Способ определения простейших blastocystis spp. с различной степенью вирулентности

Изобретение относится к области микробиологии и паразитологии микроорганизмов. Способ предусматривает рестрикционный анализ бактериальной ДНК бластоцист с использованием комбинации эндонуклеаз рестрикции - Нае III, Pst I и Hind III, позволяющих идентифицировать простейших с различной степенью вирулентности. При этом применение рестриктазы Нае III позволяет проводить дифференциацию авирулентных штаммов бластоцист на основе наличия фрагментов размером 850 п.н. и вирулентных на основе наличия фрагментов ДНК размером от 550 до 10000 п.н. При помощи рестриктазы Pst I выявляют бластоцисты с умеренно выраженной вирулентностью на основе наличия фрагментов ДНК размером около 900 п.н. Применение рестриктазы Hind III позволяет типировать бластоцисты со слабовыраженной вирулентностью на основе фрагментов ДНК, размером 700 п.н., а также высоковирулентные штаммы бластоцист на основе наличия фрагментов ДНК, размеров 380 и 600 п.н. Способ позволяет повысить эффективность определения вирулентности простейших. 6 ил.

 

Изобретение относится к области микробиологии и паразитологии микроорганизмов и может быть использовано для определения простейших Blastocysts spp. с различной степенью вирулентности у пациентов с нарушениями качественного и/или количественного состава микробиоценоза кишечника, инвазированных бластоцистами.

В последние годы в России отмечается чрезвычайно напряженная эпидемиологическая обстановка по паразитозам. В стране ежегодно официально регистрируется более 1,3 миллионов больных паразитарными заболеваниями, среди которых отмечается значительный рост заболеваемости кишечными протозоозами. В связи с этим, особую актуальность приобретает широко распространенная «новая» протозойная инвазия - бластоцистоз, обусловленная паразитированием преимущественно в толстой кишке простейших Blastocysts spp.

Данный возбудитель длительное время не привлекал внимание специалистов как энтеропатоген, однако в настоящее время имеется достаточное количество работ, подтверждающих роль Blastocysts spp. в патологии человека. Мишенью данных простейших является желудочно-кишечный тракт человека.

С целью аргументации этиологической значимости бластоцист в развитии патологического процесса, как и всех условно-патогенных микроорганизмов, необходимо подтверждение их вирулентности. Несмотря на то, что до сих пор отсутствуют экспериментальные модели, позволяющие воспроизвести полный цикл паразита, существует большое количество экспериментальных и клинико-биологических работ, подтверждающих значение Blastocysts spp. как патогена.

Патогенность Blastocysts spp. была убедительно доказана в опытах на безмикробных морских свинках, которых заражали per os (Мое К.Т. et al. Experimental Blastocysts hominis infection in laboratory mice // Parasitol. Res. -1998. - V.83. - P.319-325.) и непосредственным введением паразита в слепую кишку (Markell Е.К. et al. В.hominis Pathogen or fellow traveller // J.Trop. Med. Hyg. - 1986. - V.35. - P. 1023-1026). У всех животных развивалась не только колонизация, но и инвазия кишечника бластоцистами, сопровождающаяся диареей. В результате все животные теряли в весе и проявляли повышенную сонливость. Гистологическое исследование толстого кишечника выявило интенсивное воспаление слизистой оболочки с явлениями некроза.

Общепринятым методом определения вирулентности микроорганизмов является тест внутрибрюшинного заражения мышей. Однако этот способ является длительным и малоэффективным, так как не дает полного представления о наличии генетических маркеров вирулентности в геноме микроорганизмов.

Задачей изобретения является создание метода определения простейших Blastocysts spp. с различной степенью вирулентности, обеспечивающего получение технического результата, состоящего в повышении эффективности определения вирулентности простейших за счет проведения молекулярно-генетического анализа расщепления хромосомной ДНК бластоцист эндонуклеазами рестрикции.

Предлагаемый способ определения вирулентности простейших бластоцист методом полиморфизма длин фрагментов рестрикции с использованием определенного набора эндонуклеаз не имеет идентичных аналогов при решении поставленной задачи.

Используемый метод ПДФР широко применяется в настоящее время в генетических исследованиях популяций, поскольку наличие в геноме исследуемого организма рестрикционного фрагмента ДНК определенной длины является прекрасным генетическим маркером и одновременно фенотипическим признаком, тесно связанным с генотипом организма. Однако большинство исследований направлены, например, на изучение распространения такого маркера в популяциях, передачей его от родителей к потомству при скрещиваниях и направлены в дальнейшем для построения генетических карт исследуемых организмов, поскольку ПДФР-маркеры благодаря их четкой принадлежности определенным генетическим локусам не уступают по информативности распространенным биохимическим маркерам и во многих случаях оказываются удобнее сложных стенотипических признаков (таких, как цвет глаз, окраска волос или шерсти, форма цветков и листьев), определяемых многими генными локусами. Это широко представлено в работах Лыоина Б., 1987, Lindblom В. et al., 1988, Roberts R. et al., 2005.

Также этот довольно простой метод в последнее время применяется с целью изучения геномов млекопитающих для поиска сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции, позволяющий производить расчет длин и количества образуемых при расщеплении фрагментов ДНК с последующим построением диаграмм их распределения (Абдурашитов М.А. с соавт., 2006).

Однако до настоящего времени нет работ, позволяющих выявить генетические маркеры патогенных свойств бластоцист и на основе рестрикционного анализа ДНК определить зависимость между полиморфизмом длин фрагментов нуклеотидных последовательностей и вирулентностью простейших.

Указанный технический результат в методе определения Blastocystis spp. с различной степенью вирулентности достигается тем, что применяется молекулярно-генетический метод рестрикционного анализа бактериальной ДНК или анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции (ПДФР) ДНК.

Для фрагментирования ДНК бластоцист использовали рестриктазы (ферменты, расщепляющие ДНК) или рестрикционные эндонуклеазы, выделенные из бактериальных клеток. Эти ферменты in vivo участвуют в узнавании и разрушении чужеродных для микроорганизмов ДНК, расщепляя внутренние участки молекулы на сравнительно небольшие фрагменты. Рестриктазы узнают специфические последовательности из 4-6, реже 8-12 нуклеотидов в двухцепочечной молекуле ДНК (сайты рестрикции) и "разрезают" ее в местах локализации этих последовательностей. Количество образующихся рестрикционных фрагментов ДНК при использовании одной рестриктазы зависит от количества сайтов рестрикции, а размер фрагментов определяется положением этих сайтов по всей длине исходной молекулы ДНК.

В работе были использованы рестриктирующие эндонуклеазы (рестриктазы): EcoR 1, BamH 1, Нае III, Hind III, Pst I, производство НПО «СибЭнзим», г.Новосибирск (infos@ibenzyme.ru), в соответствующем буфере.

Сущность изобретения поясняется рисунками, на которых изображены:

фиг.1 - электрофореграмма рестрикционных фрагментов ДНК штаммов бластоцист с использованием рестриктазы BamH I;

где 1, 2 - авирулентные штаммы бластоцист,

3, 4 - слабовирулентные штаммы бластоцист,

5, 6- умеренновирулентные штаммы бластоцист,

7, 8 - высоковирулентные штаммы бластоцист,

М2 - маркер молекулярного веса - 300-10000 п.н.

фиг.2 - электрофореграмма рестрикционных фрагментов ДНК штаммов бластоцист с использованием рестриктазы Нае III;

где 1, 2 - авирулентные штаммы бластоцист,

3, 4 - слабовирулентные штаммы бластоцист,

5, 6 - умеренновирулентные штаммы бластоцист,

7, 8 - высоковирулентные штаммы бластоцист,

Ml - маркер молекулярного веса - 100-1000 п.н.,

М2 - маркер молекулярного веса - 300-10000 п.н.

фиг.3 - электрофореграмма рестрикционных фрагментов ДНК штаммов бластоцист с использованием рестриктазы Hind III;

где 1,2 - авирулептные штаммы бластоцист,

3, 4 - слабовирулентные штаммы бластоцист,

5, 6 - умеренновирулентные штаммы бластоцист,

7, 8 - высоковирулентные штаммы бластоцист,

Ml - маркер молекулярного веса - 100-1000 п.н.,

М2 - маркер молекулярного веса - 300-10000 п.н.

фиг.4 - электрофореграмма рестрикционных фрагментов ДНК штаммов бластоцист с использованием рестриктазы Pst I;

где 1, 2 - авирулентные штаммы бластоцист,

3, 4 - слабовирулентные штаммы бластоцист,

5, 6 - умеренновирулентные штаммы бластоцист,

7, 8 - высоковирулентные штаммы бластоцист,

М2 - маркер молекулярного веса - 300-10000 п.н.

фиг.5 - электрофореграмма рестрикционных фрагментов ДНК штаммов бластоцист с использованием рестриктазы EcoR I;

где 1-4 - авирулентные штаммы бластоцист,

5-8 - слабовирулентные штаммы бластоцист,

9-12 - умеренновирулентные штаммы бластоцист,

13-16 - высоковирулентные штаммы бластоцист,

Ml - маркер молекулярного веса - 100-1000 п.н.,

М2 - маркер молекулярного веса - 300-10000 п.н.

фиг.6 - величина фрагментов ДНК бластоцист с различной степенью проявления вирулентности (п.н.).

Метод осуществляют поэтапно следующим образом.

1. Выделение ДНК бластоцист

Выделение ДНК простейших проводили с использованием фенольно-хлороформной методики выделения согласно инструкции по применению комплекта реагентов для выделения ДНК, утвержденным приказом Росздравнадзора от 30 июня 2008 №5008-Пр/08, регистрационное удостоверение МЗ CP РФ №ФСР 2008/02938.

Фенольно-хлороформная экстракция для выделения ДНК бластоцист осуществляли с применением наборов «ВекторДНК-экстракция», ЗАО «Вектор-Бест» (пос. Кольцево, Новосибирской области).

В эксперименте использовали чистые культуры Blastocysts spp., выращенные на среде Surech. Для установления оптимального срока обработки исследуемого материала было проведено выделение ДНК через 3 суток после хранения культур при t=-20°С.

Этапы выделения ДНК:

1) полученные культуры бластоцист, объемом до 2 мл, отливали в пробирки типа Эппендорф;

2) центрифугировали пробирки при 13000 об/мин в течение 15 минут при комнатной температуре;

3) не задевая осадок, полностью удаляли надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником;

4) проводили электрофорез в 1% агарозовом геле. Это стандартный метод использовался для разделения, идентификации и очистки фрагментов ДНК. Окрашивание проводили флуоресцирующим и интеркалирующим в ДНК красителем - бромистым этидием в низкой концентрации, связывающегося с фрагментами молекулы и дающего специфическое розовое окрашивание в ультрафиолетовой области спектра;

5) в агарозовый гель помещали выделенные фрагменты ДНК и заливали буферным раствором ТВЕ (трис-борат) при концентрации 50 мМ, рН 7,5-7,8 и разгоняли в течение 3 часов;

6) гели просматривали с помощью трансиллюминатора.

II. Проведение расщепления ДНК бластоцист рестриктазами

Для каждого фермента рестрикции существуют оптимальные условия реакции, которые приводились в описании, прилагаемой фирмой-изготовителем. Основные переменные параметры - это температура инкубации и состав буфера.

Реакцию останавливали добавлением 5 мкл стоп-раствора, содержащего 0,1 М ЭДТА, 0,05% бромфенолового синего и 40% сахарозы. Электрофоретическое разделение продуктов рестрикции амплифицированной ДНК проводили в 2% агарозе (Sigma) в трис-ацетатном буфере с этидий-ор-бромидом (0,5 мг/л) при 120 V в течение 3 ч. Идентификация нужных фрагментов ДНК в таком геле возможна только путем гибридизации с мечеными ДНК-зондами. Синтез ДНК-зондов осуществлялся в автоматизированных машинах, позволяющих синтезировать фрагменты однонитевой ДНК длиной свыше 100 нуклеотидных звеньев со строго определенной первичной структурой. Такие молекулы можно использовать для специфического связывания с исследуемыми участками гена.

Для определения длины фрагментов ДНК использовали маркеры молекулярного веса ДНК (Ml- маркер молекулярного веса - 100-1000 п.н., М2-маркер молекулярного веса - 300-10000 п.н., НПО "СибЭнзим"). Определение длин полученных рестриктов осуществляли с помощью компьютерной программы Gel Pro Analyzer, версия 4.0.00.001. Процент идентичности длин фрагментов рассчитывали для каждой пары микроорганизмов, сравнивая картины рестрикции отдельно по каждой рестриктазе. При сравнении длин рестриктов идентичными считали фрагменты ДНК, длина которых различалась не более чем на 5%.

Далее был проведен ряд экспериментов с использованием рестриктаз на экстрагированной ДНК авирулентных, слабовирулентных, умеренновирулентных и высоковирулентных штаммах бластоцист, выделенных из клинического материала больных.

При использовании рестриктазы BamH 1 - G▼GATCC/CCTAG▲G. на дорожках 1% агарозного геля наблюдались полосы окрашенной бромистым этидием ДНК размером около 10000 п.н. Коротких фрагментов хромосомной ДНК бластоцист размером 100-10000 п.н. в ходе эксперимента обнаружено не было (фиг.1).

При проведении реакции с экстрагированной тотальной ДНК бластоцист с различной степенью выраженности вирулентности были получены следующие результаты: на дорожках агарозного геля после электрофореза у авирулентных бластоцист ясно выражены фрагменты ДНК размером около 850 п.н., в остальных дорожках ДНК бластоцист с различной степенью выраженности вирулентности, кроме этих фрагментов, наблюдались полосы с размерами от 1500 до 10000 п.н. (фиг.2).

Следовательно, рестриктаза Нае III позволяет дифференцировать авирулентные и вирулентные штаммы бластоцист без выявления выраженности вирулентных свойств.

При использовании рестриктазы Hind III - A▼AGCTT/TTCGA▼А на дорожках 1% агарозного геля наблюдались полосы размером от 10000 и более п.н., окрашенные бромистым этидием. Кроме этого, на дорожках ДНК слабовирулентных штаммов бластоцист наблюдалась полоса размером 700 п.н.; на дорожках агарозы ДНК высоковирулентных штаммов бластоцист выявлялись две полосы 380 и 600 п.н. Следовательно, рестриктаза Hind III позволяет выявить слабо- и высоковирулентных простейших (фиг.3).

При проведении экспериментов рестрикцирования (расщепления с помощью эндонуклеаз) выделенной ДНК штаммов бластоцист рестриктазы Pst I - CTGCA▼G/G▲ACGTC были получены следующие результаты: на дорожках агарозного геля штаммов бластоцист с различной степенью выраженности вирулентности наблюдались яркие размытые полосы (шмеры) размером от 2000 до 10000 (на отдельных дорожках и более) п.н. (фиг.4).

Однако на дорожках хромосомной ДНК умеренновирулентных бластоцист наблюдали фрагменты размером около 900 п.н. У других штаммов бластоцист таких полос не обнаруживалось. Таким образом, рестриктаза Pst I позволила выявить только умеренновирулентные штаммы Blastocystis spp.

При использовании рестриктазы EcoR I с сайтом узнавания G G▼AATTC/CTTAA▲G на дорожках 1% агарозного геля изолятов бластоцист с различной степнью выраженности вирулентности наблюдали полосы шмер по всей длине дорожек, свидетельствующих о множественных фрагментах ДНК различной длины, перекрывающих друг друга (фиг.5).

Таким образом, можно сделать заключение о наличии в структуре ДНК всех штаммов бластоцист множественных сайтов GAATTC/CTTAAG, что свидетельствует о невозможности выявления степени вирулентности бластоцист при помощи рестриктазы EcoR I.

На фиг.6 представлены результаты определения вирулентности штаммов бластоцист, полученных методом рестрикционного анализа ДНК простейших с использованием рестриктирующих эндонуклеаз (рестриктаз): EcoR I, BamH I, Нае III, Hind III, Pst I.

Таким образом, в работе предложен метод определения вирулентности Blastocystis spp., основанный на анализе полиморфизма длин фрагментов рестрикции (ПДФР) ДНК бластоцист. В эксперименте представлены результаты анализа ПДФР ПЦР-продукта длинной 10000 пар нуклеотидов, полученного при выделении ДНК простейших с применением пяти эндонуклеаз рестрикции EcoR I, BamH I, Нае III, Hind III, Pst 1.

Проведенный рестрикционный анализ показал, что использование рестриктаз BamH I, EcoR I не позволяет типировать бластоцисты с различной степенью выраженности вирулентности.

Применение рестриктазы Нае III позволяет проводить дифференциацию авирулентных штаммов бластоцист на основе наличия фрагментов размером 850 п.н. и вирулентных на основе наличия фрагментов ДНК размером от 550 до 10000 п.н.

При помощи рестриктазы Pst I произведено типирование бластоцист с умеренно выраженной вирулентностью на основе наличия фрагментов ДНК размером около 900 п.н.

В эксперименте с применением рестриктазы Hind III было произведено типирование бластоцист со слабовыраженной вирулентностью на основе фрагментов ДНК, размером 700 п.н., а также высоковирулентных штаммов бластоцист на основе наличия фрагментов ДНК, размеров 380 и 600 п.н.

Таким образом, разработанный способ определения Blastocystis spp. с различной степенью вирулентности позволил достичь значительно высоких результатов при определении генетических маркеров вирулентности в геноме бластоцист.

Предлагаемый метод обеспечивает:

1. Достаточно простой и универсальный способ идентификации простейших Blastocystis spp. в зависимости от степени выраженности вирулентных свойств на основе предложенных комбинаций эндонуклеаз рестрикции (Нае III, Pst I и Hind III).

2. Повышение эффективности определения вирулентности бластоцист за счет использования метода рестрикционного анализа ДНК простейших, основанного на выявлении не только потенциально патогенных штаммов бластоцист, которые выявляются традиционно биологическим методом исследования, но и позволяет выявить весь спектр генов в геноме бластоцист, обладающих свойствами патогенности.

Способ определения простейших Blastocysts spp. с различной степенью вирулентности, отличающийся тем, что осуществляют рестрикционный анализ бактериальной ДНК бластоцист с использованием комбинации эндонуклеаз рестрикции - Нае III, Pst I и Hind III, позволяющих идентифицировать простейших с различной степенью вирулентности, при этом применение рестриктазы Нае III позволяет проводить дифференциацию авирулентных штаммов бластоцист на основе наличия фрагментов размером 850 п.н. и вирулентных на основе наличия фрагментов ДНК размером от 550 до 10000 п.н., при помощи рестриктазы Pst I возможно определение бластоцист с умеренно выраженной вирулентностью на основе наличия фрагментов ДНК размером около 900 п.н., а применение рестриктазы Hind III позволяет типировать бластоцисты со слабовыраженной вирулентностью на основе фрагментов ДНК размером 700 п.н., а также высоковирулентные штаммы бластоцист на основе наличия фрагментов ДНК размером 380 и 600 п.н.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ оценки воспаления и/или резистентности к инсулину у животного путем количественного определения присутствия анализируемого вещества в сыворотке или плазме.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины и ветеринарии. Предложен биокомпозит для обеспечения восстановительных процессов после повреждения у млекопитающего, содержащий носитель, по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, содержащую гены, кодирующие VEGF и/или SDF-1, и клетки, обеспечивающие репаративную регенерацию.

Предложенная группа изобретений относится к области ветеринарии. Предложена иммуногенная композиция для собак, содержащая эффективное количество вирионов парвовируса с белком типа VP-2, содержащим нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биохимии и медицины. Предложена L-нуклеиновая кислота - антагонист MCP-1 и способ её детектирования.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу идентификации возбудителя чумы и оценки количества микробных клеток, идентифицируемых в качестве возбудителя чумы в исследуемых пробах посредством ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени, включающий следующие стадии: выделение ДНК микроорганизма из исследуемых проб, подготовка калибровочной панели, исследование выделенной ДНК в ПЦР с использованием специфических праймеров и зондов с флуоресцентной меткой, идентификация исследуемой ДНК как ДНК микробного или немикробного штамма по наличию нарастания флуоресцентного свечения или его отсутствию соответственно, определение по калибровочной панели концентрации ДНК в пробе.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ определения генотипа человека по полиморфизму в гене коллагена II типа COL2A1 С>А (rs1635529). Данный способ может быть использован при диагностике заболеваний пародонта в ротовой полости.

Изобретение относится к области биотехнологии и пищевой промышленности. Представлено растение ячменя, которое дает зерно и является гомозиготным, по меньшей мере, в двух локусах для введенных генетических вариаций, которые представляют собой: a) аллель, в которой удалена большая часть или все гены, кодирующие В-гордеин в локусе Hor2, и b) мутантную аллель в локусе Lys3 ячменя, так что зерно не содержит ни В-, ни С- гордеинов, и указанные генетические вариации присутствуют в ячмене линий Riso 56 и Riso 1508 соответственно, при этом отсутствие В-гордеинов является обнаружимым по отсутствию амплифицированной ДНК с использованием праймеров: 5'B1hor: 5'-CAACAATGAAGACCTTCCTC-3', 3'B1hor: 5'-TCGCAGGATCCTGTACAACG-3', а отсутствие С-гордеинов является обнаружимым по отсутствию 70 кДа полосы при исследовании спирторастворимого экстракта зерна посредством ДСН-ПААГ.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и касается тест-системы и способа для обнаружения РНК вируса болезни Шмалленберг. Предложенная тест-система включает праймер Schm U, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-САА ССА GAA GAA GGC САА GA-3', праймер Schm L, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-TCT GGC АСА GGA TTT GAG AC-3' и зонд Schm Z, имеющий последовательность 5'-[Hex] CCC CAC САА AAG TAA GAT CGA CAC [BHQ2]-3'.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается набора праймеров для выявления генетического материала (РНК) и дифференциации вируса парагриппа человека 1, 2, 3 и 4 типов в клинических образцах.

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ мультиплексной детекции представителей родов Aeromonas и Flavobacterium предусматривает постановку ПЦР в один этап с использованием двух пар синтезированных праймеров к участкам гена малой субъединицы рибосомальной РНК (16S rRNA) в режиме реального времени к участку гена малой субъединицы рРНК Aeromonas: А1 - 5'-TTCGGGCCTTGCGCGATTGG-3' и А2 - 5'-CGTGCTGGCAACAAAGGACAG-3', обеспечивающие амплификацию фрагмента размером 920 п.н.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ определения у спортсмена состояния утомления и состояния «перетренированности» по повышенной экспрессии гена триптофинил-тРНК-синтетазы (ТРСазы). Способ включает взятие у спортсмена контрольного образца до интенсивной тренировки и опытного образца после интенсивной тренировки. В качестве образца используется образец крови или соскоба или смыва с ротовой полости. Отбирают и промывают полученные клетки. Выделяют из клеток тотальную РНК. Проводят обратную транскрипцию, а затем амплификацию полученных кДНК. Оценивают экспрессии гена ТРСазы в опытном и контрольном образцах. Состояние утомления и состояние «перетренированности» определяется в случае значительного увеличения уровня экспрессии гена ТРСазы в опытном образце по сравнению с контрольным образцом, а именно более чем в 1,45 раза. Предложенное изобретение позволяет существенно повысить информативность, упростить и ускорить процедуру тестирования. 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 3 ил.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к применению QTL аллеля, ассоциированного с устойчивостью к Bemisia для придания устойчивости к Bemisia растения Capsicum annuum. Описан способ идентификации в гибридном растении Capsicum annuum локуса количественного признака («QTL»), который способствует устойчивости к Bemisia. Изобретение позволяет эффективно идентифицировать в гибридном растении Capsicum annuum QTL, который способствует устойчивости к Bemisia. 2 н.п. ф-лы, 11 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области медицины, генетической инженерии и молекулярной биологии. Предложен способ мониторинга рака молочной железы у субъекта. Способ включает определение отношения экспрессии гена парного бокса 2 к экспрессии гена бета-дефензина-1 (PAX2-к-DEFB1) в клетках, полученных из молочной железы субъекта, при этом отношение экспрессии PAX2-к-DEFB1 коррелирует с состояниями молочной железы. Также предложен набор для мониторинга рака молочной железы. Изобретение может быть использовано в медицине при лечении и мониторинге рака. 3 н. и 7 з. п. ф-лы, 40 ил., 8 табл., 17 пр.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Способ определения уровня экспрессии гена МСР1 (CCL2) предусматривает оценку количества его мРНК методом полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) с детекцией сигнала в реальном времени в образцах клеток, тканей и биологических жидкостей человека. Разработан набор для количественного определения мРНК МСР1, включающий комбинации олигонуклеотидных праймеров и флюоресцентных зондов для ОТ-ПЦР в реальном времени, для определения количества кДНК гена МСР1 и нормировочных генов RPL32, АСТВ, PII. Использование группы изобретений позволяет уменьшить ошибки вычисления, вносимые при использовании одного нормировочного гена без увеличения числа амплификаций, а также уменьшить ошибки вычислений, возникающие при упрощенном предположении о равенстве эффективности реакций амплификации кДНК MCP1 и нормировачного гена, имеющего место в методе ∆∆Ct. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается синтетических олигонуклеотидов-праймеров. Представленные праймеры фланкируют участки генов PB2, PB1, PA, NP, MP, NS низкопатогенных вирусов гриппа птиц и не дают перекрестных реакций с родственными видам. Разработанные праймеры позволяют получить полную информацию о генах вирусов гриппа птиц, их принадлежности к той или иной генетической линии вируса, наличии нуклеотидных/аминокислотных замен в геноме патогена. Представленное изобретение может быть использовано в диагностических целях идентификации вируса гриппа птиц в вирусологии и ветеринарии, а также для решения научно-исследовательских задач по изучению данного вируса. 1 ил., 2 табл., 4 пр.
Изобретение относится к области биохимии. Проводят количественную оценку эффективности олеиновой кислоты как переносчика РНК через биологические мембраны. В качестве биологической мембраны используют клетки сочных мешочков спелой пульпы плода медового помело из рода Citrus. В качестве переносчика РНК используют олеиновую кислоту, содержащуюся в препарате Виталанг-2 в количестве 10,8% и составляющую комплекс с РНК. Для сравнения используют препарат Виталанг-1, содержащий чистую РНК. Клетки помело заливают раздельно водными растворами препаратов Виталанг-1, Виталанг-2 и дистиллированной водой в количестве по 4,8 мл в каждом флакончике. Инкубируют в течение 22 ч при комнатной температуре. С помощью спектрофотометра измеряют оптическую плотность растворов против дистиллированной воды, определяя содержание РНК в клетках помело и окружающем растворе. В результате сравнения полученных значений оптической плотности растворов делают вывод о том, что Виталанг-2 проникает через биологические мембраны в 4,7-4,9 раза эффективнее Виталанга-1. Устанавливают, что спектры поглощения извлеченной из сочных мешочков РНК идентичны таковым для исходных соединений. Изобретение позволяет оценить эффективность олеиновой кислоты, используемой в качестве переносчика РНК через биологические мембраны. 1 пр.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и касается способа амплификации и детекции нуклеотидных последовательностей в реакционной смеси и набору, используемому в этом способе. Представленный способ включает предоставление исследуемого образца, реагентов для осуществления амплификации посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) и, по меньшей мере, четырех двояко-меченных зондов. Каждый из зондов является специфическим к своей нуклеотидной последовательности, подлежащей детекции, несет флуоресцентную метку и соответствующий тушитель флуоресценции, причем два зонда несут одинаковую метку и зонды, которые несут одинаковую метку, различаются по температуре плавления (Тпл., Tm). Далее проводят амплификацию нуклеотидных последовательностей и анализ кривой плавления при помощи двояко-меченных зондов в реакционной смеси. Охарактеризованное решение может быть использовано в мультиплексном ПЦР-анализе в реальном времени при диагностике биоагентов. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 9 ил., 21 табл., 2 пр.
Изобретение относится к области молекулярной биологии и генной инженерии. Предложены способ и набор для детекции малопредставленных фракций РНК в биологическом образце и для детекции микоплазменного загрязнения, для чего используют операции обратной транскрипции РНК в кДНК с использованием обратной транскриптазы Thermus thermophilus (rTth-pol) в условиях "горячего старта", инактивации ОТ обработкой хаотропным средством, детекции представляющей интерес кДНК посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР). Изобретение может быть использовано для тестирования на наличие микоплазм в медицине. 3 н. и 12 з. п. ф-лы, 3 табл., 3 пр.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены способ и набор для определения наличия у пациента повышенного риска обладания сердечно-сосудистым заболеванием или нарушением по полиморфным вариантам генов. Предложен способ идентификации пациента, который нуждается в ранней и/или агрессивной или профилактической терапии сердечно-сосудистого заболевания и способ лечения такого пациента. Предложенная группа изобретений обеспечивает эффективные способы и наборы для определения риска обладания сердечно-сосудистым заболеванием, что позволяет идентифицировать пациента, который нуждается в терапии сердечно-сосудистого заболевания. 4 н. и 6 з.п. ф-лы, 4 ил., 18 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается набора для выявления Ку-лихорадки методом ПЦР-РВ. Охарактеризованный набор содержит синтетические олигонуклеотиды, ограничивающие фрагмент гена groEL: GroEL F 5′ CTTCTACTGTTATGACGCCTTCTTTGC 3′ GroEL R 5′ CGCAAGTAGGCACCATTTCTGC 3′, и флуоресцентный зонд: GroEL Probe 5′ FAM-CACTTTCTCCATCGCTTCCGCAATAATA-TAMRA 3′. Изобретение может быть использовано в медицине, ветеринарии, клинической лабораторной диагностике для выявления ДНК бактерии Coxiella burnetii в пробах, а также для решения научно-исследовательских задач по изучению данного микроорганизма. 2 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области микробиологии и паразитологии микроорганизмов. Способ предусматривает рестрикционный анализ бактериальной ДНК бластоцист с использованием комбинации эндонуклеаз рестрикции - Нае III, Pst I и Hind III, позволяющих идентифицировать простейших с различной степенью вирулентности. При этом применение рестриктазы Нае III позволяет проводить дифференциацию авирулентных штаммов бластоцист на основе наличия фрагментов размером 850 п.н. и вирулентных на основе наличия фрагментов ДНК размером от 550 до 10000 п.н. При помощи рестриктазы Pst I выявляют бластоцисты с умеренно выраженной вирулентностью на основе наличия фрагментов ДНК размером около 900 п.н. Применение рестриктазы Hind III позволяет типировать бластоцисты со слабовыраженной вирулентностью на основе фрагментов ДНК, размером 700 п.н., а также высоковирулентные штаммы бластоцист на основе наличия фрагментов ДНК, размеров 380 и 600 п.н. Способ позволяет повысить эффективность определения вирулентности простейших. 6 ил.

Наверх