагностики нарушения фагоцитоза у детей. Сущность способа состоит в том, что исследуют взвесь лейкоцитов и частиц, содержащих хемоаттрактанты для лейкоцитов, выбранные из ряда нативные зерна пыльцы тимофеевки, ежовника обыкновенного, мелколистного лайма, бирючины обыкновенной, при соотношении 5-30 лейкоцитов на 1 частицу при увеличении микроскопа 15×25.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для определения и контроля уровня глюкозы в крови человека. Устройство для определения содержания глюкозы в крови включает линию для измерения уровня глюкозы по голосу человека и линию для инвазивного измерения уровня глюкозы в крови.

Группа изобретений относится к способу получения плазмосорбента из гранулированного активированного угля, способу его получения и применения для удаления свободного гемоглобина.
Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, и касается способа прогнозирования осложнений при индукции родов и прерывании беременности у женщин при антенатальной гибели плода.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в кардиологии и терапии. Способ прогнозирования течения ишемической болезни сердца заключается в том, что до и после лечения исследуют модифицированные ЛП(а) путем обработки 0,5 мл сыворотки крови 0,2 мл 0,1% раствора Тритона Х-100, инкубацией 15 мин при 20°С, перемешиванием смеси методом встряхивания 120 раз в 1 мин с последующим добавлением 7% раствора полиэтиленгликоля 6000 и электрофоретическим разделением в геле агарозы в лунке 4·20 мм и при снижении уровня модифицированных ЛП(а) на 30% и более, а холестерина на 18% и более и увеличением Апо А-1 на 25% и более по сравнению с исходным уровнем оценивают прогноз течения ишемической болезни сердца как благоприятный, способствующий переходу стенокардии напряжения из функционального класса III-IV в функциональный класс I-II, а при снижении уровня модифицированных ЛП(а) менее 30%, а общего холестерина менее 18% и увеличении Апо А-1 менее 25% по сравнению с исходным уровнем прогноз считают неблагоприятным.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу выбора тактики хирургического лечения больных с периимплантантным воспалением в области крупных суставов.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии и радиологии, и может найти применение при лечении больных злокачественными опухолями головного мозга. В способе определения показаний к проведению лучевой терапии у опухоленосителей путем предикции ее эффективности, включающем взятие пробы крови, гамма-облучение части этой пробы in vitro, инкубацию облученной и необлученной частей пробы крови, окрашивание ДНК-компонентов обеих частей крови ДНК-специфичным флуоресцентным красителем, определение количества лейкоцитов в облученной части пробы крови, количества лейкоцитов в необлученной части пробы крови, окрашивание всех ДНК-содержащих компонентов крови, определение ИДо - количества ДНК во всех ДНК-содержащих компонентах крови в расчете на один лейкоцит облученной части пробы и ИДн - количества ДНК во всех ДНК-содержащих компонентах крови в расчете на один лейкоцит необлученной части пробы, вычисление ИДн/ИДо, берут дополнительную пробу крови, в которую вводят водный раствор, содержащий ионы двухвалентного железа в концентрации 50-75 мг/л в объеме 8-14% от объема пробы крови, затем инкубируют дополнительную пробу крови в течение 15-30 минут, после чего осуществляют гамма-облучение части дополнительной пробы, далее инкубируют облученную и необлученную части дополнительной пробы в течение 2,5-3,5 часов, определяют количество лейкоцитов в облученной и необлученной частях дополнительной пробы, окрашивают все ДНК-содержащие компоненты частей дополнительной пробы и определяют ИДо доп - количество ДНК во всех ДНК-содержащих компонентах дополнительной пробы в расчете на один лейкоцит облученной части пробы и ИДн доп - количество ДНК во всех ДНК-содержащих компонентах в расчете на один лейкоцит необлученной части дополнительной пробы, после чего вычисляют соотношение ИДн доп/ИДо доп и при ИДн доп/ИДо доп>ИДн/ИДо на 20-35% и ИДН/ИД0>1 считают показанным проведение лучевой терапии.
Изобретение относится к области медицины и предназначено для лечения острого пиелонефрита у детей. Способ включает комбинированную терапию антибактериальным и антиоксидантным препаратами.

Изобретение относится к области микробиологии и молекулярной генетики и касается рекомбинантного полипептида А2, ДНК, его колирующей, штамма продуцирующего полипептид А2 и способов использования такого рекомбинантного полипептида.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при исследовании биологической активности клеток крови. Устройство для определения относительных размеров водной оболочки клеток крови включает систему формирования светового луча, поступающего через исследуемый материал, гнездо для размещения светопрозрачной кюветы в виде капилляра с цитратной кровью, снабженное нагревателем, приемник для регистрации угловых зависимостей интенсивностей света, рассеянного клетками крови (индикатрис светорассеяния) при углах наблюдения 0=0-30°. При этом используют капилляры с цитратной кровью после измерения СОЭ комнатной температуры и СОЭ50, через которые пропускается когерентное плоскополяризованное излучение. Регистрация угловых зависимостей интенсивностей света, рассеянного клетками крови, осуществляется в диапазоне 1,35-5 мкм, с последующим измерением площадей индикатрис светорассеяния красных или белых клеток крови с водной оболочкой S1 и без нее - S2 (после воздействия на эти капилляры высокой температуры). Полученные величины используются для вычисления относительных размеров водной оболочки по формуле:((S1-S2/S1)100%. Изобретение обеспечивает сокращение времени исследования биологической активности клеток крови. 3 ил., 1 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной клинической диагностике, и касается способа определения динамики изменения скорости оседания эритроцитов. Способ включает: смешивание исследуемой пробы крови с антикоагулянтом; забор полученного раствора крови с антикоагулянтом в капилляр; размещение его вертикально, при этом раствор крови с антикоагулянтом разливают с помощью автоматического дозатора в гематокритный капилляр, нижний конец которого герметично закупоривают; размещают капилляр вертикально в гнездо центрифуги и осуществляют измерение высоты слоя плазмы, свободной от эритроцитов, в режиме вращения центрифуги с угловой скоростью не более 50 об/мин. По полученным данным определяют максимальную величину оседания эритроцитов, измеряют высоту слоя плазмы по импульсной динамической характеристике, амплитуду которой фиксируют в два кратных момента времени, по которым регистрируют максимальную величину оседания эритроцитов и постоянную времени, а также предельную скорость, как их отношение, по которым определяют действительную характеристику скорости оседания эритроцитов. Применение способа обеспечивает повышение точности определения действительной характеристики скорости оседания эритроцитов за счет исключения методической и динамической погрешностей измерения. Также способ обеспечивает повышение точности определения динамики изменения скорости оседания эритроцитов на несколько порядков, а оперативность не менее чем в 3 раза. 1 табл., 4 ил.
Изобретение относится к медицине, а именно к урологии, и может быть использовано для прогнозирования благоприятного или летального исхода у больных с инфекционно-воспалительными заболеваниями органов мочевой системы. Для этого проводят лабораторно-клинические исследования эозинофилов и лимфоцитов крови, определяют абсолютное значение эозинофилов до первого сеанса непрямого электрохимического окисления (НЭХО) крови 0,06% раствором гипохлорита натрия и абсолютное значение эозинофилов после первого сеанса НЭХО крови, а также абсолютные значения лимфоцитов крови через 1, через 3 суток, через 7 суток после первого сеанса НЭХО крови. Полученные результаты включают в дискриминантные функции предварительного прогноза и окончательного прогноза. При этом больной относится к той группе, для которой классификационное значение функции максимально. Изобретение позволяет на основании прогнозирования благоприятного или летального исхода выбрать наиболее эффективную тактику для лечения группы больных, имеющих неблагоприятный прогноз. 4 табл., 4 пр.

Изобретение относится к области диагностики и может быть использовано для прогнозирования и анализа болезней, связанных с мочеиспусканием. Прибор количественного и качественного анализа жидкости организма содержит: корпус, в котором размещены коллектор для сбора жидкости организма пациента, контейнер промывочной воды, приводной блок для перекачки жидкости организма (мочи) из коллектора жидкости организма в контейнер мочи и для отвода промывочной воды из контейнера промывочной воды в коллектор жидкости организма, и блок управления для управления операциями приводного блока; измерительный блок для измерения количества и состава жидкости организма, собранной в коллектор жидкости организма; блок вывода для вывода значений измерений, полученных измерительным блоком, причем измерительный блок и блок вывода вмонтированы в корпус прибора. Изобретение обеспечивает автоматическое измерение параметров жидкости организма в режиме реального времени и позволяет предотвратить возникновения инфекции мочеполовой системы. 29 з.п. ф-лы, 19 ил., 2 табл.
Изобретение относится к профилактической медицине и лабораторной диагностике, предназначено для выявления функциональных резервов при скрининговом эпидемиологическом обследовании больших контингентов работающих. Способ включает сбор конденсата выдыхаемой влаги (экспирата), подготовку биосенсора - люминесцентных лифилизированных бактерий «Эколюм», добавление к 0,5 см3 биосенсора 0,5 см3 экспирата, 15-минутную экспозицию, измерение интенсивности люминесценции смеси суспензии бактерий и конденсата в течение 1000 с, фиксирование ее максимального уровня (Иоп, имп/с), сопоставление этого значения с аналогичным параметром Ик, имп/с, полученным при внесении в кювету биолюминометра вместо конденсата дистиллированной воды в равном объеме, установление коэффициента К как отношения Иоп/Ик, при этом дополнительно определяют расчетный биологический возраст (РБВ, лет) обследуемого, находят отношение расчетного биологического и календарного (KB) возрастов - РБВ/КВ, и при К>1 (высокий уровень образования кислородных радикалов) с одновременным РБВ/КВ>1 делают заключение о недостаточности функциональных резервов организма человека, при К≤1 (продуктивные антиоксидантные системы) и РБВ/КВ≤1 констатируют оптимальный их уровень, при К≤1, РБВ/КВ>1 - неопределенность результата оценки, мониторинг антиокислительного баланса, углубленное функциональное обследование. Способ позволяет исключить фрагментарный характер оценки, определить степень напряженности в организме и эффективные направления лечебно-профилактических мероприятий для создания условий перехода его функционирования на более высокий уровень. 6 пр.
Изобретение относится к медицине, в частности к функциональной диагностике в кардиологии, и может быть использовано для диагностики заболевания миокарда, обусловленного хронической сердечной недостаточностью, или ишемической болезнью, или пороками сердца. Способ характеризуется тем, что предварительно готовят образец сыворотки крови путем высушивания сыворотки, измельчения сухого остатка и суспензирования его в вазелиновом масле, затем исследуют образец методом инфракрасной спектроскопии в области 1200-1000 см-1, определяют высоту пиков полос поглощения с максимумами 1165,1160,1150,1140, 1130, 1100, 1070, 1050, 1040, 1025, 1005 см-1 с последующим вычислением значений 14 отношений высот максимумов пиков, после чего полученные значения отношений высот пиков сравнивают со значениями отношений высот пиков для здоровых людей (нормы), далее после проведенного сравнения значений отношений, количество полученных значений отношений, отличающихся от значений отношений у здоровых людей (нормы), суммируют и полученную сумму делят на общее число отношений - 14, и при полученном значении отношения, равном или более 0,21, диагностируют заболевание миокарда. Способ диагностики обеспечивает точность и экспрессивность, не требует больших материальных затрат, является простым в исполнении. 3 пр.
Изобретение относится к области биологии и медицины, а именно к лабораторным методам исследования эритроцитов. Сущность способа: предметное стекло покрывают адгезивным веществом, в качестве которого используют хлористый лантан, при этом стекла помещают в сосуд с 0.03% раствором хлористого лантана на 60 мин и высушивают при комнатной температуре в течение 60 минут. Затем изучают эритроциты с помощью атомно-силовой или сканирующей электронной микроскопии. Способ обеспечивает стойкое прилипание эритроцитов и способствует сохранению их на предметном стекле в течение длительного времени.

Группа изобретений относится к измерительному устройству для измерения характеристик пробы жидкости, в частности вязкоупругих характеристик пробы крови, и к измерительной системе аналогичного назначения, включающей, по меньшей мере, одно измерительное устройство. Указанное устройство включает опорный элемент, имеющий, по меньшей мере, один верхний рычаг подшипника с верхним подшипниковым узлом, по меньшей мере, один нижний рычаг подшипника с нижним подшипниковым узлом и основание для прикрепления к соответствующей измерительной системе; вал, имеющий подпятники и поддерживаемый с возможностью вращения по оси вращения упомянутым верхним подшипниковым узлом и упомянутым нижним подшипниковым узлом, причем упомянутый верхний подшипниковый узел, упомянутый нижний подшипниковый узел и упомянутые подпятники образуют соответствующие упорные подшипники; элемент сопряжения, имеющий обнаруживающий элемент и приводной элемент, причем упомянутый элемент сопряжения закреплен на упомянутом валу и соединен с соединительным валом с секцией соединителя для зонда для измерения характеристик упомянутой пробы жидкости, а упомянутый элемент сопряжения и соединительный вал соосно совмещены с валом, имеющим подпятники. Достигается повышение надежности и упрощение эксплуатации. 2н. и 14 з.п. ф-лы, 7 ил.

Изобретение относится к медицине, офтальмологии, эндокринологии. В макулярной зоне сетчатки определяют объем отека с помощью оптической когерентной томографии, выявляют изменения порогов чувствительности методом фундусмикропериметрии. Определяют уровень гликозилированного гемоглобина в плазме крови и уровень фактора роста эндотелия сосудов VEGF в слезной жидкости методом твердофазного иммуноферментного анализа. По результатам вычисляют значения критерия R1, характеризующего выраженность объема отека макулярной зоны; критерия R2, характеризующего степень изменения порогов чувствительности; критерия R3, отражающего характер взаимосвязи между состоянием морфологических структур сетчатки, соответствующим выраженности отека по значению критерия R1, и степенью компенсации сахарного диабета; критерия R4, отражающего взаимосвязь между состоянием морфологических структур сетчатки по критерию R1 и уровнем VEGF. На основании корреляционных взаимосвязей критериев R1-R4 рассчитывают Rобщ - интегральный критерий прогрессирования, отражающий характер развития и степень риска прогрессирования диабетической ретинопатии (ДРП) и диабетического макулярного отека (ДМО). При значении Rобщ≤0,07 диагностируют непролиферативную стадию и прогнозируют низкий риск прогрессирования ДРП и ДМО. При 0,07<Roбщ<0,18 диагностируют препролиферативную стадию и прогнозируют высокий риск прогрессирования ДРП и ДМО. При 0,18≤Rобщ≤1,0 диагностируют пролиферативную стадию и прогнозируют высокий риск прогрессирования ДРП и ДМО с неблагоприятным прогнозом для зрения. Способ обеспечивает объективную количественную оценку риска развития и прогрессирования ДРП с ДМО, представление целостной картины заболевания, включая морфологические и функциональные изменения центральной зоны сетчатки, определяющие остроту зрения, влияние VEGF на патогенез ДРП и ДМО, степень компенсации сахарного диабета. 11 ил., 2 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для прогнозирования степени злокачественности рака предстательной железы. Для этого путем биохимического исследования сыворотки крови определяют уровень матрилизина и растворимого Fas-антигена (sFas). Если сумма их концентраций до 7,0 нг/мл, судят о незлокачественном процессе, если сумма концентраций от 7,0 до 12,0 нг/мл, судят об умеренной степени злокачественности, и если сумма концентраций выше 12,0 нг/мл, судят о высокой степени злокачественности. Изобретение позволяет точно прогнозировать степень злокачественности рака предстательной железы на основе комплексной оценки серологических факторов риска, коррелирующих с морфологической картиной по шкале Глиссона. 1 табл., 3 пр.
Наверх