Иммуноферментная тест-система для количественного определения микополисахаридов и их производных в пыли окружающей среды

Изобретение относится к области биотехнологии и экологии, в частности к тест-системам для определения содержания микополисахаридов и их производных, имеющих в своем составе участки, аналогичные синтетическому линейному нона-β-(1→3)-D-глюкозиду в окружающей среде, в том числе в пыли помещений, и может быть использовано для оценки пирогенности объектов окружающей среды при проведении экологического мониторинга жилых и производственных помещений с целью количественного определения пирогенной нагрузки пыли окружающей среды при помощи ингибиторного иммуноферментного анализа на твердой фазе. Тест-система включает в себя планшет с иммобилизованным на внутренней поверхности лунок конъюгатом синтетического линейного нона-β-(1→3)-D-глюкозида с бычьим сывороточным альбумином, калибраторы, содержащие растворы синтетического линейного нона-β-(1→3)-D-глюкозида; лиофилизованную специфическую поликлональную кроличью антисыворотку; конъюгат антивидовых антител против IgG(H+L) кролика с пероксидазой из хрена; 25-кратный концентрат 0,1М фосфатно-солевого буферного раствора с 0,05% Tween-20 (ФСБ-Т) рН 7,2-7,4; раствор для разведения поликлональной антисыворотки; раствор для разведения конъюгата антивидовых антител против IgG(H+L) кролика с пероксидазой из хрена; хромоген; стоп-реагент. Изобретение является удобным и эффективным для исследований в области экологии. 2 табл., 6 пр.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и экологии, в частности к тест-системам для определения содержания микополисахаридов и их производных, имеющих в своем составе участки, аналогичные синтетическому линейному нона-β-(1→3)-D-глюкозиду, в окружающей среде, в том числе в пыли помещений, и может быть использовано для оценки пирогенности объектов окружающей среды при проведении экологического мониторинга жилых и производственных помещений.

Оценка пирогенности помещений в настоящее время рассматривается с точки зрения влияния ее факторов на провоцирование разных типов иммунологических реакций макроорганизма. В частности известно, что микополисахариды обладают конъюгатными свойствами в определенных условиях в отношении воздействия истинных аллергенов на организм человека. Поэтому определение количества таких пирогенов, как различные производные клеточных стенок плесневых и дрожжевых грибов в окружающей среде становится актуальным для людей с генетической предрасположенностью к гиперчувствительности.

Значительная часть полисахаридов клеточной стенки плесневых и дрожжевых грибов представлена разветвленными и линейными бета(1-3)-глюканами. Соответственно в пыли помещений могут встречаться различные микополисахариды и их производные, причем разной массы.

В настоящее время известно несколько коммерческих наборов для выявления природных разветвленных (1-3)-бета-D-глюканов, базирующихся на реакции коагуляции при активации каскада ферментов, выделенных из амебоцитов мечехвостов Limulus. Это тест-системы BETA-Glucan Test Maruha (MARUHA, Япония); BETA-Glucan Test Wako (WAKO, Япония); FUNGITEC G Test (FUNGITEC-G, Япония); FUNGITEC G Test MK (FUNGITEC-MK, Япония); Fungitell (МА, США); GLUCATELL (CAPE COD, США).

Недостатком данных коммерческих тест-систем является необходимость использования апирогенных расходных материалов и реагентов, приготовленных с использованием апирогенной воды, что значительно усложняет проведение анализов. Также некоторые из названных тест-систем доступны только в стране производителя.

Известен диагностический набор для обнаружения микополисахаридов в исследуемых образцах, в том числе образцах домашней пыли, содержащий моноклональные антитела А10А и В3В, специфичные к линейным бета-(1-3) глюканам и разветвленным бета(1-3)(1-6)- глюканам грибов рода Candida и Cryptococcus neoformans. Моноклональные антитела предназначены для постановки иммуноферментного и иммунофлуоресцентного анализов (WO2004036222, С07К16/14, опубл. 29.04. 2004).

Недостатком аналога является узкая специфичность моноклональных антител, обнаруживающих перекрестное связывание с микополисахаридами грибов только рода Candida и вида Cryptococcus neoformans.

Известен диагностический набор для определения наличия микополисахаридов в клинических образцах, содержащий бета-(1-3)-глюкансвязывающий агент, выбранный из группы гликосфинголипидов, включающей лактизил церамид (LacCer), галактозил церамид (GalCer), глоботриозил церамид и асиалоганглиозид-GM1, и антитела к природному водорастворимому бета-(1-3)-глюкану. Предпочтительно бета-(1-3)- глюкансвязывающий агент прикреплен к твердой фазе (WO9931510, G01N33/566, опубл. 24.06. 1999).

Существенным недостатком известного диагностического набора является сложность процесса пробоподготовки, что снижает эффективность использования набора при скрининговых исследованиях.

Наиболее близким аналогом является иммуноферментная (ИФА) тест-система для определения микополисахаридов в пыли окружающей среды, содержащая иммунологический планшет с иммобилизованным в лунках ламинарином, калибраторы, содержащие растворы ламинарина, поликлональную кроличью антисыворотку, содержащую антитела к конъюгату ламинарина с бычьим сывороточным альбумином, меченые пероксидазой антивидовые антитела лошади против иммуноглобулинов кролика, раствор для промывания планшетов, раствор для разведения поликлональной антисыворотки; раствор для разведения конъюгата антивидовых антител, раствор ортофенилендиамина в качестве хромогена, перекись водорода и стоп-реагент - 2 н. раствор HCl (Douwes J., Doekes G., Montijn R., Heederik D., Brunekreef B. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8795207?ordinalpos=2&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DefaultReportPanel.Pubmed_RVDocSum // Appl. Environ. Microbiol, 1996. V.62. P.3176-3182).

Недостатком ближайшего аналога является использование гетерогенных полисахаридных материалов с трудноконтролируемым содержанием бета-глюканового компонента, что значительно снижает чувствительность и специфичность данной тест-системы.

Задачей изобретения является разработка высокоспецифичной и чувствительной ИФА тест-системы для количественного определения микополисахаридов и их производных, имеющих в своем составе участки, аналогичные синтетическому линейному нона-β-(1→>3)-D-глюкозиду, пригодной для оценки пирогенности пыли производственных и жилых помещений и контроля эффективности элиминационных мероприятий.

Технический результат изобретения заключается в повышении специфичности и чувствительности анализа за счет достоверного выявления микополисахаридов и их производных, имеющих в своем составе участки, аналогичные синтетическому линейному нона-β-(1→3)-D-глюкозиду, причем являющихся водорастворимыми соединениями, и обеспечении возможности одновременно исследовать большое количество образцов.

Технический результат достигается тем, что в качестве покровного антигена твердофазного иммуносорбента и иммуногена для получения специфической поликлональной антисыворотки используется конъюгат синтетического нона-β-(1→3)-D-глюкозида с бычьим сывороточным альбумином, в качестве калибраторов используют синтетический линейный нона-β-(1→3)-D-глюкозид, представляющий собой структуру, одинаковую с некоторыми участками молекул микополисахаридов и их производных. Кроме того, использование калибраторов стандартного состава обеспечивает точность построения калибровочных кривых, что позволяет повысить точность расчета концентрации микополисахаридов и их производных в исследуемых образцах.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Тест-система для количественного определения микополисахаридов и их производных методом ингибиторного твердофазного иммуноферментного анализа содержит:

1. Иммуносорбент - планшет разборный из 12 восьмилуночных стрипов с иммобилизованным в лунках конъюгатом синтетического линейного нона-β-(1→3)-D-глюкозида с бычьим сывороточным альбумином, готовый к употреблению;

2. Шесть калибраторов, содержащих растворы синтетического линейного нона-β-(1→3)-D-глюкозида в концентрациях 0; 3,125; 6,25; 12,5; 25 и 50 мкг /мл, жидкие, готовые к употреблению;

3. Специфическая поликлональная кроличья антисыворотка, содержащая антитела класса G к конъюгату синтетического линейного нона-β-(1→3)-D-глюкозида с бычьим сывороточным альбумином, лиофилизированная;

4. Конъюгат - конъюгат антивидовых антител против IgG (H+L) кролика с пероксидазой из хрена, жидкий 50-кратный концентрат;

5. Концентрат раствора для промывания планшетов - 25-кратный 0,1М фосфатно-солевой буферный раствор, содержащий 0,05% Tween-20 (ФСБ - Т);

6. Раствор для разведения поликлональной антисыворотки (РРПА), жидкий, готовый к употреблению;

7. Раствор для разведения конъюгата (РРК), жидкий, готовый к употреблению;

8. Хромоген - однокомпонентный раствор тетраметилбензидин (производства США), жидкий, готовый к употреблению;

9. Стоп-реагент - 5%-ный раствор серной кислоты, жидкий, готовый к употреблению.

10. 2 пленки для заклеивания планшета.

11. 2 пластиковые ванночки для реагентов.

12. 16 наконечников для автоматической пипетки.

13. Инструкция по применению.

Калибраторы представляют собой стандартные растворы, содержащие синтетический линейный нона-β-(1→3)-D-глюкозид в концентрациях 50 мкг/мл, 25 мкг/мл, 12,5 мкг/мл, 6,25 мкг/мл, 3,125 мкг/мл и 0 мкг/мл. В отличие от природных гетерогенных полисахаридных материалов, применяемых в известных аналогах, использование в качестве калибратора индивидуального синтетического олигосахарида позволяет строго стандартизовать калибраторы, что обеспечивает повышение точности расчета количественного содержания микополисахаридов и их производных в исследуемых образцах.

Поликлональная антисыворотка (ПА) содержит специфические антитела класса G к конъюгату синтетического линейного нона-β-(1→3)-D-глюкозида с бычьим сывороточным альбумином и получена путем иммунизации кроликов нона-β-(1→3)-D-глюкозидом, конъюгированным с носителем - бычьим сывороточным альбумином. Для повышения качества ПА и устранения неспецифических антител к носителю, антисыворотку истощают бычьим сывороточным альбумином в соотношении 1:1 (мкл:мг).

В качестве конъюгата антивидовых антител используют антитела против иммуноглобулина G кролика, меченные пероксидазой из хрена, в частности коммерческий препарат «Антитела диагностические против IgG(H+L) кролика, меченные пероксидазой.», произведенный предприятием по производству бакпрепаратов НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи.

Принцип определения микополисахаридов и их производных с помощью предлагаемой тест-системы основан на проведении ингибиторного ИФА, в ходе которого известный избыток специфической поликлональной кроличьей антисыворотки взаимодействует в лунках стрипов планшета с аликвотами препаратов, содержащих природные микополисахариды и их производные или синтетический линейный нона-β-(1→3)-D-глюкозид (исследуемая проба или калибратор) и иммобилизованным покровным антигеном, в результате чего происходит образование комплекса «антиген-антитело» в растворе и на твердой фазе. После удаления несвязавшихся с твердой фазой компонентов реакционной смеси и добавления в лунки планшета антивидовых антител против кроличьих IgG, меченных пероксидазой, происходит включение ферментной метки в иммунный комплекс на твердой фазе. В результате реакции с раствором хромогена образуется окрашенный продукт, интенсивность окраски которого обратно-пропорциональна концентрации микополисахаридов и их производных в анализируемом образце. После построения калибровочной кривой расчетным путем определяют концентрацию микополисахаридов и их производных в анализируемых образцах.

В качестве тестируемого материала могут быть исследованы образцы пыли жилых и производственных помещений, постельных принадлежностей, мягкой мебели, мягких игрушек.

Набор реагентов в предлагаемой тест-системе рассчитан на проведение одновременно 48 анализов при исследовании анализируемых образцов в дублях, включая постановку калибраторов. Компоновка набора допускает возможность дробного использования реагентов для проведения нескольких серий анализов по мере поступления материала для исследования.

Тест-система по изобретению характеризуется хорошей воспроизводимостью и достоверностью результатов (коэффициент вариации не более 8%).

Чувствительность тест-системы составляет не менее 2,0 мкг/ мл синтетического линейного нона-β-(1→3)-D-глюкозида.

Специфичность определения микополисахаридов и их производных составляет 95,63-98,4% . На большом количестве экспериментов подтверждено, что тест-система позволяет выявить в очень низких концентрациях водорастворимые микополисахариды и их производные, содержащие в своем составе участки (структуры), аналогичные синтетическому линейному нона-β-(1→3)-D-глюкозиду.

Изобретение иллюстрируется, но не ограничивается следующими примерами.

Пример 1. Приготовление компонентов тест-системы

Приготовление компонентов предлагаемой ИФА-тест-системы осуществляется следующим образом.

1. Получение иммуносорбента

Берут стандартные 96-луночные (12 восьмилуночных стрипов) плоскодонные разборные планшеты для иммуноферментного анализа (фирмы“Costar”, США, кат. № 2592). Берут конъюгат синтетического линейного нона-β-(1→3)-D-глюкозида с бычьим сывороточным альбумином в количестве 1 мкг и растворяют его в 1 мл карбонат-бикарбонатного буфера (0,05 М, рН 9,4). Полученный раствор конъюгата вносят по 100 мкл в каждую лунку планшета. Далее планшеты инкубируют сначала при температуре 37°С в течение 1 ч, а затем при 4°С в течение 16 ч. По окончании инкубации удаляют жидкость из лунок. Далее планшеты высушивают при 37°С до полного высыхания, упаковывают в полиэтиленовые пакеты поштучно под вакуумом и используют при комплектовании набора компонентов тест-системы.

2. Приготовление калибраторов

Калибраторы (50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 и 0 мкг/мл) готовят путем растворения соответствующих навесок синтетического линейного нона-β-(1→3)-D-глюкозида в 1 мл 0,1М фосфатно-солевого буфера (рН 7,2 ±2), содержащего 0,05% Tween-20 и 0,016 г/л метиленового зеленого (кат. № М7766 Sigma, США). Далее калибраторы разливают в пробирки и используют при комплектовании тест-системы.

3. Получение специфической поликлональной антисыворотки

Специфическую поликлональную антисыворотку получают иммунизацией кроликов синтетическим линейным нона-β-(1→3)-D-глюкозидом, конъюгированным с бычьим сывороточным альбумином.

Для этого животным подкожно вводят сначала 2,5 мг конъюгата в 1 мл физиологического раствора в присутствии 0,4 мл полного адьюванта Фрейнда, а затем через 28 дней - 1 мг конъюгата в 500 мкл физиологического раствора.

Через 10 дней после последнего введения у животных берут кровь из ушной вены и инкубируют ее при температуре 37°С в течение 30 мин, а затем при температуре 4°С в течение 1 ч. Далее кровь центрифугируют 10 мин при 2 000 об/мин и отбирают специфическую поликлональную антисыворотку.

Полученную специфическую поликлональную антисыворотку помещают в пластиковую пробирку в количестве 10 мкл, прибавляют 200 мкл раствора бычьего сывороточного альбумина с концентрацией 50 мг/мл, лиофильно высушивают и используют при комплектовании тест-системы.

4. Приготовление концентрата фосфатно-солевого буферного раствора с твином (ФСБ-Т) для промывания планшетов (25-кратный концентрат)

Концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином (ФСБ-Т) готовят путем растворения 70 г натрия двузамещенного фосфата натрия кристаллогидрата, 5 г однозамещенного фосфата калия, 5 г хлористого калия, 200 г хлористого натрия в 1 л дистиллированной воды, прибавления 0,05 % (V/V) Tween-20 и доведения рН раствора до 7,2±2. Разливают во флаконы и используют при комплектовании тест-системы.

5. Приготовление раствора для разведения поликлональной антисыворотки (РРПА).

РРПА готовят путем прибавления к 10 мл рабочего раствора ФСБ-Т 80 мкл раствора бриллиантового зеленого (кат. № В6756 Sigma, США) с концентрацией 2 г/л. Разливают во флаконы и используют при комплектовании тест-системы.

6. Приготовление раствора для разведения конъюгата антител диагностических, меченных пероксидазой (РРК)

РРК готовят путем прибавления к 10 мл ФСБ-Т 80 мкл раствора метиленового голубого (кат. № М9140 Sigma, США) с концентрацией 2 г/л. Разливают во флаконы и используют при комплектовании тест-системы.

7. Приготовление стоп-реагента

Стоп-реагент готовят путем прибавления к 95 мл дистиллированной воды 5 мл концентрированной серной кислоты. Полученный раствор разливают во флаконы и используют при комплектовании тест-системы.

8. Приготовление раствора хромогена

В качестве раствора хромогена используют коммерческий однокомпонентный раствор тетраметилбензидина (ТМБ) производства США.

Пример 2. Сбор образцов пыли

Для анализа собирают пыль с помощью пылесоса. Для этого в разъеме металлических трубок пылесоса зажимают стерильный фильтр - кусок хлопчато-бумажной ткани размером примерно 10×10 см. Диаметр отверстий между волокнами ткани должен быть не более 0,1 мм.

Пыль собирают с площади поверхности не менее 0,5×0,5 м в течение 1,5-2 мин, причем в случае определения концентрации микополисахаридов и их производных в матраце, подушках, одеялах, коврах, мягкой мебели желательно обработать разные стороны и места объектов. Объем собранной пыли должен быть не менее 1 чайной ложки. Пыль вместе с фильтром помещают в пластиковый пакет и снабжают этикеткой. Хранить образцы пыли следует при температуре -20°С.

Пример 3. Приготовление проб для проведения анализа

Взвешивают 10 мг пыли, помещают в пробирку типа «Eppendorf», прибавляют 1 мл рабочего раствора ФСБ-Т, перемешивают. Пробирку тщательно закрывают при помощи парафильма. Пробирку помещают в плоскотельный термостат. Суспензию нагревают в течение 60 мин при температуре 95°С . Необходимо следить, чтобы крышка пробирки не открывалась при нагревании. После охлаждения до комнатной температуры, центрифугируют 5 мин (1500 об/мин). Надосадочную жидкость используют в качестве пробы при проведении ИФА.

Пример 4. Применение тест-системы для проведения анализа

Калибраторы, РРПА, РРК, раствор хромогена и стоп- реагент готовы к применению. Рабочие растворы поликлональной антисыворотки, конъюгата и раствора для промывания планшетов готовят перед проведением анализа.

А. Подготовка рабочих растворов для проведения анализа:

А1. Приготовление рабочего раствора ФСБ-Т для промывания планшетов.

Отбирают 25 мл концентрата раствора, переносят в чистую мерную емкость, доводят объем дистиллированной водой до метки 600 мл и перемешивают. В случае обнаружения осадка в концентрате флакон выдерживают при температуре от 35 до 37°C до полного растворения осадка.

Приготовленный рабочий раствор ФСБ-Т хранят не более 24 ч при температуре 4-8°C .

А2. Приготовление рабочего разведения поликлональной антисыворотки (ПА).

В пробирку с лиофилизированной ПА вносят 5 мл РРПА, перемешивают до полного растворения.

Рабочий раствор ПА хранят не более 2 недель при температуре 4-8°C.

А3. Приготовление рабочего разведения конъюгата антивидовых антител против кроличьих IgG с пероксидазой из хрена.

В пробирку с 2 мл РКК вносят 10 мкл конъюгата (в расчете на 2 стрипа) или во флакон с 12 мл РКК помещают весь объем (60 мкл) конъюгата (в расчете на 12 стрипов).

Рабочий раствор конъюгата хранят не более 2 ч при температуре 4-8°C.

Б. Проведение ингибиторного иммуноферментного анализа (ИФА).

В случае дробного использования тест-системы отбирают необходимое количество стрипов. Остальные стрипы помещают обратно в пакет и хранят в плотно закрытом пакете при температуре 4-8°C.

Во все лунки вносят по 245 мкл рабочего раствора ФСБ-Т. Выдерживают при комнатной температуре 1-2 мин. Удаляют из лунок жидкость стряхиванием и постукиванием по разложенной на твердой поверхности фильтровальной бумаге.

В каждые 2 параллельные лунки иммуносорбента последовательно вносят по 50 мкл калибраторов с концентрацией - 50 мкг/мл, 25 мкг/мл, 12,5 мкг/мл, 6,25 мкг/мл, 3,125 мкг/мл, 0 мкг/мл. В последующие лунки вносят по 50 мкл исследуемых проб. Далее во все лунки вносят по 50 мкл рабочего разведения ПА. Стрипы заклеивают пленкой и инкубируют в термостате 40 мин при температуре 37°С. После этого удаляют жидкость из лунок и трижды промывают лунки по 245 мкл рабочего раствора ФСБ-Т. Удаляют из лунок жидкость, как указано выше.

Затем во все лунки вносят по 100 мкл рабочего раствора конъюгата. Заклеивают стрипы пленкой и инкубируют в течение 30 мин при температуре 37°С . Для внесения конъюгата рекомендуется использовать пластиковую ванночку и одноразовые наконечники.

По окончании инкубации удаляют жидкость из лунок, трижды промывают лунки рабочим раствором ФСБ-Т, а затем трижды промывают дистиллированной водой. Удаляют из лунок жидкость, как указано выше.

Во все лунки вносят по 100 мкл раствора ТМБ. Инкубируют при комнатной температуре в темноте в течение 3-5 мин. Для внесения раствора ТМБ необходимо использовать новую пластиковую ванночку и одноразовые наконечники.

Визуально протекание ферментативной реакции определяется по появлению голубого окрашивания реакционной смеси в лунках, в которые были внесены калибраторы.

Реакцию останавливают путем прибавления во все лунки по 100 мкл стоп-реагента (при этом цвет реакционной массы в лунках меняется с голубого на желтый).

Измеряют оптическую плотность (ОП) растворов в лунках при длине волны, равной 450 нм, строят концентрационную кривую и по графику определяют концентрацию микополисахаридов и их производных в исследуемой пробе. Далее расчетным путем получают значения количественного содержания микополисахаридов и их производных в образце пыли.

Пример 5. Использование тест-системы для выявления полисахаридов различной природы из разных источников

Для анализа взвешивают по 5 мг полисахаридов, выделенных из пекарских дрожжей (S. cerevisiae) (кат. № G5011 Sigma, США), водорослей (Euglena gracilis) (кат. № 89862 Sigma, США), панциря креветок (хитин) (кат. № С9752 Sigma, США), готовят растворы в ФСБ-Т с концентрацией 1 мг/мл, нагревают, как указано в примере 3, путем разведения готовят растворы с концентрацией 10 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, которые используют в качестве тестируемых проб при проведении ингибиторного ИФА, как описано в примере 4.

Таблица 1

Определение природных полисахаридов различного происхождения

(в ед. ОП)

Концентрация полисахарида
мкг/мл
Величина оптической плотности
Полисахарид из дрожжей Полисахарид из
водорослей
Хитин
10 1,632 1,969 1,916
1 1,874 1,949 1,901
0,1 2,019 1,845 1,925
Отрицательный контроль (PBS) 2,046
Положительный контроль (покровный антиген,
1 мкг/мл)
0,412

Данные табл.1 свидетельствуют о том, что тест-система по изобретению направлена на выявление именно природных бета-глюканов, растворимых в водных растворах и имеющих в своей структуре участки, доступные для иммунохимического связывания с антителами, полученными против иммуногена, т.е. структурно аналогичные синтетическому линейному нона-β-(1→3)-D-глюкозиду.

Пример 6. Использование тест-системы для количественного определения микополисахаридов и их производных в пыли постельных принадлежностей.

Для анализа собирают с помощью пылесоса пыль с постельных принадлежностей, как указано в примере 2. Приготавливают пробу для анализа, как указано в примере 3.

Постановку реакции ингибиторного ИФА и определение концентрации производных микополисахаридов проводят так, как описано в примере 4.

По построенному калибровочному графику определяют концентрацию микополисахаридов и их производных в пробе в мкг синтетического линейного нона-β-(1→3)-D-глюкозида. Далее расчетным путем получают данные количественного содержания микополисахаридов и их производных в образце пыли в мкг нона-β-(1→3)-D-глюкозида/г пыли. Результаты представлены в табл.2.

Таблица 2

Определение концентрации микополисахаридов и их производных в образцах пыли.

Объект исследования Количество производных микополисахаридов (мкг нона-β-(1→3)-D-глюкозида/г пыли)
Ковер 1200
Постельные принадлежности 200
Кресло 470
Мягкая игрушка 650

Полученные данные свидетельствуют, что в образцах пыли присутствуют растворимые производные бета-глюканов, имеющих участки, аналогичные синтетическому линейному нона-β-(1→3)-D-глюкозиду. Таким образом, тест-система позволяет быстро и эффективно определять концентрацию микогенных полисахаридов в различных объектах, с которыми контактирует человек, и может быть использована для проведения экологического мониторинга жилых и производственных помещений с целью количественного определения пирогенной нагрузки пыли окружающей среды при помощи ингибиторного иммуноферментного анализа на твердой фазе.

1. Тест-система для количественного определения микополисахаридов и их производных в пыли окружающей среды, основанная на ингибиторном методе иммуноферментного анализа и отличающаяся тем, что содержит иммуносорбент, представляющий собой разборный иммунологический планшет с иммобилизованным в лунках конъюгатом синтетического линейного нона-β-(1→3)-D-глюкозида с бычьим сывороточным альбумином, калибраторы, содержащие растворы синтетического линейного нона-β-(1→3)-D-глюкозида в концентрациях 0; 3,125; 6,25; 12,5; 25 и 50 мкг/мл, лиофилизованную поликлональную кроличью антисыворотку, содержащую антитела класса G к конъюгату синтетического линейного нона-β-(1→3)-D-глюкозиду с бычьим сывоточным альбумином, конъюгат антивидовых антител с пероксидазой из хрена, концентрат буферного раствора, раствор для разведения поликлональной антисыворотки; раствор для разведения конъюгата антивидовых антител, хромоген, стоп-реагент.

2. Тест-система по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит поликлональную кроличью антисыворотку, истощенную бычьим сывороточным альбумином в соотношении 1:1 (мкл:мкг).

3. Тест-система по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве конъюгата антивидовых антител она содержит антивидовые антитела против IgG(H+L) кролика, меченные пероксидазой из хрена.

4. Тест-система по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве концентрата буферного раствора она содержит 25-кратный 0,1М фосфатно-солевой раствор с 0,05% Tween-20 (ФСБ-Т) рН 7,2-7,4.

5. Тест-система по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве хромогена она содержит коммерческий однокомпонентный раствор тетраметилбензидина производства США.

6. Тест-система по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве стоп-реагента она содержит 5%-ный раствор серной кислоты.

7. Тест-система по п. 1, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит пленки для заклеивания планшета, пластиковые ванночки для реагентов, наконечники для автоматической пипетки и инструкцию по применению.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для дооперационного прогноза осложненного течения раннего посттрансплантационного периода.

Изобретение относится к ветеринарии. Способ диагностики лептоспироза сельскохозяйственных животных, включающий определение наличия антител к антигенам семи серогрупп L.hebdomadis, L.pomona, L.tarassovi, L.grippotyphosa, L.canicola, L.sejroe и L.icterohaemorrhagiae в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что в качестве антигена применяют смешанные в равных количествах антигенные белки из лептоспир трех серогрупп - L.tarassovi, L.grippotyphosa и L.hebdomadis.
Изобретение относится к области медицины, а именно к хирургии, и может быть использовано для прогнозирования тяжести течения послеоперационного периода у больных калькулезным холециститом.
Изобретение относится к ветеринарии, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для серологической диагностики вирусных желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа, преимущественно рота-, коронавирусного энтеритов, вирусной диареи крупного рогатого скота.
Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии и аллергологии, и может быть использовано для прогнозирования развития атопических заболеваний у новорожденных.

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения количества и (или) функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения количества и (или) функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Изобретение относится к способу определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики высокодифференцированного рака у больных с узловыми формами заболеваний щитовидной железы. Для этого проводят тонкоигольную аспирационную биопсию узловых образований щитовидной железы под контролем ультразвукового исследования. При этом пункционную иглу с содержащимся в ней аспиратам промывают двукратно 1 мл изотонического раствора натрия хлорида, затем центрифугируют, отбирают супернатант и методом иммуноферментного анализа определяют тиреоглобулин. Причем если содержание тиреоглобулина меньше 272,5 нг/мл - предполагают отсутствие высокодифференцированного рака щитовидной железы, в интервале 272,5-355,5 нг/мл - риск высокодифференцированного рака щитовидной железы, выше 355,5 нг/мл предполагают высокодифференцированный рак щитовидной железы. Изобретение обеспечивает дооперационную дифференциальную диагностику высокодифференцированного рака у больных с узловыми формами заболеваний щитовидной железы, а также обеспечивает возможность дальнейшего выбора адекватного метода лечения. 3 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано для прогнозирования формирования окклюзионной постгеморрагической гидроцефалии у недоношенных детей с экстремально низкой массой тела при рождении. Недоношенному ребенку на основании иммуноферментного исследования сыворотки пуповинной и периферической крови определяют концентрацию нейронспецифической енолазы (NSE), концентрацию мозгового нейротрофического фактора (BDNF), концентрацию васкулоэндотелиального фактора (VEGF) в пуповинной крови и концентрацию васкулоэндотелиального фактора (VEGF) в периферической крови на 7-е сутки жизни, вычисляют прогностический индекс (PI) по формуле: PI=-0,007×X1+0,006×X2-0,05×Х3+0,0004×Х4-3,9, где X1 - содержание VEGF в пуповинной крови при рождении (нг/мл); Х2 - содержание VEGF в периферической крови на 7 сутки жизни (нг/мл); Х3 - содержание NSE в пуповинной крови (мкг/л); Х4 - содержание BDNF в пуповинной крови (нг/мл); Const=-3,9. При PI более 0 делают заключение об отсутствии риска формирования окклюзионной постгеморрагической гидроцефалии, а при PI менее 0 прогнозируют высокий риск развития данной патологии. Изобретение позволяет повысить эффективность прогноза формирования окклюзионной постгеморрагической гидроцефалии у недоношенных детей с экстремально низкой массой тела при рождении до 73%. 2 пр.
Предлагаемое изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения иммуноферментной тест-системы для определения эпитопов оболочечного белка вируса Пуумала протективной направленности в вакцинных препаратах против геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Охарактеризованный способ включает получение мышиных моноклональных антител, обладающих нейтрализующей активностью по отношению к вирусу Пуумала. Сорбцию таких антител на поверхность иммунопанели. Выделение IgG из сывороток крови реконвалесцентов ГЛПС с высокими титрами специфических антител к вирусу Пуумала. Приготовление конъюгата специфических IgG с пероксидазой хрена. Представленное изобретение позволяет с одинаковой чувствительностью выявлять оболочечный белок как живого, так и инактивированного вируса Пуумала, посредством чего контролировать содержание в вакцинном препарате указанного вируса, являющегося возбудителем геморрагической лихорадки с почечным синдромом. 2 табл., 1 пр.
Изобретение относится к медицине. Способ характеризуется тем, что в сыворотке крови пациента определяют концентрации пепсиногенов I и II, вычисляют отношение концентрации пепсиногена I к концентрации пепсиногена II. При величине данного отношения, равной или ниже нижней границы нормы, определяют концентрацию интерферона-γ (IFNγ) в супернатанте пробы крови данного пациента после ее инкубации с раково-эмбриональным антигеном (РЭА) и без него, вычисляют индекс влияния (ИВ) РЭА на продукцию IFNγ (ИВ РЭА IFNγ) клетками крови по формуле: ИВ РЭА IFNγ=А/Б, где А - концентрация IFNγ в супернатанте пробы крови после ее инкубации с РЭА, Б - концентрация IFNγ в супернатанте пробы крови без ее инкубации с РЭА, и при величине ИВ РЭА IFNγ, равной или ниже 1,2, делают вывод о наличии у пациента дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка 2-й или 3-й степени, а при величине ИВ РЭА IFNγ, превышающей 1,2, делают вывод об отсутствии дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка у данного пациента или о наличии у него дисплазии 1-й степени. При использовании для иммуноферментного анализа наборов реагентов «Пепсиноген 1 - ИФА - БЕСТ» и «Пепсиноген 2 - ИФА - БЕСТ» производства ЗАО «Вектор-Бест» нижнюю границы нормы отношения концентрации пепсиногена I к концентрации пепсиногена II принимают равной трем. Способ позволяет выявить дисплазию (клеточный атипизм) эпителия слизистой оболочки желудка 2-й или 3-й степени у пациентов, у которых еще не была обнаружена атрофия слизистой оболочки желудка, т.е. предлагаемый способ дает возможность формировать группы риска пациентов по развитию у них опухолевой патологии желудка и проводить ее профилактику. Способ высокочувствителен, высокоспецифичен, низкоинвазивен. 1 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики первичного и вторичного иммунного ответа на вирус краснухи. Разделение типов иммунного ответа на первичный и вторичный осуществляют на основании рассчитанных с помощью ROC-анализа пороговых критериев для IgG1 и IgG3 субклассов по результатам определения количества специфических антител. Определяют субклассы IgG1 и IgG3 с помощью ИФА-анализа. При получении пороговых значений для IgG1<62,76% и для IgG3>18,63% от общего количества противокраснушных IgG-антител диагностируют первичный иммунный ответ. При получении пороговых значений для IgG1>62,76%, и для IgG3<18,63% от общего количества противокраснушных IgG-антител диагностируют вторичный иммунный ответ. Использование данного способа позволяет провести дифференциальную диагностику первичного и вторичного иммунного ответа на вирусы краснухи, позволяющего независимо от способа получения этого иммунитета (вакцинация или инфекция) четко различать первый или повторный контакт организма с вирусом краснухи, что способствует выявлению среди лиц с неизвестным прививочным анамнезом группу первичных больных краснухой. 3 табл., 1 пр.

Изобретение относится к медицине, преимущественно к фтизиатрии, и может быть использовано при оценке активности туберкулезной инфекции у детей и подростков. Для этого в пробы цельной крови пациента вносят специфические антигены: ППД-Л, Rv2660c, ESAT-6, гибридного белка CFP10-ESAT-6. Определяют уровень ИФН-γ в пробах через 72 часа после внесения в кровь специфических антигенов. При увеличении уровня ИФН-γ - положительной реакции на ППД-Л, Rv2660c, ESAT-6 и отрицательной - отсутствие изменения уровня ИФН-γ - на гибрид CFP10-ESAT-6 диагностируют латентную туберкулезную инфекцию. При положительной на ППД-Л, Rv2660c, ESAT-6 и гибрид CFP10-ESAT-6 - активную туберкулезную инфекцию. При положительной на ППД-Л и отрицательной одновременно на Rv2660c, ESAT-6, гибрид CFP10-ESAT-6 - поствакцинальную аллергию. Использование данного способа позволяет проводить дифференциальную диагностику латентной и активной туберкулезной инфекции у детей, что способствует ранней постановке диагноза и назначению специфического лечения. 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской иммунологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики первичного и вторичного иммунного ответа на вирус эпидемического паротита. Проводят разделение типов иммунного ответа на первичный и вторичный на основании рассчитанных с помощью ROC-анализа пороговых критериев для IgG1 и IgG3 субклассов по результатам определения количества специфических противопаротитных антител, принадлежащих к субклассам IgG1 и IgG3 с помощью ИФА-анализа. При получении пороговых значений для IgG1<55% и для IgG3>37,3% от общего количества противопаротитных IgG-антител диагностируют первичный иммунный ответ. При получении пороговых значений для IgG1>55% и для IgG3<37,3% от общего количества противопаротитных IgG-антител диагностируют вторичный иммунный ответ. Использование данного способа позволяет проводить дифференциальную диагностику первичного и вторичного иммунного ответа на вирус эпидемического паротита, что в свою очередь позволит выявить группу первичных больных эпидемическим паротитом с угрозой осложнения орхитом. 3 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к профессиональной патологии и пульмонологии, и может быть использовано для диагностики профессиональной хронической обструктивной болезни легких, сформировавшейся в условиях действия токсических промаэрозолей. Для этого в сыворотке крови больного ХОБЛ, экспонированного к токсическим промаэрозолям с превышением ПДК токсических веществ в воздухе рабочей зоны в 1,5 раза и более, со стажем работы в условиях действия токсических промаэрозолей 17 лет и более, методом твердофазного иммуноферментного анализа сэндвич-типа (ELISA) определяют концентрацию интерлейкина 1β, трансформирущего фактора роста β, фактора роста эндотелия сосудов. Затем вычисляют значение регрессионной функции по математической формуле 0,027⋅IL1β+0,00009⋅TGFβ-0,0003⋅VEGF, где IL1β - концентрация интерлейкина 1β сыворотки, пг/мл, TGFβ - концентрация трансформирующего фактора роста β сыворотки, пг/мл, VEGF - концентрация фактора роста эндотелия сосудов сыворотки, пг/мл, и при результате, равном или превышающем 0,2, делают вывод о том, что в данном случае ХОБЛ сформировалась при действии токсических промаэрозолей. Изобретение позволяет диагностировать случаи профессиональной ХОБЛ, сформировавшейся при действии токсического газа, что улучшит качество лечения этой группы больных за счет индивидуализации терапевтической стратегии с учетом характеристик фенотипа, а также повышает объективность экспертизы связи заболевания с профессией. 1 ил., 2 табл., 5 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и экологии, в частности к тест-системам для определения содержания микополисахаридов и их производных, имеющих в своем составе участки, аналогичные синтетическому линейному нона-β--D-глюкозиду в окружающей среде, в том числе в пыли помещений, и может быть использовано для оценки пирогенности объектов окружающей среды при проведении экологического мониторинга жилых и производственных помещений с целью количественного определения пирогенной нагрузки пыли окружающей среды при помощи ингибиторного иммуноферментного анализа на твердой фазе. Тест-система включает в себя планшет с иммобилизованным на внутренней поверхности лунок конъюгатом синтетического линейного нона-β--D-глюкозида с бычьим сывороточным альбумином, калибраторы, содержащие растворы синтетического линейного нона-β--D-глюкозида; лиофилизованную специфическую поликлональную кроличью антисыворотку; конъюгат антивидовых антител против IgG кролика с пероксидазой из хрена; 25-кратный концентрат 0,1М фосфатно-солевого буферного раствора с 0,05 Tween-20 рН 7,2-7,4; раствор для разведения поликлональной антисыворотки; раствор для разведения конъюгата антивидовых антител против IgG кролика с пероксидазой из хрена; хромоген; стоп-реагент. Изобретение является удобным и эффективным для исследований в области экологии. 2 табл., 6 пр.

Наверх