Способ экспресс-определения адгезивного потенциала микроорганизмов


 

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

Владельцы патента RU 2537128:

Куликов Сергей Николаевич (RU)
Фассахов Рустэм Салахович (RU)
Федеральное бюджетное учреждение науки "Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)

Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской бактериологии и медицинской микологии, и описывает способ количественной оценки адгезивных свойств условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от человека и объектов окружающей среды. Способ включает предварительную сорбцию в лунках полистиролового планшета специфического лиганда, выбранного из ряда: гемоглобин, миоглобин, коллаген, фибриноген, фибронектин, иммуноглобулин А, добавление в лунки планшета с сорбированным лигандом суспензии клеток микроорганизма, инкубирование суспензии клеток в лунках планшета в течение 15 минут, отбор аликвоты суспензии из лунки и добавление ее в лунки другого или этого же планшета, содержащие водный раствор соли 0,5% натрия хлористого или 0,2 М фосфата натрия, при этом оценку уровня адгезии клеток бактерий проводят путем определения уменьшения оптической плотности полученных разбавленных суспензий при длине волны 600 нм при сравнении их с контрольными вариантами лунок, не содержащих лиганд. Изобретение характеризуется высокой скоростью проведения определения уровня адгезии микроорганизмов к лигандам различной природы, высокой воспроизводимостью результатов, использованием минимального количества биомассы микроорганизмов, отсутствием необходимости использования опасных химических реагентов и может быть использовано для in vitro характеристики вирулентных свойств условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от человека и объектов окружающей среды, по уровню их адгезии к лигандам различной природы. 7 табл., 7 пр.

 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в медицинской бактериологии и медицинской микологии для количественной оценки адгезивных свойств условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от человека и объектов окружающей среды, для характеристики их вирулентных свойств in vitro по уровню адгезии к лигандам различной природы.

Существуют различные подходы в количественном определении уровня адгезии клеток микроорганизмов (бактерий и дрожжеподобных грибов) к лигандам различной природы.

Известен способ количественного определения адгезии клеток микроорганизмов к коллагену и фибронектину, основанный на окрашивании специфически адгезированных клеток красителем - кристаллическим фиолетовым, однако, такой способ требует дофиксации клеток с помощью глутарового альдегида, использования дополнительной процедуры для разрушения клеток с использованием детергента Triton Х-100 [1].

Более простым представляется подход с использованием мембран, в которых заключен соответствующий лиганд (например, гемоглобин) [2]. В этом случае клетки микроорганизмов связываются с мембраной, несущей лиганды, с помощью специфических адгезинов, расположенных на поверхности их клеточных стенок. Количественный уровень адгезии в этом случае определяется при подсчете количества клеток микроорганизмов, адгезированных на мембране с лигандами, либо по уменьшению оптической плотности суспензии клеток микроорганизма после взаимодействия с мембраной. Однако такой подход требует отработанного подхода в изготовлении мембран с использованием специфических компонентов - нитроцеллюлозы, органических растворителей. На практике требуется использование сравнительно большого количества мембран (для достижения большой площади рабочей поверхности - нескольких квадратных сантиметров), а также большого объема (несколько миллилитров) суспензии микроорганизмов, что не всегда позволяет использовать этот метод при малом количестве биоматериала, например при наличии одной небольшой колонии микроорганизма, выросшей на твердой (агаризованной) питательной среде.

Наиболее близким к нашему изобретению можно отнести способ определения адгезии микроорганизмов к лигандам, сорбированных на полистироловую поверхность 96-луночных планшет [3]. Этот подход позволяет избавиться от применения различных, в том числе небезопасных, веществ, а также свести работу к использованию микрообъемов (порядка 100 мкл), не требующих большого количества исходного биоматериала. Однако описанное изобретение обладает рядом недостатков. Во-первых, для количественной оценки адгезии клеток микроорганизмов предлагается либо добавление в лунки планшета (содержащие адгезированные клетки) жидкой питательной среды, либо отбор аликвоты суспензии микроорганизмов из лунок планшета в жидкую (или посев на твердую) питательную среду с последующей инкубацией и оценкой роста (подсчета образовавшихся колоний) культуры микроорганизмов, что позволяет получить результаты только по прошествии существенного количества времени (от 6 до 48 ч в зависимости от условий инкубации и вида микроорганизма). Кроме того, в этом случае не учитывается возможность различия в скорости роста у разных штаммов одного и того же вида микроорганизма, что может искусственно увеличивать или нивелировать реальное различие в адгезивном потенциале конкретных штаммов. Во-вторых, использование для количественной оценки адгезированных клеток микроорганизмов определения активности бактериальных ферментов у адгезированных клеток является практически непригодным в силу вариации самой активности (количества) ферментов у различных штаммов одного и того же вида микроорганизма [4] и, соответственно, отсутствия абсолютной корреляции между уровнем ферментативной активности и уровнем адгезивного потенциала. Этот подход также может увеличивать или нивелировать реальное различие в адгезивном потенциале сравниваемых штаммов.

В связи с этим задачей заявленного изобретения является разработка простого способа, позволяющая быстро, менее чем за 1 час, с использованием минимального количества биомассы микроорганизмов, в микрообъемах, без дополнительного использования химических реагентов, количественно определять уровень адгезии клеток микроорганизмов (бактерий и дрожжеподобных грибов) к лигандам различной природы.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения, который предусматривает предварительное сорбирование в лунках полистиролового планшета специфического лиганда, добавление в лунки планшета суспензии клеток микроорганизмов, непродолжительную инкубацию суспензии клеток в лунках планшета, последующий отбор аликвоты суспензии из лунки и добавление ее в лунки другого или этого же планшета, содержащие водный раствор соли (например, 0,5% натрия хлористого или 0,2 М фосфата натрия), с последующей оценкой уровня адгезии клеток бактерий путем определения уменьшения оптической плотности полученных разбавленных суспензий при длине волны 600 нм. На основании полученных данных по оптической плотности определяют индекс адгезии. Индекс адгезии (в процентах) высчитывают по формуле:

ИА=100-100×(ОП600опыт/ОП600контроль),

где

ОП600опыт - значение оптической плотности суспензии при 600 нм, отобранной из лунки, содержащей лиганд;

ОП600контроль - значение оптической плотности суспензии при 600 нм, отобранной из лунки не содержащей лиганд.

Чем выше индекс адгезии, тем выше уровень адгезии штамма микроорганизма к выбранному лиганду.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка быстрого способа определения уровня адгезии микроорганизмов к лигандам различной природы, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов, использованием минимального количества биомассы микроорганизмов, использованием минимального количества биомассы микроорганизмов, в микрообъемах, отсутствием необходимости использования опасных химических реагентов.

Пример 1. Определение уровня адгезии штаммов Staphylococcus aureus к гемоглобину. В лунки планшета предварительно сорбируют лиганд - человеческий гемоглобин. Для этого гемоглобин растворяют в 0,2 М натрий-фосфатном буферном растворе с рН 7,4 из расчета 20 мкг/мл. Приготовленный раствор в объеме 50 мкл вносят в лунки планшета, инкубируют в течение 24 ч при 4°C. После этого лунки планшета трижды промывают 0,2 М натрий-фосфатным буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,05% твин-20, заливая по 100 мкл в каждую лунку, затем планшет осушаем путем вытряхивания остатка жидкости. Подготовленные таким образом планшеты можно хранить в течение года при 4°C в сухих условиях. В готовые лунки планшета вносим по 200 мкл суспензии Staphylococcus aureus в 0,2 М натрий-фосфатном буферном растворе с рН 7,4 с оптической плотностью при 600 нм в диапазоне от 0,500 до 0,600. Инкубируем в течение 15 минут, после этого отбираем 100 мкл суспензии из лунки и переносим ее в другую лунку, содержащую 100 мкл 0,2 М натрий-фосфатный буферный раствор с рН 7,4, перемешиваем разведенную суспензию и далее измеряем оптическую плотность полученных разведенных суспензий при 600 нм. В качестве контрольных вариантов используются лунки, не содержащие гемоглобин. Результаты представлены в таблице 1.

Пример 2. Определение уровня адгезии штаммов Staphylococcus aureus проводят аналогично примеру 1, но в качестве специфического лиганда, сорбированного на планшете, используют миоглобин. Результаты представлены в таблице 2.

Пример 3. Определение уровня адгезии штаммов Staphylococcus aureus проводят аналогично примеру 1, но в качестве специфического лиганда, сорбированного на планшете, используют коллаген. Результаты представлены в таблице 3.

Пример 4. Определение уровня адгезии штаммов Staphylococcus aureus проводят аналогично примеру 1, но в качестве специфического лиганда, сорбированного на планшете, используют фибронектин. Результаты представлены в таблице 4.

Пример 5. Определение уровня адгезии штаммов Staphylococcus aureus проводят аналогично примеру 1, но в качестве специфического лиганда, сорбированного на планшете, используют фибриногену. Результаты представлены в таблице 5.

Пример 6. Определение уровня адгезии штаммов Staphylococcus aureus проводят аналогично примеру 1, но в качестве специфического лиганда, сорбированного на планшете, используют иммуноглобулин A (IgA). Результаты представлены в таблице 6.

Пример 7. Определение уровня адгезии проводят аналогично примеру 1, но в качестве микроорганизма используют дрожжеподобный гриб Candida albicans. Результаты представлены в таблице 7.

Таблица 1
Определение уровня адгезии клеток Staphylococcus aureus к гемоглобину
Штамм S. aureus с кожи здорового человека Штамм S. aureus с кожи человека с атопическим дерматитом
S.aureus АТСС 25923
контроль гемоглобин контроль гемоглобин контроль гемоглобин
значение ОП 600 нм
0,300 0,280 0,310 0,285 0,315 0,269
Индекс адгезии, %
6,7 8,0 14,6
Таблица 2
Определение уровня адгезии клеток Staphylococcus aureus к миоглобину
Штамм S. aureus с кожи здорового человека Штамм S. aureus с кожи человека с атопическим дерматитом
S. aureus АТСС 25923
контроль миоглобин контроль миоглобин контроль миоглобин
значение ОП 600 нм
0,300 0,283 0,310 0,288 0,315 0,270
Индекс адгезии, %
5,6 7,0 14,2
Таблица 3
Определение уровня адгезии клеток Staphylococcus aureus к коллагену
Штамм S. aureus с кожи здорового человека Штамм S. aureus с кожи человека с атопическим дерматитом
S. aureus АТСС 25923
контроль коллаген контроль коллаген контроль коллаген
значение ОП 600 нм
0,300 0,285 0,310 0,290 0,315 0,279
Индекс адгезии, %
5,0 6,4 11,4
Таблица 4
Определение уровня адгезии клеток Staphylococcus aureus к фибронектину
Штамм S. aureus с кожи здорового человека Штамм S. aureus с кожи человека с атопическим дерматитом
S. aureus АТСС 25923
контроль фибронектин контроль фибронектин контроль фибронектин
значение ОП 600 нм
0,300 0,288 0,310 0,295 0,315 0,287
Индекс адгезии, %
4,0 4,8 8,8
Таблица 5
Определение уровня адгезии клеток Staphylococcus aureus к фибриногену
Штамм S. aureus с кожи здорового человека Штамм S. aureus с кожи человека с атопическим дерматитом
S. aureus АТСС 25923
контроль фибриноген контроль фибриноген контроль фибриноген
значение ОП 600 нм
0,300 0,285 0,310 0,288 0,315 0,285
Индекс адгезии, %
5,0 7,0 9,5
Таблица 6
Определение уровня адгезии клеток Staphylococcus aureus к IgA
Штамм S. aureus с кожи здорового человека Штамм S. aureus с кожи человека с атопическим дерматитом
S. aureus ATCC 25923
контроль IgA контроль IgA контроль IgA
значение ОП 600 нм
0,300 0,291 0,310 0,297 0,315 0,295
Индекс адгезии, %
3,0 4,1 6,3
Таблица 7
Определение уровня адгезии клеток Candida albicans к гемоглобину
Штамм С.albicans с кожи здорового человека Штамм С.albicans с кожи человека с атопическим дерматитом
Candida albicans музейный штамм №4
контроль гемоглобин контроль гемоглобин контроль гемоглобин
значение ОП 600 нм
0,300 0,275 0,310 0,280 0,315 0,273
Индекс адгезии, %
8,3 9,6 13,3

ЛИТЕРАТУРА

1. Pynnonen M., Stephenson R.E., Schwartz K., Hemandez M., Boles B.R. / Hemoglobin promotes Staphylococcus aureus nasal colonization // PLoS Pathogens, 2011.

2. Лисовская С.А. / Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук «Новый подход к оценке патогенного потенциала клинических штаммов Candida albicans» // Казань, 2008. 25 с.

3. Тюрин Ю.А., Фассахов Р.С., Мустафин И.Г. / Способ определения адгезии Staphylococcus spp.к гемопротеинам // Патент RU №2393229.

4. Баязитова Л.Т., Тюрин Ю.А., Куликов С.Н., Долбин Д.А., Фассахов Р.С. / Исследование антибактериальной активности препарата «Скин-кап» в отношении Staphylococcus aureus при местной терапии атопического дерматита // Практическая Медицина, 2009, №3 (35), с.89-91.

Способ определения адгезивного потенциала микроорганизмов, характеризующийся тем, что в лунках полистиролового планшета сорбируют специфический лиганд, выбранный из ряда: гемоглобин, миоглобин, коллаген, фибриноген, фибронектин, иммуноглобулин А, добавляют в лунки планшета с сорбированным лигандом суспензию клеток микроорганизма, проводят инкубацию суспензии клеток в лунках планшета в течение 15 минут, отбирают аликвоту суспензии из лунки и добавляют ее в лунки другого или этого же планшета, содержащие водный раствор соли 0,5% натрия хлористого или 0,2 М фосфата натрия и оценивают уровень адгезии клеток бактерий путем определения уменьшения оптической плотности полученных разбавленных суспензий при длине волны 600 нм при сравнении их с контрольными вариантами лунок, не содержащих лиганд.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биологии и токсикологической химии и может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсикологических, экспертно-криминалистических и ветеринарных лабо-раторий.

Изобретение относится к биологии и токсикологической химии и может быть использовано в практике химико-токсикологических, экспертно-криминалистических и клинических лабораторий.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической, лабораторной диагностике, микробиологическим методам исследования, и направлено на стандартизацию исследования слюны методом клиновидной дегидратации/кристаллографии.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для обоснования предельно допустимых концентраций (ПДК) тяжелых металлов в крови детей, проживающих в условиях загрязненной среды обитания, по критериям риска для здоровья при хронической многосредовой экспозиции.
Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ экспресс-диагностики острых кишечных инфекций (ОКИ), включающий выявление маркеров-индикаторов этиологии ОКИ, с использованием иммунологического лабораторного исследования, отличается тем, что этиологию ОКИ устанавливают у детей ранней возрастной категории, предпочтительно у новорожденных, при этом определяют концентрацию в копрофильтрате цитокина - интерлейкина IL-10 и наличие хронической фетоплацентарной недостаточности (ХФПН), после чего рассчитывают вероятность (Р) бактериальной этиологии ОКИ, причем значение Р больше 50% свидетельствует о бактериальной этиологии ОКИ, а меньше 50% свидетельствует об отсутствии бактериальной этиологии ОКИ, и необходимости проведения второго этапа диагностики, на котором определяют концентрацию в копрофильтрате цитокина - интерлейкина IL-4, выявляют срок прикладывания к груди, а также вид вскармливания, при этом рассчитывают вероятность (Р) вирусной либо вирусно-бактериальной этиологии ОКИ, причем значение Р больше 50% свидетельствует о вирусной этиологии ОКИ, а меньше 50% свидетельствует о вирусно-бактериальной ОКИ.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для диагностики генетического риска развития осложненного клинического течения урогенитальной хламидийной инфекции у человека.
Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и гинекологии, и касается диагностики недифференцированной дисплазии соединительной ткани (НДСТ) у женщин с потерей беременности в анамнезе.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к стоматологии, и может быть использована для диагностирования наличия заболевания ротовой полости у субъекта. Для этого предложены устройство и способ.

Изобретение относится к спортивной медицине, а именно к способу донозологической диагностики здоровья спортсменов. Проводят комплексное клинико-лабораторное исследование спортсмена через 12-16 часов после прекращения тяжелой физической нагрузки.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ прогнозирования эффективности лечения пациентов с неходжкинскими злокачественными лимфомами высокой степени злокачественности.
Группа изобретений относится к биотехнологии и может быть использована для биотестирования токсичности объектов окружающей среды. Заявлены штамм бактерий Vibrio aquamarinus, способ определения токсичности проб с его помощью и применение штамма в качестве тест- культуры для определения химической токсичности проб.
Изобретение относится к области контроля качества дезинфекции. Способ предусматривает дезинфекцию помещений, отбор тест-объектов, в качестве которых используют суспензию Bacillus subtilis штамма АТСС-РТА 6737 (РВ6), сорбированную на носителе - фильтровальной бумаге с клейким участком поверхности.
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и представляет собой способ идентификации кластера генов, кодирующих стафилококковые белки, являющиеся экзотоксинами.

Представленные решения касаются способа генерирования заквасочной культуры, заквасочной культуры и способа ферментации с использованием такой заквасочной культуры.
Изобретение относится к области микробиологии. Готовят две взвеси.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для дифференцированного определения числа жизнеспособных актинобактерий рода Rhodococcus, иммобилизованных в нерастворимом гелевом носителе.
Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает отбор проб почвы, внесение в почву метсульфурон метила (МСМ) в заданном количестве с последующей инкубацией и определением удельной метаболической активности (УМА) сапрофитного комплекса почвы при помощи мультисубстратного тестирования (МСТ) и учета числа КОЕ (колониеобразующих единиц) на разбавленной агаризованной среде.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен способ выращивания колоний микробных клеток на поверхности пористой пластины.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при мониторинговых эколого-микробиологических исследованиях контроля качества морской воды для определения численности нефтеокисляющих микроорганизмов.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ оценки токсичности продукции из полимерных и текстильных материалов.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения коклюшного компонента комплексных вакцин. Представленный способ включает выращивание культуры B. pertussis на плотных питательных средах Борде-Жангу и/или КУА, селекцию выросших колоний по морфологическим признакам, пересев отобранных колоний, наращивание их бактериальной массы, смыв культуры, доведение мутности полученных коклюшных суспензий до 10 международных оптических единиц, определение в них с помощью реакции агглютинации количественного содержания агглютиногенов 1, 2, 3 и отбор коклюшных суспензий, в которых содержание агглютиногенов выявляется при разведении типоспецифической сыворотки 1:3200 и выше. Выявленная культура B. pertussis, активно экспрессирующая агглютиногены 1, 2, 3, после лиофильного высушивания используется для производства коклюшного компонента комплексных вакцин. Охарактеризованное изобретение позволяет получить высокоиммуногенный коклюшный компонент комплексных вакцин. 1 ил., 5 табл., 1 пр.
Наверх