Способ определения 4-нитроанилина в биологическом материале



 


Владельцы патента RU 2519048:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации" (RU)

Изобретение относится к биологии, экологии, токсикологической и санитарной химии, а именно к способам определения 4-нитроанилина в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсикологических и экологических лабораторий. Биологический объект, содержащий 4-нитроанилин, двукратно настаивают с органическим изолирующим агентом, которым является 1,4-диоксан, полученные извлечения объединяют, объединенное органическое извлечение упаривают до полного удаления растворителя, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют, остаток растворяют в ацетонитриле, ацетонитрильный раствор разбавляют буферным раствором с рН 9-10 в соотношении 1:4 по объему, раствор обрабатывают хлоридом калия, экстрагируют этилацетатом, насыщенным водой, полученный экстракт упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до получения сухого остатка, остаток растворяют в смеси тетрахлорметана и ацетона, взятых в соотношении 9:1 по объему, хроматографируют в колонке с силикагелем L 40/100 мкм с использованием подвижной фазы тетрахлорметан-ацетон в соотношении 9:1 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С до полного удаления растворителя, остаток растворяют в дихлорметане, обрабатывают в течение 20 минут дериватообразующим реагентом, которым является N-трет-бутил-диметилсилил-N-метилтрифторацетамид, в условиях нагревания при температуре 60°С и проводят определение хромато-масс-спектрометрическим методом с применением капиллярной колонки DB-5 MS EVIDEX с неподвижной фазой, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан, используя масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 290°С со скоростью 20°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 4-нитроанилина по площади хроматографического пика его триметилсилильного производного. Способ обеспечивает повышение чувствительности. 3 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к биологии, экологии, токсикологической и санитарной химии, а именно к способу определения 4-нитроанилина в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсикологических и экологических лабораторий. Способ относится к числу массовых.

Известен способ определения нитропроизводного анилина (2,6-динитро-4-(трифторметил)-N,N-дипропиланилина) в биологическом материале путем измельчения биологического объекта, его двукратного, по 30 минут, настаивания с порциями ацетона, масса каждой из которых в два раза превышает массу биоматериала, отделения извлечений, их объединения, испарения растворителя из объединенного извлечения, растворения остатка в смеси гексана и ацетона, взятых в отношении 9,5:0,5 по объему, хроматографирования в колонке, заполненной 10 г силикагеля L 40/100 мкм с использованием подвижной фазы, являющейся смесью гексана и ацетона, взятых в отношении 9,5:0,5 по объему, сбора элюата фракциями по 2 мл каждая, объединения фракций элюата, содержащих анализируемое соединение, последующего хроматографирования на пластинах «Силуфол» UV-254, предварительно обработанных вазелиновым маслом, с использованием подвижной фазы, являющейся смесью воды и диоксана, взятых в отношении 2:8 по объему, элюирования анализируемого вещества из хроматограммы диметилформамидом с последующим измерением оптической плотности элюата при длине волны 278 нм (Шорманов В.К., Зайцева А.С. Разработка методики химико-токсикологического определения трифлуралина // Судебно-медицинская экспертиза, 2011. - Т.54, №3. - С.50-52).

Способ отличается недостаточно высокой чувствительностью и малой селективностью по отношению к 4-нитроанилину.

Известен способ определения отдельных мононитроанилинов, в том числе 4-нитроанилина, в биологическом материале, заключающийся в том, что анализируемую пробу измельчают, настаивают двукратно с бензолом (каждый раз в течение 45 минут), отдельные извлечения объединяют, часть объединенного извлечения наносят на пластину «Сорбфил» с тонким слоем силикагеля СТХ-1 ВЭ, содержащим люминесцентный индикатор и предварительно обработанным 10% раствором вазелинового масла в гексане, и хроматографируют, используя подвижную фазу вода-диоксан 8:2 по объему с последующим проявлением пятен анализируемого соединения в УФ-свете (Шорманов В.К., Шилова А.С., Сухомлинов Ю.А., Герасимов Д.А. Особенности определения отдельных нитропроизводных анилина в биологических объектах в тонком слое обращеннофазового сорбента // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2011. - Т.11, №3. - С.407-414).

Способ отличается недостаточно высокой чувствительностью и не позволяет проводить количественное определение 4-нитроанилина.

Наиболее близким является способ определения 4-нитроанилина в биологическом материале (тканях трупных органов), который заключается в том, что биологический объект вначале обрабатывают трис-буфером, устанавливая значение рН 9, затем настаивают в условиях встряхивания с органическим изолирующим агентом, которым является смесь этилацетата и хлороформа, взятых в объемном отношении 1:1, органическое извлечение отделяют, упаривают до полного удаления растворителя, обрабатывают дериватообразующим реагентом, которым является трифторуксусная кислота, растворитель испаряют, остаток растворяют в этилацетате и проводят определение хромато-масс-спектрометрическим методом с применением капиллярной колонки НР-5 MS с неподвижной фазой, представляющей собой 5%-дифенил-95%-диметилполисилоксан, используя масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 300°С со скоростью 15°С в минуту, температура интерфейса детектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по отдельным сегментам и вычисляют количество 4-нитроанилина по площади хроматографического пика его трифторацетильного производного (Bakdash A., Ganswindt М., Herre S., Nadulski Т., Pragst F. Lethal poisoning with p-nitroaniline // Toxichem + Krimtech. - 2006. - Vol.73, №2. - P. 61-65).

Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью.

Техническим результатом настоящего изобретения является повышение чувствительности определения.

Технический результат достигается тем, что биологический объект двукратно по 30 мин настаивают с органическим изолирующим агентом, которым является 1,4-диоксан, полученные извлечения объединяют, объединенное органическое извлечение упаривают до полного удаления растворителя, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют, остаток растворяют в ацетонитриле, ацетонитрильный раствор разбавляют буферным раствором с рН 9-10 в соотношении 1:4 по объему, раствор обрабатывают хлоридом калия, экстрагируют этилацетатом, насыщенным водой, полученный экстракт упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до получения сухого остатка, остаток растворяют в смеси тетрахлорметана и ацетона, взятых в соотношении 9:1 по объему, хроматографируют в колонке с силикагелем L 40/100 мкм с использованием подвижной фазы тетрахлорметан-ацетон в соотношении 9:1 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С до полного удаления растворителя, остаток растворяют в дихлорметане, обрабатывают в течение 20 минут дериватообразующим реагентом, которым является N-трет-бутил-диметилсилил-N-метилтрифторацетамид, в условиях нагревания при температуре 60°С и проводят определение хромато-масс-спектрометрическим методом с применением капиллярной колонки DB-5 MS EVIDEX с неподвижной фазой, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан, используя масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 290°С со скоростью 20°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 4-нитроанилина по площади хроматографического пика его триметилсилильного производного.

Способ осуществляется следующим образом: биологический объект, содержащий 4-нитроанилин, двукратно настаивают с органическим изолирующим агентом, которым является 1,4-диоксан, полученные извлечения объединяют, органическое извлечение упаривают до полного удаления растворителя, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют, остаток растворяют в ацетонитриле, ацетонитрильный раствор разбавляют буферным раствором с рН 9-10 в соотношении 1:4 по объему, раствор обрабатывают хлоридом калия, экстрагируют этилацетатом, насыщенным водой, полученный экстракт упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до получения сухого остатка, остаток растворяют в смеси тетрахлорметана и ацетона, взятых в соотношении 9:1 по объему, хроматографируют в колонке с силикагелем L 40/100 мкм с использованием подвижной фазы тетрахлорметан-ацетон в соотношении 9:1 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С до полного удаления растворителя, остаток растворяют в дихлорметане, полученный раствор обрабатывают в течение 20 минут дериватизирующим реагентом, которым является N-трет-бутил-диметилсилил-N-метилтрифторацетамид, в условиях нагревания при температуре 60°С и проводят определение хромато-масс-спектрометрическим методом с применением капиллярной колонки DB-5 MS EVIDEX с неподвижной фазой, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан, используя масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 290°С со скоростью 20°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 4-нитроанилина по площади хроматографического пика его триметилсилильного производного.

Пример 1

Определение 4-нитроанилина в крови

К 10 г крови человека прибавляют 5 мг 4-нитроанилина, тщательно перемешивают биологический объект с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°С. По истечении указанного времени смесь заливают 20 г органического изолирующего агента, которым является 1,4-диоксан, и настаивают 30 минут при перемешивании. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в вышеописанных условиях. Полученные извлечения объединяют, объединенное органическое извлечение упаривают до полного удаления растворителя в токе воздуха при 18-22°С, остаток неоднократно (трижды по 3 минуты) обрабатывают ацетоном (порциями по 15 г каждая) при энергичном перемешивании, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют в токе воздуха при 18-22°С до полного удаления растворителя, остаток растворяют в 10 мл ацетонитрила, ацетонитрильный раствор разбавляют буферным раствором с рН 9-10 в соотношении 1:4 по объему путем прибавления 40 мл данного буферного раствора, образующийся раствор обрабатывают 13,6 г хлорида калия, экстрагируют этилацетатом, насыщенным водой, дважды порциями по 50 мл каждая. Отдельные этилацетатные экстракты объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до получения сухого остатка. Остаток растворяют в 2-3 мл смеси тетрахлорметана и ацетона, взятых в соотношении 9:1 по объему, и вносят в хроматографическую колонку размерами 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100 мкм. Хроматографируют, используя подвижную фазу тетрахлорметан-ацетон в соотношении 9:1 по объему. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 14 по 21 включительно объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до полного удаления растворителя. Остаток растворяют в 10 мл дихлорметана (раствор А).

0,1 мл раствора А вносят в пробирку вместимостью 0,2 мл, обрабатывают в течение 20 минут 0,016 мл дериватизирующего реагента, которым является N-трет-бутил-диметилсилил-N-метилтрифторацетамид, в условиях нагревания при 60°С, продукт реакции вместе с содержимым пробирки количественно переносят в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводят дихлорметаном до метки (раствор Б).

4 мкл раствора В вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м, внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой толщиной 0,33 мкм, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан.

Начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 290°С со скоростью 20°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 4-нитроанилина по площади хроматографического пика его триметилсилильного производного.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 0,6 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 3,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 12,34 мин соответствует триметилсилильному производному 4-нитроанилина. В масс-спектре данного соединения, снятого по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 45, 73, 91, 106, 120, 134, 149, 178, 195, 210. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 195, интенсивность которой принимается за 100%.

4-нитроанилин в виде соответствующего триметилсилильного производного идентифицируют по сочетанию времени удерживания триметилсилильного производного в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание 4-нитроанилина, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал.

Построение градуировочного графика

В ряд мерных колб вместимостью 25 мл вносят 0,025, 0,10, 0,25, 0,5, 1,5, 2,5 и 6,25, 12,5 мл 0,4% раствора 4-нитроанилина в дихлорметане и доводят объем содержимого каждой колбы до метки дихлорметаном.

0,1 мл каждого из растворов вносят в пробирку вместимостью 0,2 мл, обрабатывают в течение 20 минут 0,016 мл N-трет-бутил-диметилсилил-N-метилтрифторацетамида в условиях нагревания при 60°С, продукт реакции вместе с содержимым пробирки количественно переносят в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводят дихлорметаном до метки.

4 мкл каждого из полученных растворов вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м, внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой толщиной 0,33 мкм, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан.

Начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 290°С со скоростью 20°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 4-нитроанилина по площади хроматографического пика его триметилсилильного производного.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 0,6 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 3,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

По результатам измерений на хромато-масс-спектрометре строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 1,6·10-10-8,0·10-8 г.

Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение градуировочного графика, которое в данном случае имеет вид:

S=201934·С+1576,

где S - площадь хроматографического пика; С- концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, нг.

Результаты количественного определения 4-нитроанилина в крови представлены в таблице 1.

Пример 2

Определение 4-нитроанилина в ткани печени

К 10 г ткани свежей трупной печени человека прибавляют 5 мг 4-нитроанилина, тщательно перемешивают биологический объект с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°С.

По истечении указанного времени смесь заливают 20 г органического изолирующего агента, которым является 1,4-диоксан, и настаивают 30 минут при перемешивании. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в вышеописанных условиях. Полученные извлечения объединяют, объединенное органическое извлечение упаривают до полного удаления растворителя в токе воздуха при 18-22°С, остаток неоднократно (трижды по 3 минуты) обрабатывают ацетоном (порциями по 15 г каждая) при энергичном перемешивании, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют в токе воздуха при 18-22°С до полного удаления растворителя, остаток растворяют в 10 мл ацетонитрила, ацетонитрильный раствор разбавляют буферным раствором с рН 9-10 в соотношении 1:4 по объему путем прибавления 40 мл данного буферного раствора, образующийся раствор обрабатывают 13,6 г хлорида калия, экстрагируют этилацетатом, насыщенным водой, дважды порциями по 50 мл каждая. Отдельные этилацетатные экстракты объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до получения сухого остатка. Остаток растворяют в 2-3 мл смеси тетрахлорметана и ацетона, взятых в соотношении 9:1 по объему, и вносят в хроматографическую колонку размерами 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100 мкм. Хроматографируют, используя подвижную фазу тетрахлорметан-ацетон в соотношении 9:1 по объему. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 14 по 21 включительно объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до полного удаления растворителя. Остаток растворяют в 10 мл дихлорметана (раствор А).

0,1 мл раствора А вносят в пробирку вместимостью 0,2 мл, обрабатывают в течение 20 минут 0,016 мл дериватизирующего реагента, которым является N-трет-бутил-диметилсилил-N-метилтрифторацетамид, в условиях нагревания при 60°С, продукт реакции вместе с содержимым пробирки количественно переносят в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводят дихлорметаном до метки (раствор Б).

4 мкл раствора В вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м, внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой толщиной 0,33 мкм, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан.

Начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 290°С со скоростью 20°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 4-нитроанилина по площади хроматографического пика его триметилсилильного производного.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 0,6 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 3,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 12,34 мин соответствует триметилсилильному производному 4-нитроанилина. В масс-спектре данного соединения, снятого по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 45, 73, 91, 106, 120, 134, 149, 178, 195, 210. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 195, интенсивность которой принимается за 100%.

4-нитроанилин в виде соответствующего триметилсилильного производного идентифицируют по сочетанию времени удерживания триметилсилильного производного в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание 4-нитроанилина, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал.

Построение градуировочного графика

Построение градуировочного графика и его уравнение приводятся в примере 1.

Результаты количественного определения 4-нитроанилина в ткани печени представлены в таблице 2.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом в 8 раз повышает чувствительность определения в хроматографируемой пробе и в 2,5 раза - в биологическом материале.

Сравнительные характеристики предлагаемого и известного способов представлены в таблице 3.

Таблица 1
Результаты определения 4-нитроанилина в крови (n=5; p=0,95)
Внесено 4-нитроанили-на, мг в 10 г крови Найдено Метрологические характеристики, %
площадь пика на хроматограмме, усл. ед. мг в хроматографируемой пробе мг в пересчете на навеску, внесенную в биоматериал % от внесенной в биоматериал навески
1 5,00 1756988 8,693·10-6 4,347 86,93 x ¯ = 86,74
2 5,00 1770315 8,759·10-6 4,380 87,59 S=2,63
3 5,00 1743660 8,627·10-6 4,314 86,27 S x ¯ = 1,18
4 5,00 1831501 9,062·10-6 4,531 90,62 Δ x ¯ = 3,27
5 5,00 1678435 8,304·10-6 4,152 83,04 ε=3,89
Таблица 2
Результаты определения в ткани печени (n=5; p=0,95)
Внесено 4-нитроанили-на, мг в 10 г печени Найдено Метрологические характеристики, %
площадь пика на хроматограмме, усл. ед. мг в хроматографируемой пробе мг в пересчете на навеску, внесенную в биоматериал % от внесенной в биоматериал навески
1 5,00 1786470 8,839·10-6 4,420 88,39 x ¯ = 85,89
2 5,00 1668945 8,257·10-6 4,129 82,57 S=2,95
3 5,00 1686311 8,343·10-6 4,172 83,43 S x ¯ = 1,32
4 5,00 1804442 8,928·10-6 4,464 89,28 Δ x ¯ = 3,67
5 5,00 1733361 8,576·10-6 4,288 85,76 ε ¯ = 4,27
Таблица 3
Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов (на примере исследования ткани печени)
Показатели Предлагаемый способ Известный способ
Чувствительность (открываемый
минимум)
а) в 100 г биоматериала 2,5·10-6 г 7,5·10-6 г
б) в хроматографируемой пробе 1,2·10-10 г 1,0·10-9 г
Интервал линейности
градуировочного графика (г в
хроматографируемой пробе) 1,6·10-10 - 8,0·10-8 г 1·10-9 - 1·10-7 г

Способ определения 4-нитроанилина в биологическом материале, заключающийся в том, что биологический объект настаивают с органическим изолирующим агентом, органическое извлечение упаривают до полного удаления растворителя, обрабатывают дериватообразующим реагентом и проводят определение хромато-масс-спектрометрическим методом с применением капиллярной колонки с неподвижной фазой, используя масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70°C, затем температуру повышают, температура квадруполя составляет 150°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр и вычисляют количество 4-нитроанилина по площади хроматографического пика его производного, отличающийся тем, что в качестве органического изолирующего агента используется 1,4-диоксан, настаивание с 1,4-диоксаном осуществляют двукратно, после упаривания органического извлечения остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют, остаток растворяют в ацетонитриле, ацетонитрильный раствор разбавляют буферным раствором с рН 9-10 в соотношении 1:4 по объему, раствор обрабатывают хлоридом калия, экстрагируют этилацетатом, насыщенным водой, полученный экстракт упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°C до получения сухого остатка, остаток растворяют в смеси тетрахлорметана и ацетона, взятых в соотношении 9:1 по объему, хроматографируют в колонке с силикагелем L 40/100 мкм с использованием подвижной фазы тетрахлорметан-ацетон в соотношении 9:1 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°C до полного удаления растворителя, в качестве дериватообразующего реагента используют N-трет-бутил-диметилсилил-N-метилтрифторацетамид, в качестве капиллярной колонки применяется колонка DB-5 MS EVIDEX с неподвижной фазой, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан, начальная температура термостата колонки выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°C до 290°C со скоростью 20°C в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура интерфейса детектора составляет 300°C, регистрируют масс-спектр по полному ионному току, а количество 4-нитроанилина вычисляют по площади пика его триметилсилильного производного.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине, а именно к биохимическим исследованиям в онкогинекологии, и описывает способ прогнозирования возникновения рецидива рака вульвы, включающий биохимическое исследование крови, причем при контрольных осмотрах больных раком вульвы в эритроцитах крови определяют погруженность белков в липидный матрикс мембран эритроцитов, и при ее значении в пределах 0,21-0,35 прогнозируют появление рецидивов, а при 0,08-0,2 - продолжительное нахождение больных в состоянии ремиссии.
Изобретение относится к медицине, а именно к урологии, и может быть использовано при оценке степени тяжести течения мочекислого уролитиаза. Способ предусматривает следующие стадии: больному мочекислым уролитиазом предварительно в течение 3 суток определяют исходные показатели уровня pH мочи и при условии, что во всех порциях мочи pH<6,2 с помощью цитрата натрия у больного доводят pH мочи до уровня 7,8 с последующим ожиданием самостоятельного снижения pH мочи до исходного уровня; затем при условии дозировки цитрата натрия до 0,06 мг/кг массы тела больного и последующем самостоятельном снижении pH мочи до исходного уровня более чем через 48 часов определяют легкую степень течения мочекислого уролитиаза; при дозировке в пределах 0,07-0,15 мг/кг массы больного и самостоятельном снижении pH мочи до исходного уровня в промежутке от 30 до 48 часов включительно определяют среднюю степень течения мочекислого уролитиаза; а при дозировке от 0,16 мг/кг массы больного и самостоятельном снижении pH мочи до исходного уровня менее чем за 30 часов - тяжелую степень течения мочекислого уролитиаза.

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии и неонатологии, и может быть использовано в качестве одного из диагностических критериев определения степени выраженности гипоксии новорожденных.
Изобретение относится к области медицины и предназначено для индивидуализации лечения больных раком тела матки молодого возраста. В опухолевой ткани эндометрия, полученной после операции у женщин репродуктивного возраста, анализируют плоидность клеток опухоли по фазам клеточного цикла.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии и радиологии, и может найти применение при лечении больных злокачественными опухолями головного мозга. В способе определения показаний к проведению лучевой терапии у опухоленосителей путем предикции ее эффективности, включающем взятие пробы крови, гамма-облучение части этой пробы in vitro, инкубацию облученной и необлученной частей пробы крови, окрашивание ДНК-компонентов обеих частей крови ДНК-специфичным флуоресцентным красителем, определение количества лейкоцитов в облученной части пробы крови, количества лейкоцитов в необлученной части пробы крови, окрашивание всех ДНК-содержащих компонентов крови, определение ИДо - количества ДНК во всех ДНК-содержащих компонентах крови в расчете на один лейкоцит облученной части пробы и ИДн - количества ДНК во всех ДНК-содержащих компонентах крови в расчете на один лейкоцит необлученной части пробы, вычисление ИДн/ИДо, берут дополнительную пробу крови, в которую вводят водный раствор, содержащий ионы двухвалентного железа в концентрации 50-75 мг/л в объеме 8-14% от объема пробы крови, затем инкубируют дополнительную пробу крови в течение 15-30 минут, после чего осуществляют гамма-облучение части дополнительной пробы, далее инкубируют облученную и необлученную части дополнительной пробы в течение 2,5-3,5 часов, определяют количество лейкоцитов в облученной и необлученной частях дополнительной пробы, окрашивают все ДНК-содержащие компоненты частей дополнительной пробы и определяют ИДо доп - количество ДНК во всех ДНК-содержащих компонентах дополнительной пробы в расчете на один лейкоцит облученной части пробы и ИДн доп - количество ДНК во всех ДНК-содержащих компонентах в расчете на один лейкоцит необлученной части дополнительной пробы, после чего вычисляют соотношение ИДн доп/ИДо доп и при ИДн доп/ИДо доп>ИДн/ИДо на 20-35% и ИДН/ИД0>1 считают показанным проведение лучевой терапии.

Группа изобретений относится к составу реагента датчика-анализатора, адаптированного для содействия определению концентрации анализируемого вещества в жидкой пробе, к способам определения концентрации анализируемого вещества в жидкой пробе и к способу нанесения состава реагента датчика анализатора на подложку способом трафаретной печати.
Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии, в частности к способу прогнозирования тяжести течения эпилепсии. Сущность способа состоит в том, что определяют спектр молекул средней массы в сыворотке крови пациента до начала терапии.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу снижения предела обнаружения иммунохроматографических методов контроля содержания низкомолекулярных соединений.

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, и может быть применено для определения содержания пероксида водорода (H2O2) в опухолевых клетках при воздействии на них противоопухолевого препарата, в частности цисплатина.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу определения рода возбудителей бактериемий. Изобретение может быть использовано в бактериологических лабораториях клиник для идентификации рода возбудителей бактериемии.

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к способам дифференциальной диагностики, и может использоваться для дифференциальной диагностики новообразований головного мозга. Способ осуществляют путем исследования методом ИК-спектроскопии образца сыворотки крови пациента в области спектров поглощения 1200-1000 см-1, для этого предварительно готовят образец сыворотки крови пациента, путем высушивания сыворотки крови, измельчения сухого осадка и суспензирования в вазелиновом масле, определяют высоту пика полос поглощения с максимумами 1170; 1165; 1160; 1150; 1140; 1130; 1125; 1100; 1070; 1050 и 1025 см-1 и вычисляют значение отношения высот пиков: отношение высоты пика с максимумом при 1170 см-1 к высоте пика с максимумом при 1150 см-1; отношение высоты пика с максимумом при 1165 см-1 к высоте пика с максимумом при 1160 см-1; отношение высоты пика с максимумом 1165 см-1 к высоте пика с максимумом 1130 см-1, отношение высоты пика с максимумом при 1165 см-1 к высоте пика с максимумом 1070 см-1, отношение высоты пика с максимумом при 1165 см-1 к высоте пика с максимумом 1150 см-1, отношение высоты пика с максимумом при 1165 см-1 к высоте пика с максимумом 1140 см-1, отношение высоты пика с максимумом при 1040 см-1 к высоте пика с максимумом 1070 см-1, отношение высоты пика с максимумом при 1070 см-1 к высоте пика с максимумом 1025 см-1, отношение высоты пика с максимумом при 1165 см-1 к высоте пика с максимумом 1050 см-1, отношение высоты пика с максимумом при 1165 см-1 к высоте пика с максимумом 1025 см-1, отношение высоты пика с максимумом при 1100 см-1 к высоте пика с максимумом 1050 см-1, отношение высоты пика с максимумом при 1170 см-1 к высоте пика с максимумом 1160 см-1, отношение высоты пика с максимумом при 1125 см-1 к высоте пика с максимумом 1165 см-1, и на основании полученных значений отношений строят дифференциально-диагностический профиль образца сыворотки крови пациента, для этого на 13 радиальных лучах, исходящих из центра (в системе координат 0:0) с углом между собой 30°, каждый из которых соответствует определенному отношению высот пиков полос поглощения, так: луч 1 соответствует отношению полос поглощения 1165/1160, луч 2 - отношению полос поглощения 1165/1070, луч 3 - отношению полос поглощения 1165/1150, луч 4 - отношению полос поглощения 1165/1140, луч 5 - отношению полос поглощения 1040/1070, луч 6 - отношению полос поглощения 1165/1130, луч 7 - отношению полос поглощения 1070/1025, луч 8 - отношению полос поглощения 1165/1050, луч 9 - отношению полос поглощения 1165/1025, луч 10 - отношению полос поглощения 1100/1050, луч 11 - отношению полос поглощения 1170/1150, луч 12 - отношению полос поглощения 1170/1160, луч 13 - отношению полос поглощения 1125/1165, откладывают вычисленные значения отношений на соответствующем каждому отношению лучу, и, соединяя между собой концы отрезков, получают плоский многоугольник, который сравнивают с многоугольниками, являющимися эталонными дифференциально-диагностическими профилями злокачественных новообразований головного мозга, такими как: анапластическая астроцитома, глиобластома, анапластическая олигодендроастроцитома, и доброкачественных новообразований, такими как: эпендимома, менингиома, аденома гипофиза, невринома, при этом для дифференциально-диагностического профиля анапластической астроцитомы значения 13 отношений составляют: 1 (0,56±0,07), 2 (0,54±0,06), 3 (0,42±0,05), 4 (0,39±0,02), 5 (1,34±0,16), 6 (0,73±0,17), 7 (0,72±0,12), 8 (0,44±0,01), 9 (0,38±0,08), 10 (0,27±0,12), 11 (0,15±0,05), 12 (0,20±0,07), 13 (0,97±0,17), для глиобластомы: 1 (0,83±0,04), 2 (1,16±0,12), 3 (0,62±0,01), 4 (0,63±0,04), 5 (1,26±0,21), 6 (1,26±0,13), 7 (0,73±0,12), 8 (0,96±0,13), 9 (1,13±0,01), 10 (0,27±0,13), 11 (0,34±0,04), 12 (0,34±0,14), 13 (0,57±0,18), для анапластической олигодендроастроцитомы: 1 (0,50±0,02), 2 (0,50±0,05), 3 (0,50±0,02), 4 (0,50±0,02), 5 (1,14±0,03), 6 (1,44±0,04), 7 (0,75±0,01), 8 (0,41±0,06), 9 (0,37±0,03), 10 (0,33±0,04), 11 (0,17±0,04), 12 (0,16±0,03), 13 (0,46±0,03), для эпендимомы: 1 (0,38±0,03), 2 (0,15±0,04), 3 (0,26±0,09), 4 (0,25±0,07), 5 (1,16±0,07), 6 (0,30±0,03), 7 (0,86±0,01), 8 (0,12±0,03), 9 (0,12±0,02), 10 (0,41±0,01), 11 (0,14±0,02), 12 (0,20±0,01), 13 (2,50±0,70), менингиомы: 1 (0,40±0,03), 2 (0,35±0,03), 3 (0,37±0,01), 4 (0,35±0,01), 5 (1,07±0,01), 6 (0,54±0,01), 7 (0,93±0,03), 8 (0,34±0,01), 9 (0,32±0,01), 10 (0,40±0,01), 11 (0,12±0,02), 12 (0,13±0,01), 13 (1,13±0,05), для аденомы гипофиза: 1 (0,45±0,05), 2 (0,34±0,04), 3 (0,41±0,03), 4 (0,56±0,03), 5 (1,05±0,02), 6 (0,60±0,05), 7 (0,94±0,04), 8 (0,30±0,03), 9 (0,32±0,03), 10 (0,48±0,01), 11 (0,12±0,04), 12 (0,13±0,05), 13 (1,05±0,03), для невриномы: 1 (0,53±0,01), 2 (0,35±0,05), 3 (0,48±0,01), 4 (0,53±0,01), 5 (0,85±0,07), 6 (0,90±0,08), 7 (1,28±0,09), 8 (0,40±0,01), 9 (0,45±0,02), 10 (0,52±0,03), 11 (0,05±0,01), 12 (0,04±0,01), 13 (0,73±0,09), и при наличии сходства полученного дифференциально-диагностического профиля пациента с эталонным профилем и совпадении всех 13 значений отношений образца сыворотки крови пациента со значениями отношений сходного эталонного профиля диагностируют у пациента новообразование головного мозга и его морфологический характер. Как видно из полученных результатов, предлагаемый способ позволяет с высокой точностью и информативностью определять не только наличие и вид новообразования головного мозга, но и морфологический характер новообразования. 14 ил.

Изобретение относится к медицине, а именно к судебной медицине, и может быть использовано для определения давности пятна крови. Способ включает измерение оптической плотности вытяжки из пятна крови и дополнительное определение вида ткани предмета-носителя. При расположении пятна крови на предмете-носителе из хлопчатобумажной ткани измерение оптической плотности вытяжки из пятна крови производят на длинах волн 400 нм и 410 нм, а при расположении пятна крови на предмете-носителе из шерстяной, джинсовой ткани или трикотаже, измерение оптической плотности вытяжки из пятна крови производят на длинах волн 380 нм и 410 нм. Давность пятна крови определяют по соответствующим формулам. Способ позволяет повысить точность определения давности пятна крови на текстильном материале при простоте выполнения. 2 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно к судебной медицине, и может быть использовано для определения вероятности образования пятна крови от живого лица. Способ включает определение биофизического параметра вытяжки из сухого пятна крови. В качестве биофизического параметра используют величину оптической плотности вытяжки из сухого пятна крови на длинах волн 400, 410, 420 нм. Дополнительно определяют давность пятна крови. Рассчитывают вероятность образования пятна крови от живого лица (Р) и при значении Р≥0,95 утверждают об образовании пятна крови от живого лица, а при Р<0,95 утверждают об образовании пятна крови от трупа. Способ позволяет повысить точность и объективность определения вероятности образования пятна крови от живого лица при простоте исполнения. 2 пр.

(57) Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для оценки воздействия на организм животных низкоинтенсивного лазерного облучения крови. У животного проводят забор венозной крови до, во время и после низкоинтенсивного лазерного облучения крови, получают из нее плазму. В термостате готовят фацию при температуре равной температуре тела животного и исследуют ее методом световой микроскопии. В случае деструкции - считают воздействие чрезмерным, а в случае упорядочивания структуры - положительным. Заявленный способ позволяет быстро и точно оценить воздействие на организм животных низкоинтенсивного лазерного облучения крови. 9 ил., 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к использованию бактериальной бета-лактамазы для диагностики in vitro и визуализации, диагностики и лечения in vivo. Способ обнаружения патогенных бактерий в режиме реального времени у субъекта заключается в том, что осуществляют введение субъекту или взятие у субъекта образца флуорогенного субстрата для бета-лактамазы патогенных бактерий; визуализацию субъекта или образца на наличие флуоресцентного продукта бета-лактамазной активности на субстрате; получение сигналов на длине волны, испускаемой флуоресцентным бета-лактамазным продуктом, и обнаружение патогенных бактерий у субъекта в режиме реального времени. При этом флуорогенный субстрат представляет собой CNIR5, CNIR5-QSY22, CNIR7, CNIR7-TAT, CNIR9 или CNIR10. Способ мониторинга развития патофизиологического состояния, связанного с патогенными бактериями у субъекта. Способ скрининга соединений, обладающих терапевтическим эффектом против патогенной Mycobacterium у субъекта. Способ визуализации патогенных бактерий c флуорогенным субстратом для бактериальной бета-лактамазы. Использование заявленного изобретения позволяет улучшить визуализацию патогенных бактерий и мониторинг эффективности терапевтических соединений. 5 н. и 15 з.п. ф-лы, 26 ил., 1 табл., 14 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии, и может быть использовано для скрининга детей дошкольного возраста с целью раннего выявления у них возможности инфекции мочевыводящих путей. Способ основан на методике подготовки проб мочи в лунках микропланшета, включающей термостатирование, и заключается в количественном определении уреазной активности мочи на микропланшетном ридере при длине волны 620 нм, построении калибровочной кривой и вычислении уреазной активности мочи в Е/л по формуле: УА=ΔD*11655, где УА (Е/л) - уреазная активность в (Е/л); ΔD - изменение оптической плотности проб мочи пациента после термостатирования; 11655 - коэффициент перевода на уреазную активность. При значении уреазной активности мочи выше 1621,73 Е/л ребенка относят к группе риска формирования инфекции мочевыводящих путей. Использование способа позволяет увеличить пропускную способность лаборатории. 1 табл., 2 пр., 2 ил.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для экспресс-диагностики злокачественных опухолей в условиях больницы на интраоперационном этапе. Изобретение заключается в том, что из удаленной во время операции пораженной доли щитовидной железы вырезают образец ткани опухоли и образец визуально неизмененной прилежащей к опухоли ткани, гомогенизируют образцы тканей в буфере, содержащем 50 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 100 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1 мМ дитиотреитол, 1 мМ АТР, 10 мМ Na2S2O5 в соотношении веса ткани, мг, к объему буфера, мкл, 1:6, центрифугируют полученные гомогенаты в течение, по меньшей мере, 5 сек с получением надосадочных жидкостей образцов тканей, содержащих протеасомы ткани опухоли или протеасомы визуально неизмененной прилежащей к опухоли ткани. Затем каждую надосадочную жидкость в количестве 2, 4 и 6 мкл помещают в 100 мкл раствора, содержащего 30 мкМ флуорогенного субстрата Suc-LLVY-AMC химотрипсинпобных центров протеасом и 20 мМ Tris-HCl (pH 7.5), 1 мМ дитиотреитол, 5 мМ MgCl2, 1 мМ АТР, проводят реакцию гидролиза Suc-LLVY-AMC протеасомами при 37°С в течение, по меньшей мере, 5 мин, затем добавляют по 250 мкл 1,4% раствора SDS для прекращения реакции гидролиза. Оценивают химотрипсинподобную активность протеасом по интенсивности флуоресценции гидролизованного субстрата в единицах показаний флуориметра. При превышении величины интенсивности флуоресценции гидролизованного субстрата в образце ткани опухоли, по меньшей мере, в 3 раза величины интенсивности флуоресценции гидролизованного субстрата в образце визуально неизмененной прилежащей к опухоли ткани диагностируют рак щитовидной железы. Применение предлагаемого способа обеспечивает повышение точности и сокращение времени интраоперационной диагностики рака щитовидной железы для выбора адекватного объема оперативного вмешательства. 5 з. п. ф-лы, 3 табл., 2 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и неонатологии, и может быть использовано для прогнозирования патологического течения неонатального периода. Сущность способа заключается в том, что в околоплодных водах, взятых в период вскрытия плодного пузыря в родах, определяют содержание цинка и меди, вычисляют их соотношение. При его величине, равной 4,2-3,2, прогнозируют развитие кардиопатии, а при 3,1 и ниже - развитие энцефалопатии. Заявляемый способ позволяет повысить точность и специфичность диагностики и своевременно проводить патогенетическую терапию. 5 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии, и может быть использовано для раннего выявления дисметаболической нефропатии у детей 3-7 лет. Способ заключается в исследовании пробы мочи после взаимодействия мочи с 10% водным раствором хлорида кальция фотометрически на микропланшетном ридере при длине волны 620 нм и количественном определении кристаллообразующей способности мочи по формуле: Соп-(Dn-Dn-1)·13,4/(D4-D3), где D4 - оптическая плотность стандартного раствора 13,4 г/л оксалата натрия с 10% раствором хлористого кальция, D3 - оптическая плотность стандартного раствора 13,4 г/л оксалата натрия с дистиллированной водой, Dn - оптическая плотность опытной пробы пациента №Х с 10% раствором хлористого кальция, Dn-1 - оптическая плотность опытной пробы пациента с дистиллированной водой, 13,4 г/л - концентрация стандартного раствора оксалата натрия. При значении кристаллообразующей способности мочи выше 6,0 г/л относят конкретного ребенка к группе риска по формированию дисметаболической нефропатии. 3 пр., 2 ил.

Изобретение относится к области медицины, включающей исследования биологического материала, и касается определения относительной длины теломер на хромосомах. Способ заключается в выявлении укорочения относительной длины теломер на отдельных хромосомах Т-лимфоцитов периферической крови с помощью метода количественной флуоресцентной гибридизации in situ (Q-FISH). Результативный показатель длины теломер вычисляют как отношение среднего значения интенсивности флюоресценции теломер определенной хромосомы (для каждого из плеч отдельно) к среднему значению интенсивности флюоресценции теломер всех хромосом в метафазе. Укорочение относительной длины теломер на коротком плече 4 хромосомы у пациентов с ревматоидным артритом в сравнении с донорами расценивают как маркер развития заболевания. Изобретение позволяет с достаточной информативностью и специфичностью определить риск развития данного вида аутоиммунной патологии. 3 ил., 1 табл., 2 пр.
Наверх