Мотилин-подобное пептидное соединение, обладающее приданной ему трансмукозальной абсорбционной способностью

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой полипептид (варианты) и фармацевтическую композицию, включающую данный полипептид. Полипептид имеет последовательность, представленную нижеследующей формулой 1:

Связи между аминокислотами, кроме X1-Val связи, являются амидными связями. Связь X1-Val представляет собой амидную связь или связь, представленную нижеследующей формулой 2 X1 представляет собой ароматическую аминокислоту или гетероароматическую аминокислоту, Х2 представляет собой пролин или саркозин, Х3 представляет собой глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту, Х4 представляет собой метионин или лейцин, Х5 представляет собой аспарагин или пролин. Предложенное изобретение может быть использовано в медицине для лечения заболевания, связанного с нарушением функции желудочно-кишечного тракта. Предложенное изобретение позволяет эффективно лечить заболевания, связанные с нарушением функции желудочно-кишечного тракта. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 5 ил., 4 табл., 5 пр.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к мотилин-подобным пептидным соединениям, которые обладают более высокой активностью в отношении стимуляции моторики пищеварительного тракта и более высокой абсорбционной способностью после трансмукозального введения, которые используют для лечения состояний, характеризуемых нарушениями функций желудочно-кишечного тракта, таких как функциональная диспепсия, диабетический гастропарез, рефлюксная гастроэзофагеальная болезнь, синдром раздраженного кишечника, чрезмерное развитие микрофлоры тонкого кишечника, псевдонепроходимость толстой кишки, паралитическая непроходимость кишечника, хроническая идиопатическая псевдообструкция кишечника и послеоперационная непроходимость кишечника.

Известный уровень техники

Мотилин представляет собой физиологически активный пептид из 22 аминокислот, выделенный из абдоминальной гладкой мышцы, и его структура была впервые идентифицирована в 1973 посредством выделения свиного мотилина (непатентные документы 1 и 2). В 1995 был выделен и идентифицирован человеческий мотилин как имеющий такую же структуру, как и свиной мотилин (непатентный документ 3).

Известно, что мотилин обладает физиологической функцией, которая связана с межпищеварительным мигрирующим комплексом (в дальнейшем в сокращенном виде IMC), который возникает на стадии голодания. IMC представляет собой физиологическую функцию, благодаря которой содержимое желудочно-кишечного тракта, такое как эпителий и слизистая оболочка, которые были отшелушены с его внутренней стенки, а также секреторные жидкости, выделение которых непосредственно связано с процессом переваривания пищи, принудительно продвигается к его более нижним отделам, тем самым очищая его внутреннюю часть. У здоровых людей мотилин секретируется из двенадцатиперстной кишки и тощей кишки с интервалами приблизительно 100 минут на стадии голодания, при этом IMC проявляется при увеличении уровня мотилина в плазме (непатентный документ 4); IMC индуцируется, когда мотилин вводят собаке, обезьяне или человеку (непатентные документы 5, 6 и 7); физиологическое проявление IMC подавляется введением антимотилиновой сыворотки; принимая во внимание эти и другие полученные данные, полагают, что функции желудочно-кишечного тракта, такие как переваривание пищи и выделение пищеварительного секрета, поддерживаются в нормальном состоянии в результате секреции мотилина, который индуцирует IMC, заставляя химус перемещаться в дистальном направлении внутри желудочно-кишечного тракта (непатентный документ 8).

Что касается связи между нарушением функции IMC и заболеванием, то имеются сообщения о том, что, когда моторика желудочно-кишечного тракта IMC снижается, химус внутри желудочно-кишечного тракта накапливается внутри кишечника, вызывая анормальный рост кишечных бактерий, которые, в свою очередь, продуцируют эндотоксины, вызывая такие желудочно-кишечные состояния, как чрезмерное выделение газа, вспучивание живота, диарея и боль в животе (непатентный документ 9). В частности, в отношении болезней, связанных с нарушениями функций желудочно-кишечного тракта, таких как функциональная диспепсия, постоперационная непроходимость кишечника и хроническая идиопатическая псевдообструкция кишечника, были сообщения о том, что проявление IMC снижено или не наблюдается вовсе (непатентный документ 13) и что снижение в секреции эндогенного мотилина in vivo или снижение действия мотилина связано с нарушениями или снижением двигательных функций пищеварительного тракта (непатентный документ 14). Синдром раздраженного кишечника представляет собой хроническое кишечное заболевание, которое в отсутствие какого-либо из основных заболеваний, таких как воспаления и новообразования, но вследствие функциональных нарушений в нижней части желудочно-кишечного тракта, обычно в толстой кишке, вызывает хронические неприятные ощущения в животе, иллюстрируемые болью в животе и вспучиванием живота, или нарушения перистальтики кишечника, такие как запор и диарея. Сообщалось, что, по меньшей мере, у нескольких пациентов, у которых развился синдром раздраженного кишечника, произошли изменения в кишечной флоре, заключающиеся как в изменении бактериального типа, так и анормальном росте бактерий и т.д. (непатентный документ 9), и что накопление химуса желудочно-кишечного тракта внутри кишечного тракта вследствие снижения функции IMC может быть причиной изменения в кишечной флоре.

Доступные в настоящее время лекарственные средства первого выбора против заболеваний, связанных с вышеупомянутыми нарушениями функций пищеварительного тракта, представляют собой лекарственные средства для внутреннего применения, действие которых направлено на улучшение двигательной функции желудочно-кишечного тракта, примерами которых являются антагонисты рецептора допамина, селективные агонисты рецептора 5-HT4 серотонина и парасимпатические стимулирующие средства. В самом деле, имеется несколько случаев, когда лечение этими терапевтическими средствами показало временное улучшение симптомов, однако во многих других случаях никакого терапевтического действия не наблюдалось, и врачи и пациенты получают лишь небольшое удовлетворение от использования этих внутренних лекарственных средств для улучшения моторики пищеварительного тракта. Поэтому существует крайне высокая потребность в разработке терапевтических средств, основанных на новом механизме действия, и ожидается, что это могло бы привести к уменьшению интенсивности симптомов или излечению заболевания путем введения извне агонистов рецептора мотилина пациентам с нарушениями функций желудочно-кишечного тракта с тем, чтобы нормализовать функции их пищеварительного тракта.

С того момента, как было сообщено, что эритромицин и родственные ему соединения обладают активностью, свойственной агонистам мотилина, были проведены клинические испытания с низкомолекулярными агонистами мотилина на пациентах с нарушениями функций желудочно-кишечного тракта (непатентные документы 19 и 20), и в настоящее время, кроме того, имеется множество таких низкомолекулярных агонистов мотилина, которые были подвергнуты клиническим испытаниям в качестве пероральных лекарственных средств (непатентные документы 21 и 22). Однако по той или иной причине, такой как проявление побочных действий, которые не имеют ничего общего с действием агонистов мотилина (т.е. ингибирование HERG, сперматогенный дефект и канцерогенное действие), или ослабление эффективности лекарственного средства вследствие повторного введения, разработка лекарственных препаратов, содержащих агонисты мотилина в качестве активного ингредиента, была приостановлена и ни одно из них до настоящего времени не представлено на рынке в качестве лекарственного препарата для улучшения функций желудочно-кишечного тракта.

Кроме того, были проведены клинические испытания на пациентах, страдающих нарушениями функций желудочно-кишечного тракта, используя нативный мотилин или пептидные агонисты мотилина в виде пептидных соединений (непатентные документы 15 и 16). Однако единственным путем введения, о котором когда-либо сообщалось в связи с клиническими испытаниями и экспериментами на животных с использованием этих пептидных соединений, было внутривенное введение, и из-за трудности, возникающей в связи с осуществлением пролонгированного, повторного введения пациентам, терапевтическая эффективность соединений еще не нашла своего подтверждения.

Примерами мотилин-подобных пептидных соединений, которые были разработаны до настоящего времени, являются атилмотин от Baxter (патентный документ 1) и SK-896 от SANWA KAGAKU (патентный документ 2). Первое представляет собой соединение, созданное с целью улучшения периода полураспада in vivo и при помощи опыта по метаболизму, используя супернатант гомогената почки, которая представлена в качестве основного органа для метаболизма мотилина (непатентный документ 17), это соединение, как было подтверждено, обладает более высокой метаболической стабильностью (патентный документ 1), и его период полураспада в плазме составляет около 10 минут, приблизительно в три раза длиннее, чем период полураспада мотилина (непатентный документ 18). Последнее представляет собой соединение, предназначенное для реализации более эффективного продуцирования. Оба соединения поддерживают активность в усилении моторики пищеварительного тракта, сравнимую с активностью мотилина. Однако, как и в случае мотилина, путь введения этих соединений ограничен внутривенным путем, и каждое соединение создает проблему, связанную с тем, что его использование ограничено лечением в медицинских учреждениях с их помещением и оборудованием, где оно не может использоваться на протяжении пролонгированного периода времени. Следовательно, к настоящему времени не было обнаружено лекарственного средства, действие которого было бы основано на присущем мотилину действии, т.е. поддержании функций желудочно-кишечного тракта обычным путем перемещения химуса внутри пищеварительного тракта в направлении толстой кишки, с тем результатом, чтобы к тому же еще была подтверждена его терапевтическая эффективность.

Был разработан пептид, имеющий замещение метионина в положении 13 на лейцин (патентный документ 3). Однако биологическая активность этого пептида оказалась сравнимой с биологической активностью мотилина, и путь его введения также ограничивается внутривенным путем, тем самым оставляя проблему невозможности пролонгированного использования по-прежнему нерешенной.

С учетом вышеизложенного существует потребность в разработке нового терапевтического лекарственного средства, основанного на присущем мотилину действии, при этом пептидный агонист мотилина должен рассматриваться в качестве фармацевтического средства, которое может вводиться на протяжении пролонгированного периода времени неинвазивным путем.

Перечень ссылок

Ссылка на патентные документы

Патентный документ 1: JP Hei 7-70178 A

Патентный документ 2: JP Hei 7-42319 B

Патентный документ 3: JP Sho 52-46068 A

Ссылка на непатентные документы

Непатентный документ 1: Brown J et al., Can J Biochem, 51, 533 (1973)

Непатентный документ 2: Schubert H et al., Can J Biochem, 52, 7 (1974)

Непатентный документ 3: De Clercq et al., Regul Pept, 55, 79 (1995)

Непатентный документ 4: Itoh, Nisshoushi (Journal of the Japanese Society of Gastrogenterology) 93, 517 (1996)

Непатентный документ 5: Nakaya M et al., Peptides, 4, 439 (1983)

Непатентный документ 6: Yogo K et al., Dig Dis Sci, 52, 3112 (2007)

Непатентный документ 7: Haans J et al., Neurogastroenterol Motil, 18, 637 (2006)

Непатентный документ 8: Kusano et al, MB Gastro, 1, 47 (1991)

Непатентный документ 9: Pimentel M et al., Dig Dis Sci, 47, 2639 (2002)

Непатентный документ 10: Pardo A et al., Hepatology 31, 858 (2000)

Непатентный документ 11: Castiglione F et al., Aliment Pharmacol Ther. 18, 1107 (2003)

Непатентный документ 12: Henry C. Lin, JAMA. 292, 852 (2004)

Непатентный документ 13: Labo G et al., Gastroenterology, 90, 20 (1986)

Непатентный документ 14: Kusano M et al., Am J Gastroenterol, 92, 481 (1997)

Непатентный документ 15: Kamerling I et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 284, G776 (2003)

Непатентный документ 16: Park M-I et al., Neurogastroenterol Motil, 18, 28 (2006)

Непатентный документ 17: Jenssen TG et al., Scand J Gastroenterol, 19, 717 (1984)

Непатентный документ 18: Peeters TL et al., Neurogastroenterol Motil, 18, 1 (2006)

Непатентный документ 19: Janssens J et al., N Engl J Med, 322, 1028 (1990)

Непатентный документ 20: Stacher G et al., Gut, 34, 166 (1993)

Непатентный документ 21: Choi MG et al., J Pharmacol Exp Ther, 285, 37 (1998)

Непатентный документ 22: Netzer P et al., Aliment Pharmacol Ther, 16, 1481 (2002)

Краткое изложение существа изобретения

Техническая задача изобретения

Целью настоящего изобретения является разработка мотилин-подобных пептидных соединений, которые поддерживают присущую нативному мотилину стимулирующую активность моторики пищеварительного тракта и которые были бы адаптированы для проявления более высокой абсорбционной способности после трансмукозального введения.

Решение технической задачи

Для решения этой задачи авторы сначала высказали предположение, что мотилин может разлагаться после неинвазивного трансмукозального введения, и осуществили эксперимент по деградации мотилина, используя супернатант гомогената легкого. В результате этого было обнаружено, что мотилин разлагается, и путем идентифицирования продукта деградации было установлено, что путь деградации мотилина состоит в том, что его С конец подвергается ферментативному расщеплению под действием дикарбоксипептидазы.

Исходя из этих результатов, авторы заместили глицин в положении 21 мотилина пролином, для того чтобы ингибировать опосредованную дикарбоксипептидазой деградацию С конца, с получением мотилин-подобных пептидных соединений, демонстрирующих более высокую абсорбционную способность после трансмукозального введения, что и привело к завершению настоящего изобретения. Кроме того, поскольку N концевая часть фенилаланина, как было обнаружено, подвергается деградации, было показано, что замена амидной связи между первой и второй аминокислотами от N конца непептидной связью, связью -psi[CH₂NH], также может способствовать дополнительному улучшению метаболической стабильности.

(i) В частности, настоящее изобретение обнаружило, что вышеизложенная задача может быть достигнута путем получения пептидных соединений, которые сохраняют активность в стимулировании моторики пищеварительного тракта, сравнимую со стимулирующей активностью нативного мотилина, и которые к тому же имеют более высокую абсорбционную способность после трансмукозального введения, причем указанные соединения представляют собой соединения, содержащие последовательность, представленную нижеследующей формулой 1, которая характеризуется замещением аминокислоты в положении 21 пролином:

X1 Val X2 Ile Phe Thr Tyr Gly X3 Leu Gln Arg X4 Gln Glu Lys Glu Arg X5 Lys Pro Gln (формула 1) (SEQ ID NO: 2)

[где все связи между аминокислотами, кроме связи X1-Val, являются амидными связями;

X1 представляет собой ароматическую аминокислоту или гетероароматическую аминокислоту;

связь X1-Val представляет собой амидную связь или связь, представленную нижеследующей формулой 2

(формула 2)

X2 представляет собой пролин или саркозин;

X3 представляет собой глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту;

X4 представляет собой метионин или лейцин;

X5 представляет собой аспарагин или пролин],

или их фармацевтически приемлемые соли.

Кроме того, настоящее изобретение охватывает нижеследующее:

(ii) Соединение или его фармацевтически приемлемую соль, представленные в (i), где X1 в формуле 1 представляет собой α-аминокислоту, такую как фенилаланин (Phe), тирозин (Tyr), или триптофан (Trp), или β-гомофенилглицин (Phg(C#CH₂)), или ацетилнафтилаланин (Ac-Nal).

(iii) Соединение или его фармацевтически приемлемую соль, представленные в (ii), где X1 в формуле 1 представляет собой фенилаланин (Phe) или β-гомофенилглицин.

(iv) Соединение, которое изображено последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3-15, или его фармацевтически приемлемую соль.

(v) Соединение, которое изображено последовательностью SEQ ID NO: 4, или его фармацевтически приемлемую соль.

(vi) Соединение, которое изображено последовательностью SEQ ID NO: 6, или его фармацевтически приемлемую соль.

(vii) Соединение, которое изображено последовательностью SEQ ID NO: 8, или его фармацевтически приемлемую соль.

(viii) Фармацевтическую композицию для лечения заболевания, связанного с нарушением функции пищеварительного тракта, которая содержит пептидное соединение или его фармацевтически приемлемую соль, изложенные в любом из (i)-(vii).

(ix) Фармацевтическую композицию, представленную в (viii), где заболевание, связанное с нарушением функции желудочно-кишечного тракта, включает снижение, относительно базового уровня, моторной активности пищеварительного тракта.

(x) Фармацевтическую композицию, представленную в (viii), где заболевание, связанное с нарушением функции пищеварительного тракта, представляет собой функциональную диспепсию, диабетический гастропарез, рефлюксную гастроэзофагеальную болезнь, синдром раздраженного кишечника, чрезмерное развитие микрофлоры тонкого кишечника, псевдонепроходимость толстой кишки, паралитическую непроходимость кишечника, хроническую идиопатическую псевдообструкцию кишечника или послеоперационную непроходимость кишечника.

(xi) Фармацевтическую композицию, представленную в любом из (viii)-(x), которая предназначена для трансмукозального введения.

(xii) Фармацевтическую композицию, представленную в (xi), где трансмукозальное введение представляет собой легочное или интраназальное введение.

(xiii) Фармацевтическую композицию, представленную в (xii), где трансмукозальное введение представляет собой интраназальное введение.

(xiv) Способ лечения состояний, характеризуемых снижением, относительно базового уровня, моторной активности пищеварительного тракта, таких как функциональная диспепсия, диабетический гастропарез, рефлюксная гастроэзофагеальная болезнь, синдром раздраженного кишечника, чрезмерное развитие микрофлоры тонкого кишечника, псевдонепроходимость толстой кишки, паралитическая непроходимость кишечника, хроническая идиопатическая псевдообструкция кишечника и послеоперационная непроходимость кишечника, причем этот способ включает введение индивидууму фармацевтической композиции, представленной в (viii).

Преимущества настоящего изобретения

Новые мотилин-подобные пептидные соединения по данному изобретению обладают мотилин-подобной активностью в отношении стимулирования моторики пищеварительного тракта и демонстрируют более высокую эффективность всасывания после трансмукозального введения. Поэтому соединения по данному изобретению могут быть использованы для лечения заболеваний, связанных с нарушениями функций пищеварительного тракта (например, состояния, характеризуемые снижением, относительно базового уровня, моторной активности желудочно-кишечного тракта). Заболевания, связанные с нарушениями функций желудочно-кишечного тракта, включают состояния, такие как функциональная диспепсия, диабетический гастропарез, рефлюксная гастроэзофагеальная болезнь, синдром раздраженного кишечника, чрезмерное развитие микрофлоры тонкого кишечника, псевдонепроходимость толстой кишки, паралитическая непроходимость кишечника, хроническая идиопатическая псевдообструкция кишечника и послеоперационная непроходимость кишечника. Кроме того, соединения по данному изобретению обладают более высокой эффективностью всасывания, чем нативный мотилин, после трансмукозального введения, и поэтому в случае лечения пациентов для достижения эффективных плазменных концентраций должны вводиться при более низких дозах.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 - график, показывающий активность индуцирования IMC на стадии голодания, демонстрируемую после внутривенного введения нативного мотилина, соединения 4 и соединения 6.

Фиг.2 - график, демонстрирующий профиль плазменных уровней у крыс, которым был внутривенно введен нативный мотилин.

Фиг.3 - график, демонстрирующий профили плазменных уровней после легочного введения нативного мотилина, соединения 2 (MT 114) и соединения 6 (MT 140).

Фиг.4 - график, демонстрирующий профили плазменных уровней у обезьян, которым был внутривенно введен нативный мотилин и соединение 2 (MT 114).

Фиг.5 - график, демонстрирующий профили плазменных уровней у обезьян, которым был интраназально введен нативный мотилин и соединение 2 (MT 114).

Описание вариантов осуществления изобретения

Известно, что нативный мотилин имеет N-концевую часть в качестве существенного сайта для проявления его активности, и, кроме того, известно, что, хотя нативный мотилин образует α-спиральную структуру в растворе в С-концевой области, простирающейся от области треонина в положении 6 [Andersson A. & Maler L., J. Biomol. NMR, 24, 103-112 (2002)], производные, имеющие мутации, введенные в α-спиральную структуру, которая расположена вдали от активного центра, обладают более низкой способностью активировать рецептор [Miller P et al., Peptides, 16, 11-18 (1995)]. Исходя из данных, представленных в этих документах, авторы предположили, что α-спиральная структура может вносить вклад в стабилизацию активного центра на N конце. Другими словами, авторы считали, что присутствие α-спиральной структуры может благоприятствовать защите структуры активного центра на N конце.

Поэтому при осуществлении структурных модификаций, которые могли бы препятствовать пути деградации мотилина, авторы выбрали сайты, которые предположительно независимы от возможного снижения в активности, которое могло быть результатом дестабилизации α-спиральной структуры.

Аминокислота в 1-положении на N конце мотилина (которую в дальнейшем называют Х1) является существенной для активации рецептора, и поэтому желательно ее защитить от деградации. Авторы предположили, что для придания устойчивости к протеолитическому ферменту удлинение расстояния от N-концевой аминогруппы до пептидной связи X1-Val или замена пептидной связи X1-Val неамидной связью могли бы быть полезными для приобретения устойчивости к деградатации.

Кроме того, X2 в нативном мотилине представляет собой пролин и определяет конформационную структуру соединения, поэтому авторы предположили, что путем повышения ее степени свободы можно будет регулировать способность соединения активировать рецептор. В нативном мотилине X3 представляет собой глутаминовую кислоту, и она образует водородную связь вместе с боковой цепью треонина в 6-положении, по-видимому, тем самым способствуя образованию α-спиральной структуры в области, простирающейся от 6-положения в направлении С-концевого конца [Andersson A. & Maler L.,J. Biomol. NMR, 24, 103-112 (2002)]. Поскольку известно, что замещение X3 аланином или D-глутаминовой кислотой вызвало существенное снижение в способности активировать рецептор [Miller P. et al., Peptides, 16, 11-18 (1995), and Peeters T.L., et al., Peptides, 13, 1103-1107 (1992)], то желательно X3 выбирать из L-кислых аминокислот. Что касается X4, то он представляет собой метионин в нативном мотилине и может снижать способность активировать рецептор через окисление боковой цепи. Поэтому метионин желательно заменить на лейцин, который, по существу, сравним с ним с точки зрения размера боковой цепи.

Мотилин расщепляется под действием дикарбоксипептидазы, начиная с С-концевого конца. Авторы предположили, что замещение аминокислот пролином на С-концевой части нативного мотилина может фиксировать двугранный угол около пептидной связи и придать устойчивость к деградации вследствие стерического препятствия, которое будет сопровождать координацию с субстратсвязывающим сайтом, на котором дикарбоксипептидаза связывается с субстратом, или с активным центром.

С другой стороны, поскольку α-спиральная структура мотилина важна для проявления способности активировать рецептор, полагают, что сайты аминокислот для замещения пролином, которые затрудняют образования α-спиральной структуры мотилина, весьма ограничены. С этих точек зрения, авторы предложили замещение X5 и/или аминокислоты в 21-положении пролином.

С учетом вышеизложенных точек зрения авторы сконструировали и синтезировали производные и подвергли их опыту по деградации, используя супернатант гомогената легкого, и эксперименту по сокращению, используя извлеченный кишечный тракт. Ряд мотилин-подобных пептидных соединений по данному изобретению, которые имели замещение глицина в положении 21 мотилина пролином, были подвергнуты эксперименту по трансмукозальному введению in vivo, посредством которого авторы подтвердили, что указанные соединения демонстрируют более высокую абсорбционную способность, чем нативный мотилин, и к тому же поддерживают индуцирующую активность в отношении IMC, сравнимую с индуцирующей активностью нативного мотилина; исходя из этого заключения, настоящее изобретение можно считать завершенным.

Пептидные соединения по данному изобретению представляют собой соединения, содержащие последовательность, представленную нижеследующей общей формулой 1, которая характеризуется замещением аминокислоты в 21-положении пролином:

X1 Val X2 Ile Phe Thr Tyr Gly X3 Leu Gln Arg X4 Gln Glu Lys Glu Arg X5 Lys Pro Gln (формула 1) (SEQ ID NO: 2)

[где все связи между аминокислотами, кроме связи X1-Val, являются амидными связями;

связь X1-Val представляет собой амидную связь или связь, представленную нижеследующей формулой 2

(формула 2)

X1 представляет собой ароматическую аминокислоту или гетероароматическую аминокислоту;

X2 представляет собой пролин или саркозин;

X3 представляет собой глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту;

X4 представляет собой метионин или лейцин;

X5 представляет собой аспарагин или пролин],

или их фармацевтически приемлемые соли, и они характеризуются поддержанием стимулирующей активности в отношении моторики пищеварительного тракта, сравнимой со стимулирующей активностью нативного мотилина и к тому же наличием более высокой абсорбционной способности после трансмукозального введения.

В вышеупомянутой формуле 1 X1 представляет собой ароматическую аминокислоту или гетероароматическую кислоту. Ароматическая аминокислота или гетероароматическая аминокислота относится к любой аминокислоте, которая содержит в своей химической структуре ароматический цикл, и примеры включают, например, α-аминокислоты, такие как фенилаланин (Phe), тирозин (Tyr) и триптофан (Trp), а также или β-гомофенилглицин (Phg(C#CH₂)), ацетилнафтилаланин (Ac-Nal) и т.п. В настоящем изобретении фенилаланин (Phe), β-гомофенилглицин (Phg(C#CH₂)) и ацетилнафтилаланин (Ac-Nal) могут быть упомянуты в качестве более предпочтительных примеров аминокислоты X1.

В вышеупомянутой формуле 1 X1 может быть L-аминокислотой или D-аминокислотой. Согласно предшествующему уровню техники до настоящего времени были получены варианты путем замещения L-аминокислот D-аминокислотами в качестве аминокислоты в положении 1 мотилина (Miller P. et al., Peptides, 16, 11-18 (1995)), и эти варианты, как было показано, сохраняют активность мотилина.

В вышеупомянутой формуле 1 X2 представляет собой пролин (Pro) или саркозин (Sar, также называемый N-метилглицин или MeGly); X3 представляет собой глутаминовую кислоту (Glu) или аспарагиновую кислоту (Asp); X4 представляет собой метионин (Met) или лейцин (Leu); и X5 представляет собой аспарагин (Asn) или пролин (Pro). Аминокислоты, обозначенные X1-X5, могут быть использованы в любой комбинации.

В пептидных соединениях вышеупомянутой формулы 1, связь между первой аминокислотой (X1) и второй аминокислотой (Val) является амидной связью или связью, представленной нижеследующей формулой 2

(формула 2)

Связь формулы 2 также называют связью -psi[CH₂NH]-. Связь X1-Val может быть либо амидной связью, либо связью -psi[CH₂NH]-, независимо от типа аминокислоты, которая составляет X1.

Соединения вышеупомянутой формулы 1 по данному изобретению включают, например, соединения, изображенные нижеследующими последовательностями или их фармацевтически приемлемые соли.

Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys Glu Arg Asn Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 3);

Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys Glu Arg Asn Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 4);

Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Asp Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 5);

Phg(C#CH₂) Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 6);

Phg(C#CH₂) Val Sar Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 7);

Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys Glu Arg Asn Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 8);

Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys Glu Arg Asn Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 9);

Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 10);

Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 11);

Phg(C#CH₂) Val Sar Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 12);

Ac-Nal Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys Glu Arg Asn Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 13);

Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Asp Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 14);

Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Asp Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 15).

Соединения по данному изобретению можно получить обычными способами. Например, они могут быть получены с помощью химического синтеза, методом генной инженерии (в случае пептидов, состоящих исключительно из L-аминокислот), или с помощью их комбинаций.

Уже были разработаны различные способы для химического синтеза пептидов, и соединения по данному изобретению могут быть также легко получены известными способами. Например, могут быть использованы классические методы синтеза пептидов и твердофазные методы их получения. В частности, аминокислоты с защитными группами концентрируют жидкофазным методом и/или твердофазным методом, затем пептидную цепь наращивают, и после необязательного отщепления N-концевой защитной группы с помощью основания, такого как пиперазин, все защитные группы и смолу удаляют с помощью кислоты, и полученный неочищенный продукт очищают методом разделение/очистка, таким как гель-фильтрация, ультрафильтрация, диализ, электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE), или различными хроматографическими методами, после чего могут быть получены пептиды по данному изобретению. Например, они могут быть получены методами, описанными в книгах, таких как “Seikagaku Jikken Koza 1 Tanpakushitu no Kagaku (Course of Biochemical Experimentation 1, Chemistry of Protein),” Vol. 4, Chapters 2 and 3 (written in Japanese, Tokyo Kagaku Dojin) и “Zoku Iyakuhinn no Kaihatsu 14 Peptide Gosei (Drug Development 14, Sequel Version, Peptide Synthesis)” (written in Japanese, Hirokawa Shoten).

Из числа соединений по данному изобретению соединения, имеющие связь -psi[CH₂NH]- формулы 2 в виде связи между аминокислотами, можно также получить химическим синтезом. Например, в случае синтеза соединения, в котором связь X1-Val в формуле 1 представляет собой связь -psi[CH₂NH]-, вышеописанный способ используют для наращивания пептидной цепи от C конца до аминокислоты в 2-положении (Val в формуле 1), и затем защитную группу на α-аминогруппе в аминокислоте 2-положения отщепляют химически; после этого альдегид Boc- или Fmoc-аминокислоты вводят согласно реакции гидроалкилирования посредством натрий цианотригидроборат/1% уксусной кислоты, с последующим удалением смолы и снятием защиты с помощью кислоты таким же способом, как описано выше, получая неочищенный продукт, который затем очищают, используя метод разделения/очистки, такой как гель-фильтрация, ультрафильтрация, диализ, электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE), или различные хроматографические методы, после чего могут быть получены пептиды по данному изобретению.

Пептиды, состоящие исключительно из природных аминокислот L-формы, можно получить методом генной инженерии. В частности, может быть культивирована клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим ДНК, кодирующую пептидную последовательность согласно данному изобретению, для того, чтобы затем выделить желаемый пептид из полученной культуры.

Примеры вектора, в который должен быть введен ген, включают векторы E. coli (например, pBR322, pUC18 и pUC19), векторы B. subtilis (например, pUB110, pTP5 и pC194), дрожжевые векторы (например, YEp, YRp и типы YIp) и векторы клеток животных (например, ретровирус и вирус коровьей оспы), но могут быть использованы и другие векторы при условии, что они способны стабильно удерживать требуемый ген внутри клетки-хозяина. Вектор, представляющий интерес, вводят в подходящую клетку-хозяина. Различные методы могут быть использованы для включения требуемого гена в плазмиду или для введения в клетку-хозяина, и типичные методы описаны в Molecular Cloning (Sambrook et al., 1989).

Для экспрессии требуемого пептидного гена в плазмиде, упомянутой выше, промотор функционально встраивают в ориентации, противоположной направлению транскрипции этого гена. Любые промоторы могут быть использованы в настоящем изобретении при условии, что они подходят для клетки-хозяина, которую используют для экспрессии требуемого гена. Например, если клетка-хозяин, подлежащая трансформированию, представляет собой род Escherichia, то могут быть использованы промотор lac, промотор trp, промотор lpp, промотор λPL, промотор recA и т.д.; в случае рода Bacillus могут быть использованы промотор SP01, промотор SP02, промотор penP и т.д.; в случае дрожжей могут быть использованы промотор GAP, промотор PH05, промотор ADH и т.д.; в случае клеток животных могут быть использованы промотор SV40, промотор CMV, ретровирус-производный промотор и т.д.

В тех случаях, когда клетка-хозяин должна быть трансформирована полученным таким образом вектором, содержащим представляющий интерес ген, клетка-хозяин, подлежащая использованию, может быть бактериальной (например, Escherichia рода и Bacillus рода), дрожжами (Saccharomyces рода, Pichia рода и Candida рода), клетками животных (клетка CHO, клетка COS и т.д.) и т.п. В качестве культуральной среды подходящими являются жидкие среды, и особенно предпочтительны среды, содержащие источники углерода, источники азота и другие питательные вещества, которые требуются для роста трансформированной клетки, подлежащей культивированию. При желании могут быть добавлены витамины, стимулирующие рост факторы, сыворотки и т.д. Для выделения соединения по данному изобретению из культуральной среды, содержащей пептидное производное по данному изобретению, могут быть использованы такие же методы разделения/очистки, как те, которые были использованы при получении пептидных соединений химическим синтезом.

Соединения по данному изобретению могут быть использованы для лечения заболеваний, которые включают нарушения функций пищеварительного тракта (например, состояния, которые характеризуются снижением, относительно базового уровня, моторной активности желудочно-кишечного тракта). Нарушения функций пищеварительного тракта представляют собой состояния, которые характеризуются проявлением таких симптомов в пищеварительном тракте, которые вызывают дискомфорт, физические неудобства, хотя результаты эндоскопического исследования, анализа крови и т.д. при этом никаких очевидных органических аномалий, таких как воспаления и язвы, не обнаруживают, и эта группа болезней, которые в совокупности называют “функциональные нарушения желудочно-кишечного тракта”, систематизирована и определяется присущими ей симптомами в соответствии с критериями ROME III (Gastroenterology 130: 1377-1556, 2006). Заболевания, которые включают нарушения функций желудочно-кишечного тракта, включают такие состояния, как функциональная диспепсия, диабетический гастропарез, рефлюксная гастроэзофагеальная болезнь, синдром раздраженного кишечника, чрезмерное развитие микрофлоры тонкого кишечника, псевдонепроходимость толстой кишки, паралитическая непроходимость кишечника, хроническая идиопатическая псевдообструкция кишечника и послеоперационная непроходимость кишечника.

Следует указать на то, что нарушения функций желудочно-кишечного тракта диагностируют не только по субъективным симптомам, таким как боль в животе, тошнота, рвота, диарея, запор, изжога, вспучивание живота и плохой аппетит, но с помощью объективных исследований, таких как измерение давления в желудочно-кишечном тракте, исследование желудочного сока, мониторинг рН желудка, анализ опорожнения желудка, рентгенография желудочно-кишечного тракта и эндоскопическое исследование.

Соединения по данному изобретению или их фармацевтически приемлемые соли могут быть использованы для животных, включая человека, в количествах, достаточных для придания требуемой моторной активности пищеварительного тракта, либо одни, либо в смеси с известными, фармацевтически премлемыми носителями, эксципиентами, наполнителями и т.д.

Для целей настоящего изобретения фармацевтически приемлемые соли включают, например, соли с неорганическими основаниями, соли с органическими основаниями, соли с неорганическими кислотами, соли с органическими кислотами и соли с основными или кислыми аминокислотами, но эти перечисленные соли не являются единственными примерами, и могут быть использованы любые обычные соли.

Пептидные соединения по данному изобретению могут вводиться различными инъекционными путями, такими как подкожное введение, внутримышечное введение и внутривенное введение. Кроме того, поскольку пептидные соединения по данному изобретению предполагают высокую абсорбцию после трансмукозального введения, они могут вводиться и трансмукозальными путями, а именно неинъекционными путями, такими как пероральный, интраназальный, легочный, трансмукозальный и трансвагинальный пути, а также путем закапывания в глаза. Желательно, чтобы соединения вводили пероральным, интраназальным или легочным путем, и наиболее желательно их вводить легочным или интраназальным путем.

В тех случаях, когда соединения по данному изобретению используют для лечения заболеваний, упомянутых выше, их доза зависит от состояния пациента, степени выраженности желаемого терапевтического действия, пути введения, частоты введения и т.д., и в случае введения человеку доза может варьироваться, начиная с низкого уровня 0,01 мкг/кг. Предпочтительная доза может составлять 0,01-500 мкг/кг, более предпочтительно 0,05-100 мкг/кг. Количества, отвечающие этим диапазонам, желательно вводить 1-3 раза в день.

Пептидные соединения по данному изобретению или их фармацевтически приемлемые соли могут быть использованы в комбинации с фармацевтически приемлемыми носителями. Фармацевтически приемлемые носители, которые могут быть использованы, включают различные органические или неорганические вещества-носители, которые являются стандартными в качестве необходимых составных частей фармацевтического препарата, и их компаундируют в качестве эксципиентов, лубрикантов, связующих, дезинтегрантов или т.п. с активным соединением с получением твердых препаратов, и в качестве растворителей, солюбилизаторов, суспендирующих средств, тонизирующих средств, буферов, антисептиков, антиоксидантов или т.п., с получением жидких препаратов. Типичным примером эксципиентов является лактоза; типичными примерами лубрикантов являются тальк и коллоидный диоксид кремния. Типичными примерами растворителей являются вода для инъекции, пролингликоль, кунжутное масло и кукурузное масло; суспендирующие средства включают поверхностно-активные вещества, такие как стеарилтриэтаноламин, лаурилсульфат натрия, лауриламинопропионовая кислота, лецитин и глицерилмоностеарат, но и, конечно, могут быть использованы другие общепринятые необходимые для получения фармацевтическго препарата вспомогательные вещества.

ПРИМЕРЫ

На нижеследующих страницах настоящее изобретение описывается более конкретно, ссылаясь на рабочие примеры, являющиеся вариантами осуществления изобретения, сравнительные примеры и т.п., однако следует понимать, что настоящее изобретение никоим образом не ограничивается приведенными ниже рабочими примерами.

Значения основных аббревиатур, используемых при описании рабочих примеров, представлены ниже.

Phg(C#CH₂): L-β-гомофенилглицин

Ac-Nal: ацетилнафтилаланин

Sar: L-саркозин

CH₂-NH: -psi[CH₂NH]- связь (также называемая псевдосвязью)

Fmoc: флуоренилметилоксикарбонил

Boc: трет-бутилоксикарбонил

TFA: трифторуксусная кислота

Trt: тритил

HBTU: N-[(1H-бензотриазол-1-ил)диметиламинометилен)]-N-метилметанаминий N-оксид гексафторфосфат

HOBt: 1-гидроксибензотриазол

DCC: N,N'-дициклогексилкарбодиимид

TIPS: триизопропилсилан

Синтез соединений

Принимая во внимание путь деградации мотилина под действием протеолитического фермента, стабильность метионина в 13-положении, удерживание физиологической активности мотилина и другие факторы, были синтезированы мотилин-подобные пептидные соединения, идентицированные ниже. Кроме того, был синтезирован нативный мотилин в качестве эталона для сравнения. Сравнительные соединения 1 и 2, а также соединения по данному изобретению 1-13 имели нижеследующие аминокислотные последовательности.

Нативный мотилин: Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys Glu Arg Asn Lys Gly Gln (SEQ ID NO: 1);

Сравнительное соединение 1 (¹³Leu-мотилин): Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys Glu Arg Asn Lys Gly Gln (SEQ ID NO: 16);

Сравнительное соединение 2 (MT139): Phe*Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys Glu Arg Asn Lys Gly Gln (SEQ ID NO: 17);

Соединение 1 (MT095): Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys Glu Arg Asn Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 3);

Соединение 2 (MT114): Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys Glu Arg Asn Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 4);

Соединение 3 (MT116): Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Asp Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 5);

Соединение 4 (MT124): Phg(C#CH₂) Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 6);

Соединение 5 (MT126): Phg(C#CH₂) Val Sar Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 7);

Соединение 6 (MT140): Phe*Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys Glu Arg Asn Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 8);

Соединение 7 (MT141): Phe*Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys Glu Arg Asn Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 9);

Соединение 8 (MT107): Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 10);

Соединение 9 (MT115): Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 11);

Соединение 10 (M125): Phg(C#CH₂) Val Sar Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 12);

Соединение 11 (MT128): Ac-Nal Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys Glu Arg Asn Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 13);

Соединение 12 (MT154): Phe*Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Asp Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 14);

Соединение 13 (MT155): Phe*Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Asp Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 15).

Если связь -psi[CH₂NH]- используют в качестве связи между первой аминокислотой (соответствующей X1) и Val в каком-либо из соединений, идентифицированных выше, то связь представляют звездочкой (*).

Для наращивания пептидной цепи, в основном, используют пептидный синтезатор (433A, продукт от Applied Biosystems), и продукт защищенное пептидное производное/смола конструируют по Fmoc методу, и, наконец, Boc-аминокислоту вводят по N-концевому концу. С полученного продукта, защищенная пептидная смола, снимают защиту с помощью трифторуксусной кислоты (TFA) или разбавленной TFA, содержащей различные акцепторы, и выделенный пептид подвергают процедуре очистки. С помощью ВЭЖХ с обращенной фазой с использованием C18 колонки осуществляют как очистку, так и контроль чистоты; затем структуру пептида подтверждают масс-спектрометрическим анализом.

Пептидные соединения по данному изобретению могут быть синтезированы обычными методами пептидного синтеза; в качестве типичных примеров ниже описаны синтезы соединения 1 (MT095) и соединения 6 (MT140).

Пример 1: Синтез Соединения 1 (MT095)

Этот пример осуществляют с целью синтеза соединения 1 (MT095, SEQ ID NO: 3) химическим путем.

Fmoc-Gln(Trt)-Alko смолу (продукт WATANABE CHEMICAL; 47,6 мг, 0,03 ммоль) обрабатывают 20% пиперазином в течение 20 минут и затем последовательным способом повторяют введение Fmoc-аминокислот посредством HBTU/HOBt и удаление Fmoc при помощи пиперазина, начиная с C-концевого конца SEQ ID NO: 3, тем самым конструируя Fmoc-пептид-смолу. Наконец, с помощью DCC/HOBt вводят Boc-Phe-OH и к полученной смоле с защищенным пептидом добавляют реагент, обеспечивающий снятие защиты (5,0 мл), содержащий не только 90% трифторуксусной кислоты, но и фенол, воду и TIPS, и смесь перемешивают в течение 2 часов при комнатной температуре. Смолу отфильтровывают и фильтрат концентрируют; после этого к остатку добавляют простой эфир, получая осадок. Осадок отделяют фильтрацией и сушат, получая около 30 мг неочищенного пептидного продукта.

Неочищенный пептидный продукт растворяют в 1,0 мл 1 N уксусной кислоты и после загрузки раствора в колонку Inertsil PREP ODS (Φ20 мм×250 мм; продукт GL Sciences, Inc.), проводят элюирование при линейном градиенте от 0% до 50% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте на протяжении 50 минут (скорость потока: 10 мл/мин). Осуществляя УФ-детектирование при 220 нм, отбирают желательные фракции и после их лиофилизации получают около 5,0 мг конечного продукта.

Полученный конечный продукт загружают в колонку Inertsil PREP ODS (Φ4,6 мм×250 мм; продукт GL Sciences, Inc.), проводят элюирование при линейном градиенте от 5% до 65% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте на протяжении 30 минут (скорость потока: 1,5 мл/мин). При УФ-мониторинге (220 нм) определяют чистоту конечного продукта.

Полученный конечный продукт подвергают MALDI TOF-MS [Времяпролетная масс-спектрометрия с ионизацией методом лазерной десорбции из матрицы] (Daltonics BIFLEX III, продукт Bruker) для подтверждения его молекулярной массы и аминокислотному анализу (состоящего из обработки в 6 N HCl при 110°C в течение 24 часов до тех пор, пока продукт не гидролизуется до аминокислот, которые соответственно подвергают количественному определению согласно ВЭЖХ) для установления содержания пептида. Измеренное значение молекулярной массы, исходя из MALDI TOF-MS: 2738,718 (теорет., 2739,2); чистота, исходя из аналитич. ВЭЖХ: 96,0%; содержание пептида, исходя из аминокислотного анализа: 643 мкг/мг.

Пример 2: Синтез соединения 6 (MT140)

Этот пример осуществляют с целью синтеза соединения 6 (MT140, SEQ ID NO: 8) химическим путем.

Fmoc-Gln(Trt)-Alko смолу (продукт WATANABE CHEMICAL; 47,6 мг, 0,03 ммоль) обрабатывают 20% пиперазином в течение 20 минут и затем повторяют последовательным способом введение Fmoc-аминокислот посредством HBTU/HOBt и удаление Fmoc при помощи пиперазина, начиная с C-концевого конца SEQ ID NO: 8, тем самым конструируя Fmoc-пептид-смолу. Наконец, Boc-Phe альдегид вводят посредством натрий цианотригидроборат/1% уксусная кислота и к полученной смоле с защищенным пептидом добавляют реагент, обеспечивающий снятие защиты (5,0 мл), содержащий не только 90% трифторуксусной кислоты, но и фенол, воду и TIPS, и полученную смесь перемешивают в течение 2 часов при комнатной температуре. Смолу отфильтровывают и фильтрат концентрируют; после этого к остатку добавляют простой эфир, получая осадок. Осадок выделяют фильтрацией и сушат, получая около 30 мг неочищенного пептидного продукта.

Неочищенный продукт растворяют в 1,0 мл 1 N уксусной кислоты и после загрузки раствора в колонку Inertsil PREP ODS (Φ20 мм×250 мм; продукт GL Sciences Inc.) проводят элюирование при линейном градиенте от 0% до 50% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте на протяжении 50 минут (скорость потока: 10 мл/мин). При УФ-мониторинге (220 нм) желательные фракции выделяют и подвергают сушке лиофилизацией, получая около 5,0 мг конечного продукта.

Полученный конечный продукт загружают в колонку Inertsil PREP ODS (Φ4,6 мм×250 мм; продукт GL Sciences Inc.), проводят элюирование при линейном градиенте от 5% до 65% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте на протяжении 30 минут (скорость потока: 1,5 мл/мин). При УФ-мониторинге (220 нм) определяют чистоту конечного продукта.

Полученный конечный продукт подвергают MALDI TOF-MS (Daltonics BIFLEX III, продукт Bruker) для верификации его молекулярной массы. Определенное значение молекулярной массы, исходя из MALDITOF-MS: 2725,040 (теорет., 2725,2); чистота, исходя из аналит. ВЭЖХ: 98,7%; содержание пептида согласно аминокислотному анализу: 707 мкг/мг.

Аналогичными способами были получены нативный мотилин, а также соединения 1-13 (SEQ ID NO:3-15 соответственно) и сравнительные соединения 1 и 2 (SEQ ID NO: 16 и 17 соответственно). Значения ММ вышеуказанных соединений приведены в Таблице 1 наряду с величинами, соответствующими содержанию в них пептидов, определенными аминокислотным анализом.

Таблица 1 Значения ММ и содержания пептида для соединений
Название соединения	Структура	Содержание пептида (%) (Аминокислотный анализ)	Измеренные значения ММ (теорет.)
Нативный мотилин	FVPIFTYGELQRMQEKERNKGQ (SEQ ID NO: 1)	88,6	2698,382 (2699,1)
Сравнительное соединение 1 (13Leu-мотилин)	FVPIFTYGELQRLQEKERNKGQ (SEQ ID NO: 16)	73,1	2680,432 (2681,0)
Сравнительное соединение 2 (MT139)	F*VPIFTYGELQRMQEKERNKGQ (SEQ ID NO: 17)	71,8	2683,998 (2685,1)
Соединение 1 (MT095)	FVPIFTYGELQRMQEKERNKPQ (SEQ ID NO: 3)	64,3	2738,718 (2739,2)
Соединение 2 (MT114)	FVPIFTYGELQRLQEKERNKPQ (SEQ ID NO: 4)	75,8	2720,544 (2721,1)
Соединение 3 (MT116)	FVPIFTYGDLQRLQEKERPKPQ (SEQ ID NO: 5)	76,8	2689,574 (2690,1)
Соединение 4 (MT124)	Phg(C#CH2)-VPIFTYGELQRLQEKERPKPQ (SEQ ID NO: 6)	75,7	2703,920 (2704,1)
Соединение 5 (MT126)	Phg(C#CH2)-V-Sar-IFTYGELQRLQEKERPKPQ (SEQ ID NO: 7)	58,3	2677,60 (2677,0)
Соединение 6 (MT140)	F*VPIFTYGELQRMQEKERNKPQ (SEQ ID NO: 8)	70,7	2725,040 (2725,2)
Соединение 7 (MT141)	F*VPIFTYGELQRLQEKERNKPQ (SEQ ID NO: 9)	70,3	2706,980 (2707,1)
Соединение 8 (MT107)	FVPIFTYGELQRMQEKERPKPQ (SEQ ID NO: 10)	-	2721,272 (2722,2)
Соединение 9 (MT115)	FVPIFTYGELQRLQEKERPKPQ (SEQ ID NO: 11)	-	2703,463 (2704,1)
Соединение 10 (MT125)	Phg(C#CH2)-V-Sar-IFTYGELQRMQEKERPKPQ (SEQ ID NO: 12)	-	2695,845 (2695,1)
Соединение 11 (MT128)	Ac-Nal-VPIFTYGELQRMQEKERNKPQ (SEQ ID NO: 13)	-	2830,62 (2831,2)
Соединение 12 (MT154)	F*VPIFTYGDLQRLQEKERPKPQ (SEQ ID NO: 14)	-	2676,598 (2676,1)
Соединение 13 (MT155)	F*VPIFTYGDLQRMQEKERPKPQ (SEQ ID NO: 15)	-	2693,923 (2694,2)
Замечания: Содержание аминокислот не измерено для соединений 8-13. Звездочка (*) в структурах сравнительного соединения 2, а также соединений 6, 7, 12 и 13 указывает на то, что связь между соседними аминокислотами представляет собой -psi[CH2NH]- связь.

Пример 3: Измерение активности индуцирования IMC в межпищеварительный период, натощак

Этот пример проводят с целью измерения активности индуцирования IMC в межпищеварительный период, натощак, в организме собаки, вызываемой соединениями, полученными способами, описанными в Примерах 1 и 2.

В соответствии с методом ITOH et al. (Zen Itoh et al., Gastroenterologia Japonica 12; 275-283, 1977), осуществляют оценку активности соединений в индуцировании IMC в межпищеварительный период путем измерения сократительного движения желудочно-кишечного тракта собаки, находящейся в сознании, в который были хирургическим путем вшиты динамометрические датчики. В частности, собак в состоянии анестезии подвергают хирургическому вмешательству, при котором динамометрические датчики вшивают в серозные оболочки антрального отдела желудка, двенадцатиперстной кишки, тощей кишки и подвздошной кишки параллельно кольцеобразной мышце, и после этого деформация от каждого датчика передается в записывающее устройство посредством усилителя.

Через приблизительно 10 минут после окончания самопроизвольного проявления IMC натощак (10 минут после сильных сокращений желудка) собакам, находящимся в сознании, быстро внутривенно инъецируют 0,1 мкг/кг нативного мотилина или выбранных соединений производного мотилина и прослеживают изменение возникающих при этом сократительных движений желудочно-кишечного тракта. Сильные сокращения желудка и их распространение в двенадцатиперстную кишку, вызванные введением испытуемых соединений, определяют как IMC; соединение оценивают как “положительное в отношении активности индуцирования IMC”, если оно индуцировало IMC при дозе 0,1 мкг/кг.

Фиг.1 представляет картины активности индуцирования IMC в межпищеварительный период, наблюдаемые после внутривенного введения нативного мотилина, а также соединения 4 (MT124) и соединения 6 (MT140) при дозе 0,1 мкг/кг, и в Таблице 2 приводятся результаты оценки активности нативного мотилина и выбранных производных мотилина по данному изобретению в отношении проявления индуцирования IMC в межпищеварительный период. На Фиг.1 стрелки указывают на временные рамки, в течение которых вводят нативный мотилин, а также соединения 4 и 6. Как следует из Фиг.1, антральный отдел желудка начинает сокращаться, после того как вводят нативный мотилин (в точке по времени, указанной посредством ↑), и сокращение продолжается на протяжении около 10 минут. Сразу после начала сокращения в антральном отделе желудка сокращение распространяется в двенадцатиперстную кишку, которая, подобно антральному отделу желудка, продолжает сокращаться на протяжении около 10 минут. После внутривенного введения соединения 4 (MT124) и соединения 6 (MT140) наблюдаются сокращения такого же характера, как описано выше в случае введения нативного мотилина. Кроме того, как следует из Фиг.1 и Таблицы 2, не только нативный мотилин и соединение 4 (MT124) и соединение 6 (MT140), но и любое другое производное мотилина по данному изобретению проявляет активность в индуцировании IMC в межпищеварительный период подобно самопроизвольному проявлению IMC, и при этом интенсивность сократительной активности оказалась почти сравнимой с интенсивностью IMC, вызываемой нативным мотилином.

Таблица 2 Активность индуцирования IMC в межпищеварительный период у собак после внутривенного введения нативного мотилина и производных мотилина
Название соединения	Доза (мкг/кг)	Активность индуцирования IMC
Нативный мотилин	0,1	Положительная
Сравнительное сооединение (13Leu-мотилин)	0,1	Положительная
Сравнительное соединение 2 (МТ139)	0,1	Положительная
Соединение 1 (MT095)	0,1	Положительная
Соединение 2 (MT114)	0,1	Положительная
Соединение 3 (MT116)	0,1	Положительная
Соединение 4 (MT124)	0,1	Положительная
Соединение 5 (MT126)	0,1	Положительная
Соединение 6 (MT140)	0,1	Положительная
Соединение 7 (MT141)	0,1	Положительная
Соединение 8 (MT107)	0,1	Положительная
Соединение 9 (MT115)	0,1	Положительная
Соединение 10 (MT125)	0,1	Положительная

Их этих результатов становится очевидно, что все соединения, которые были получены в Примерах 1 и 2, обладают таким же уровнем активности в индуцировании IMC в межпищеварительный период, как и нативный мотилин.

Сравнительный пример 1: Фармакокинетическое исследование в отношении внутривенного введения нативного мотилина крысам

Нативный мотилин вводят внутривенно крысам и измеряют его плазменные уровни.

Внутривенное введение осуществляют, используя крыс, которым предварительно в бедренную артерию вводят полиэтиленовую трубку (PE-50; продукт от Clay Adams). В качестве подопытных животных используют крыс линии SD, самцов, 7-недельного возраста (приобретенных у CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN, INC,), из которых составляют группы из 3 крыс и которых подвергают нижеследующему эксперименту. Нативный мотилин растворяют в 5% растворе маннита, получая раствор с концентрацией 100 мкг/мл, и этот раствор вводят каждой крысе при дозе 1 мл/кг через хвостовую вену с помощью шприца и иглы 26G (оба являются продуктами TERUMO). До введения и через 1, 3, 5, 10, 20, 30 и 60 минут после введения отбирают пробу крови через полиэтиленовую трубку, вставленную в бедренную артерию.

К отобранной пробе крови сразу добавляют 10% раствор EDTA·2Na·2H₂O при объемном отношении 1:100 и плазму отделяют центрифугированием. Плазму немедленно смешивают с раствором апротинина 5000 МЕ/мл при объемном соотношении 1:10 и хранят при -80°C до использования в опыте.

Измерение плазменной концентрации нативного мотилина проводят радиоиммунологическим методом (RIA), используя антимотилиновое антитело. В соответствии с этим методом после добавления антимотилинового антитела к пробе крови добавляют [¹²⁵I-Tyr7]мотилин для того, чтобы вызвать протекание реакции конкурентного связывания. Путем последующего добавления вторичного антитела осаждают мотилин, связавшийся с антимотилиновым антителом, и после отделения супернатанта в высадившейся фракции измеряют радиоактивность с помощью γ-счетчика (продукт от PerkinElmer).

Полученный профиль концентрации нативного мотилина в плазме представлен на Фиг.2. Из этого профиля плазменную концентрацию на момент времени ноль (С0) и площадь под кривой для плазменных концентраций (AUC) вычисляют в качестве фармакокинетических параметров; C0 определяют экстраполяцией и AUC определяют трапециевидным методом. Значения C0 и AUC, которые являются результатом внутривенного введения нативного мотилина при дозе 100 мкг/кг, как было вычислено, составляют 1797 нг/мл и 3598 нг·мин/мл соответственно.

Пример 4: Фармакокинетическое исследование в отношении легочного введения нативного мотилина и соединений производного мотилина крысам

Этот пример осуществляют с целью измерения с помощью (RIA) изменений, которые наблюдаются у крыс, исходя из плазменных концентраций нативного мотилина и соединений производного мотилина, возникших в результате их введения легочным путем. В тех случаях, когда применяют RIA, все вещества, которые взаимодействуют с антимотилиновым антителом, детектируются, это значит, что не только неизмененные формы, но, вероятно, и метаболиты, которые взаимодействуют с антителом, будут детектироваться. Поэтому после легочного введения нативного мотилина и соединений производного мотилина крысам собранную плазму фракционируют с помощью ВЭЖХ и измеряют иммунологическую активность в каждой фракции, чтобы показать, что вещество, реагирующее с антителом, находится в неизмененной форме, эти данные подтверждают пригодность RIA метода в качестве метода для измерения изменений в плазменной концентрации.

Конкретизируя вышесказанное, полиэтиленовую трубку (PE-240; продукт от Clay Adams) вводят в трахею крыс линии SD, самцов 7-недельного возраста (приобретенных у CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN, INC.); нативный мотилин или соединение 2 (MT114) растворяют в водном растворе 0,1 N уксусной кислоты, получая раствор с концентрацией 1 мг/мл, и 25 мкл раствора вводят в полиэтиленовую трубку через трахею с помощью внутритрахеального устройства для распыления жидкости (MicroSprayer; продукт от Penn Century). Через пять минут после введения отбирают пробу крови через брюшную аорту и подвергают такой же обработке, как в Сравнительном примере 1, чтобы отделить плазму. После предварительной обработки с помощью картриджа Sep-Pak C18 (продукт от Waters) плазму фракционируют путем введения инъекции в систему ВЭЖХ (LC-10A; продукт от Shimadzu Corporation), снабженную колонкой Cosmosil 5C18 (продукт от nacalai tesque). Для каждого образца отбирают пробу элюата с интервалами в одну минуту, начиная сразу после инъекции образца до 40 минут после инъекции образца, и измеряют иммунологическую активность в каждой фракции методом RIA. В результате этого для каждого из плазменных образцов обнаруживается пик иммунологической активности только в точке элюирования, соответствующей введенному соединению, и никаких других пиков не наблюдается. Поскольку эти результаты свидетельствуют о том, что соединение, обнаруженное в плазме после легочного введения, находилось в неизмененной форме с очень малой вероятностью присутствия метаболитов, RIA метод, как было показано, является подходящим для использования его в качестве метода анализа в рассматриваемом примере.

Легочное введение образцов осуществляют так же, как описано выше, используя крыс, которым была предварительно введена полиэтиленовая трубка в бедренную артерию. В качестве подопытных животных используют крыс линии SD, самцов, 7-недельного возраста (приобретенных у CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN, INC,), из которых составляют группы из 3 крыс и которых подвергают нижеследующему эксперименту. Нативный мотилин или соединения производного мотилина растворяют в водном растворе 0,1 N уксусной кислоты, получая раствор с концентрацией 1 мг/мл, и 25 мкл раствора вводят в полиэтиленовую трубку через трахею посредством внутритрахеального устройства для распыления жидкости (MicroSprayer; продукт от Penn Century). До введения и через 5, 10, 20, 30 и 60 минут после введения отбирают пробы крови через полиэтиленовую трубку, вставленную в бедренную артерию. Собранную пробу крови подвергают такой же обработке, как в Сравнительном примере 1, отделяя плазму, и концентрации нативного мотилина и соединений производного мотилина в плазме измеряют методом RIA. Для измерения, для построения калибровочных кривых для определения плазменных уровней в качестве стандартных веществ используют соответствующие производные.

Профили плазменных концентраций нативного мотилина, а также соединения 2 (MT114) и соединения 6 (MT140) после легочного введения представлены на Фиг.3. Как видно из Фиг.3, по сравнению с профилем концентрации мотилина в плазме после легочного введения нативного мотилина крысам плазменные концентрации соединения 2 (MT114) и соединения 6 (MT140) после легочного введения крысам имеют высокие максимальные уровни, что указывает на то, что эти соединения могут поддерживать более высокие концентрации in vivo на протяжении более длительного периода, чем нативный мотилин.

Исходя из профилей нативного мотилина или соединений производного мотилина в плазме, полученных в результате испытаний, описанных выше, вычисляют максимальную плазменную концентрацию (Cmax) и площадь под кривой для плазменных концентраций (AUC) в качестве фармакокинетических параметров; Cmax определяют из наблюдаемых значений и AUC определяют трапециевидным методом. Используя эти значения, вычисляют биологическую доступность (BA (%)) согласно следующему уравнению:

BA (%) = [(AUC/Доза)/(AUC(мотилин в.в.)/Доза (мотилин_в.в.))]×100

AUC: AUC(нг·мин/мл) после легочного введения;

Доза: доза (мкг/кг) при легочном введении;

AUC(мотилин в.в.): AUC (нг·мин/мл) после внутривенного введения нативного мотилина;

Доза(мотилин в.в.): доза (мкг/кг) при внутривенном введении нативного мотилина.

Фармакокинетические параметры нативного мотилина и соединений производного мотилина представлены в Таблице 3 ниже.

Таблица 3 Фармакокинетические параметры введенных легочным путем крысам нативного мотилина и соединений производного мотилина
Название соединения	Доза	Cmax	AUC	BA
(мкг/крыса)	(мкг/кг)	(нг/мл)	(нг·мин/мл)	(%)
Нативный мотилин	25	80,7±2,6	7,84±0,98	94,9±5,7	3,3±0,1
Сравнительное соединение 1 (13Leu-мотилин)	25	62,5±0,0	4,53±2,86	63,3±36,6	2,8±1,6
Сравнительное соединение 2 (MT139)	25	81,6±3,0	9,30±3,09	118,6±41,0	4,1±1,6
Соединение 1 (MT095)	25	62,6±2,6	9,09±0,53	119,3±15,0	5,3±0,6
Соединение 2 (MT114)	25	92,7±3,4	26,60±11,30	350,4±146,6	10,4±4,3
Соединение 3 (MT116)	25	82,4±1,6	24,60±5,80	281,8±24,0	9,5±0,9
Соединение 4 (MT124)	25	70,4±9,9	14,61±8,23	281,3±201,7	11,0±7,2
Соединение 5 (MT126)	25	86,2±0,0	14,81±7,78	175,3±90,7	5,7±2,9
Соединение 6 (MT140)	25	92,7±3,4	34,22±19,97	380,4±191,5	11,5±6,1
Соединение 7 (MT141)	25	83,5±4,7	17,20±7,18	194,3±47,9	6,4±1,3
Соединение 9 (MT115)	25	56,4±1,5	8,99±5,99	115,5±64,2	5,7±3,1
Соединение 10 (MT125)	25	89,3±0,0	6,10±1,50	189,5±25,5	5,9±0,8
Соединение 12 (MT154)	25	83,6±5,6	30,09±15,79	565,3±341,1	18,7±107
Соединение 13 (MT155)	25	91,5±1,9	18,42±10,40	185,4±48,5	5,6±1,5

Как следует из данных, представленных в Таблице 3, биологическая доступность (в дальнейшем как BA) соединения 1 (при замещении глицина, в качестве аминокислоты в положении 21 нативного мотилина, пролином; ²¹Pro-мотилин; SEQ ID NO: 3) составляет 5,3% после легочного введения крысам, и это значение выше, чем значение BA, которое достигается после легочного введения нативного мотилина (3,3%). Соединение 2 (при замещении метионина, в качестве аминокислоты в положении 13 нативного мотилина, лейцином, и замещении аминокислоты в положении 21 пролином; ¹³Leu-,²¹Pro-мотилин; SEQ ID NO: 4) имеет BA 10,4% после легочного введения крысам, заметное улучшение в сравнении со сравнительным соединением 1 (³Leu-мотилин; SEQ ID NO: 16) (2,8%). Далее помимо этого соединение 6 (связь -psi[CH₂NH]-; ²¹Pro-мотилин; SEQ ID NO: 8) имеет 11,5% после легочного введения, явное улучшение по сравнению с сравнительным соединением 2 (-psi[CH₂NH]-мотилин; SEQ ID NO: 17) (4,1%). В заключение, соединения 1-13, которые представляют собой производные мотилина с замещением пролином в положении 21, имеют значения BA 5,3-18,7%, все они показывают заметное улучшение в сравнении с BA нативного мотилина (3,3%). Исходя их этих результатов, абсорбционная способность после легочного введения, как было обнаружено, улучшается, когда аминокислота в положении 21 нативного мотилина или мотилин-подобных пептидных соединений замещена пролином.

Таким образом, когда соединения 1-13, т.е. производные мотилина с замещением пролином в положении 21, вводят легочным путем крысам, эффективность абсорбции в организме через слизистую оболочку улучшается настолько заметно (см. Таблицу 3), что концентрации in vivo абсорбированных соединений, как было показано, поддерживаются при более высоких уровнях на протяжении более длительного периода времени, чем концентрации in vivo абсорбированного нативного мотилина.

Сравнительный пример 2: Фармакокинетическое исследование в отношении внутривенного введения нативного мотилина и соединения производного мотилина обезьянам

В этом примере нативный мотилин и соединение производного мотилина вводят внутривенно обезьянам и измеряют их плазменные концентрации.

В качестве подопытных животных обезьян семейства cynomolgus, самцов, возраста 8-9 лет (N=1-2 на группу) подвергают нижеследующему опыту. Нативный мотилин и соединение 2, каждое, растворяют в 5% растворе маннита, получая растворы с концентрацией 100 мкг/мл; растворы вводят животным при дозе 0,1 мл/кг через правую головную вену посредством шприца и иглы (оба являются продуктами от TERUMO). До введения и через 5, 10, 15, 20, 30 и 60 минут после введения отбирают пробы крови через левую головную вену.

К собранному образцу немедленно добавляют 10% раствор EDTA·2Na·2H₂O при объемном отношении 1:100 и плазму отделяют центрифугированием. Плазму тотчас же смешивают с раствором апротинина 5000 МЕ/мл при объемном отношении 1:10 и хранят при -80°C до использования в измерении.

Измерение плазменных концентраций нативного мотилина и соединения производного мотилина проводят радиоиммунологическим методом (RIA), используя антимотилиновое антитело. В соответствии с этим методом после добавления антимотилинового антитела к пробе крови добавляют [¹²⁵I-Tyr7]мотилин для того, чтобы вызвать протекание реакции конкурентного связывания. Путем последующего добавления вторичного антитела осаждают мотилин, связавшийся с антимотилиновым антителом, и после отделения супернатанта в высадившейся фракции измеряют радиоактивность с помощью γ-счетчика (продукт от PerkinElmer).

Полученный профиль концентрации нативного мотилина в плазме отображен на Фиг.4. Из полученных профилей для плазменных концентраций нативного мотилина и соединения производного мотилина плазменную концентрацию на момент времени ноль (С0) и площадь под кривой для плазменных концентраций (AUC) вычисляют в качестве фармакокинетических параметров; C0 определяют экстраполяцией и AUC определяют трапециевидным методом. Значения C0 и AUC, которые являются результатом внутривенного введения нативного мотилина при дозе 10 мкг/кг, как было вычислено, составляют 233 нг/мл и 786 нг·мин/мл соответственно, и аналогичные параметры для соединения 2 составляют 273 нг/мл и 926 нг·мин/мл.

Пример 5: Фармакокинетическое исследование в отношении интраназального введения нативного мотилина и соединения производного мотилина А крысам

Этот пример осуществляют с целью измерения с помощью RIA изменений, которые наблюдаются у обезьян, исходя из плазменных концентраций трансназально введенного нативного мотилина и соединения производного мотилина.

В опыте используют обезьян семейства cynomolgus, самцов возраста 10-11 лет. Нативный мотилин или соединение 2 и микрокристаллическую целлюлозу смешивают при соотношении 1:40, получая интраназальные препараты, 20-мг порциями которого наполняют желатиновые капсулы. Каждую капсулу вводят в правую полость носа каждого животного посредством устройства для интраназального введения (продукт от Hitachi Automotive Systems, Ltd,). До введения и через 5, 10, 15, 20, 30, 60, 120 и 180 минут после введения отбирают пробы крови через головную вену. Собранную пробу крови подвергают обработке как в Сравнительном примере 2, выделяя плазму, и концентрации нативного мотилина и соединения производного мотилина в плазме измеряют методом RIA. Для измерения для построения калибровочных кривых для определения плазменных уровней в качестве стандартных веществ используют соответствующие производные.

Профили плазменных концентраций нативного мотилина и соединения 2 (MT114) у обезьян после интраназального введения приводятся на Фиг.5. Как следует из Фиг.5, по сравнению с профилем концентрации мотилина в плазме после интраназального введения нативного мотилина обезьянам плазменная концентрация соединения 2 (MT114) после интраназального введения обезьянам имеет высокий максимальный уровень, указывая на то, что соединение может поддерживать более высокий уровень концентрации in vivo на протяжении более длительного периода времени, чем нативный мотилин.

Исходя из профилей нативного мотилина и соединения производного мотилина в плазме, полученных в результате испытаний, описанных выше, вычисляют максимальную плазменную концентрацию (Cmax) и площадь под кривой для плазменных концентраций (AUC) в качестве фармакокинетических параметров; Cmax определяют из наблюдаемых значений и AUC определяют трапециевидным методом. Используя эти значения вычисляют биологическую доступность (BA (%)) согласно нижеследующему уравнению:

BA (%) = [(AUC/Доза)/(AUC (в.в.)/Доза (в.в.))]× 100

AUC: AUC(нг·мин/мл) после интраназального введения;

Доза: доза (мкг/кг) при интраназальном введении;

AUC(в.в.): AUC(нг·мин/мл) после внутривенного введения каждого соединения;

Доза (в.в.): доза (мкг/кг) при интраназальном введении каждого соединения.

Фармакокинетические параметры нативного мотилина и соединения производного мотилина приведены в Таблице 4 ниже.

Таблица 4 Фармакокинетические параметры интразально введенного нативного мотилина и соединения производного мотилина А у обезьян (Среднее для N=1-2)
Название соединения	Доза	Cmax	AUC	BA
(мкг/обезьяна)	(мкг/кг)	(нг/мл)	(нг·мин/мл)	(%)
Нативный мотилин	523	85,0	13,6	241	3,6
Соединение 2 (MT114)	540	80,6	23,5	361	5,1

Как видно из данных, представленных в Таблице 4, биологическая доступность (в дальнейшем в сокращенном виде как BA) соединения 2 составляет 5,1% после интраназального введения обезьянам, и это значение выше, чем BA, которая достигается после интраназального введения нативного мотилина (3,6%). Таким образом, когда соединение 2 или производное мотилина с замещением пролином в положении 21 вводят интраназально обезьянам, эффективность абсорбции в теле организма через слизистую оболочку улучшается настолько заметно, что концентрация in vivo абсорбированного соединения, как было показано, поддерживается при более высоком уровне на протяжении более длительного периода времени, чем концентрация in vivo абсорбированного нативного мотилина.

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ

Настоящее изобретение относится к новым мотилин-подобным пептидным соединениям. Мотилин-подобные пептидные соединения по данному изобретению или их фармацевтически приемлемые соли обладают эффективной стимулирующей активностью в отношении моторики желудочно-кишечного тракта и более высокой абсорбционной способностью после трансмукозального введения, благодаря чему они могут быть использованы для лечения заболеваний, вызванных нарушениями функций желудочно-кишечного тракта (например, состояний, характеризуемых снижением, относительно базового уровня, моторной активности пищеварительного тракта). Заболевания, вызванные нарушениями функций желудочно-кишечного тракта, включают состояния, такие как функциональная диспепсия, диабетический гастропарез, рефлюксная гастроэзофагеальная болезнь, синдром раздраженного кишечника, чрезмерное развитие микрофлоры тонкого кишечника, псевдонепроходимость толстой кишки, паралитическая непроходимость кишечника, хроническая идиопатическая псевдообструкция кишечника и послеоперационная непроходимость кишечника. Обычные пептидные агонисты мотилина, включая нативный мотилин, могли применяться только посредством прямой внутривенной инъекции, однако соединения по данному изобретению могут применяться посредством трансмукозальных и других неинвазивных путей введения и могут уменьшить страдания пациентов, связанные с внутривенным введением. Следовательно, настоящее изобретение предоставляет существенно значимую промышленную полезность в сравнении с известным уровнем техники.

Перечень последовательностей без конкретного указания составляющих их аминокислот

SEQ ID NO: 1 представляет собой аминокислотную последовательность человеческого мотилина.

SEQ ID NO: 2 представляет собой аминокислотную последовательность аналога мотилина.

SEQ ID NO: 3 представляет собой аминокислотную последовательность соединения 1 (MT095).

SEQ ID NO: 4 представляет собой аминокислотную последовательность соединения 2 (MT114).

SEQ ID NO: 5 представляет собой аминокислотную последовательность соединения 3 (MT116).

SEQ ID NO: 6 представляет собой аминокислотную последовательность соединения 4 (MT124).

SEQ ID NO: 7 представляет собой аминокислотную последовательность соединения 5 (MT126).

SEQ ID NO: 8 представляет собой аминокислотную последовательность соединения 6 (MT140).

SEQ ID NO: 9 представляет собой аминокислотную последовательность соединения 7 (MT141).

SEQ ID NO: 10 представляет собой аминокислотную последовательность соединения 8 (MT107).

SEQ ID NO: 11 представляет собой аминокислотную последовательность соединения 9 (MT115).

SEQ ID NO: 12 представляет собой аминокислотную последовательность соединения 10 (MT125).

SEQ ID NO: 13 представляет собой аминокислотную последовательность соединения 11 (MT128).

SEQ ID NO: 14 представляет собой аминокислотную последовательность соединения 12 (MT154).

SEQ ID NO: 15 представляет собой аминокислотную последовательность соединения 13 (MT155).

SEQ ID NO: 16 представляет собой аминокислотную последовательность сравнительного соединения 1 (¹³Leu-мотилин).

SEQ ID NO: 17 представляет собой аминокислотную последовательность сравнительного соединения 2 (MT139).

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED

<120> МОТИЛИН-ПОДОБНОЕ ПЕПТИДНОЕ СОЕДИНЕНИЕ, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРИДАННОЙ ЕМУ ТРАНСМУКОЗАЛЬНОЙ АБСОРБЦИОННОЙ СПОСОБНОСТЬЮ

<130> FA1511-10070

<150> JP 2009-177107

<151> 2009-07-29

<160> 17

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys

1 5 10 15

Glu Arg Asn Lys Gly Gln

20

<210> 2

<211> 22

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Аминокислотная последовательность гомологов мотилина.

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> ароматическая аминокислота или гетероциклическая ароматическая аминокислота

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> пролин или саркозин (Sar; или N-метилглицин, MeGly)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(13)

<223> метионин или лейцин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (19)..(19)

<223> пролин или аспарагин

<400> 2

Xaa Val Xaa Ile Phe Thr Tyr Gly Xaa Leu Gln Arg Xaa Gln Glu Lys

1 5 10 15

Glu Arg Xaa Lys Pro Gln

20

<210> 3

<211> 22

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Аминокислотная последовательность Соединения 1 (MT095)

<400> 3

Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys

1 5 10 15

Glu Arg Asn Lys Pro Gln

20

<210> 4

<211> 22

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Аминокислотная последовательность Соединения 2 (MT114)

<400> 4

Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys

1 5 10 15

Glu Arg Asn Lys Pro Gln

20

<210> 5

<211> 22

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Аминокислотная последовательность Соединения 3 (MT116)

<400> 5

Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Asp Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys

1 5 10 15

Glu Arg Pro Lys Pro Gln

20

<210> 6

<211> 22

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Аминокислотная последовательность Соединения 4 (MT124).

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> бета-гомофенилглицин (Phg(C#CH2))

<400> 6

Xaa Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys

1 5 10 15

Glu Arg Pro Lys Pro Gln

20

<210> 7

<211> 22

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Аминокислтная последовательность Соединения 5 (MT126).

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> бета-гомофенилглицин (Phg(C#CH2))

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> саркозин (Sar; или N-метилглицин, MeGly)

<400> 7

Xaa Val Xaa Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys

1 5 10 15

Glu Arg Pro Lys Pro Gln

20

<210> 8

<211> 22

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Аминокислотная последовательность соединения 6 (MT140).

<400> 8

Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys

1 5 10 15

Glu Arg Asn Lys Pro Gln

20

<210> 9

<211> 22

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Аминокислотная последовательность соединения 7 (MT141).

<400> 9

Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys

1 5 10 15

Glu Arg Asn Lys Pro Gln

20

<210> 10

<211> 22

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Аминокислотная последовательность соединения 8 (MT107).

<400> 10

Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys

1 5 10 15

Glu Arg Pro Lys Pro Gln

20

<210> 11

<211> 22

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Аминокислотная последовательность соединения 9 (MT115).

<400> 11

Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys

1 5 10 15

Glu Arg Pro Lys Pro Gln

20

<210> 12

<211> 22

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Аминокислотная последовательность соединения 10 (MT125).

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> бета-гомофенилглицин (Phg(C#CH2))

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> саркозин (Sar; или N-метилглицин, MeGly)

<400> 12

Xaa Val Xaa Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys

1 5 10 15

Glu Arg Pro Lys Pro Gln

20

<210> 13

<211> 22

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Аминокислотная последовательность соединения 11 (MT128).

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> ацетилнафтилаланин (Ac-Nal)

<400> 13

Xaa Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys

1 5 10 15

Glu Arg Asn Lys Pro Gln

20

<210> 14

<211> 22

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Аминокислотная последовательность соединения 12 (MT154).

<400> 14

Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Asp Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys

1 5 10 15

Glu Arg Pro Lys Pro Gln

20

<210> 15

<211> 22

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Аминокислотная последовательность соединения 13 (MT155).

<400> 15

Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Asp Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys

1 5 10 15

Glu Arg Pro Lys Pro Gln

20

<210> 16

<211> 22

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Аминокислотная последовательность сравнительного соединения 1 (13Leu-Motilin).

<400> 16

Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys

1 5 10 15

Glu Arg Asn Lys Gly Gln

20

<210> 17

<211> 22

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Аминокислотная последовательность сравнительного соединения 2 (MT139).

<400> 17

Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys

1 5 10 15

Glu Arg Asn Lys Gly Gln

20

1. Полипептид, имеющий последовательность, представленную нижеследующей общей формулой 1, используемый для лечения заболевания, связанного с нарушением функции желудочно-кишечного тракта:

[где все связи между аминокислотами, кроме X1-Val связи, являются амидными связями;
связь X1-Val представляет собой амидную связь или связь, представленную нижеследующей формулой 2

X1 представляет собой ароматическую аминокислоту или гетероароматическую аминокислоту;
Х2 представляет собой пролин или саркозин;
Х3 представляет собой глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту;
Х4 представляет собой метионин или лейцин;
Х5 представляет собой аспарагин или пролин],
или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Полипептид или его фармацевтически приемлемая соль по п.1, где
X1 представляет собой фенилаланин или β-гомофенилглицин.

3. Полипептид, который представлен последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3-15, или его фармацевтически приемлемая соль, используемый для лечения заболевания, связанного с нарушением функции желудочно-кишечного тракта.

4. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания, связанного с нарушением функции желудочно-кишечного тракта, которая содержит эффективное количество полипептида или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп.1-3 и фармацевтически приемлемый носитель.

5. Фармацевтическая композиция по п.4, где заболевание, связанное с нарушением функции желудочно-кишечного тракта, выбрано из группы, состоящей из функциональной диспепсии, диабетического гастропареза, рефлюксной гастроэзофагеальной болезни, синдрома раздраженного кишечника, чрезмерного развития микрофлоры тонкого кишечника, псевдонепроходимости толстой кишки, паралитической непроходимости кишечника, хронической идиопатической псевдообструкции кишечника и постоперационной непроходимости кишечника.

6. Фармацевтическая композиция по п.4 или 5, которая предназначена для трансмукозального введения.

7. Фармацевтическая композиция по п.6, где трансмукозальное введение представляет собой легочное или интраназальное введение.