Раствор для фиксации биологических клеток

Авторы патента:


Раствор для фиксации биологических клеток
Раствор для фиксации биологических клеток

 

G01N1/30 - Исследование или анализ материалов путем определения их химических или физических свойств (разделение материалов вообще B01D,B01J,B03,B07; аппараты, полностью охватываемые каким-либо подклассом, см. в соответствующем подклассе, например B01L; измерение или испытание с помощью ферментов или микроорганизмов C12M,C12Q; исследование грунта основания на стройплощадке E02D 1/00;мониторинговые или диагностические устройства для оборудования для обработки выхлопных газов F01N 11/00; определение изменений влажности при компенсационных измерениях других переменных величин или для коррекции показаний приборов при изменении влажности, см. G01D или соответствующий подкласс, относящийся к измеряемой величине; испытание
A01N1/02 - Консервирование тел людей или животных, или растений или их частей; биоциды, например дезинфектанты, пестициды, гербициды (препараты для медицинских,стоматологических или гигиенических целей A61K; способы или устройства для дезинфекции или стерилизации вообще, или для дезодорации воздуха A61L); репелленты или аттрактанты (приманки A01M 31/06; лекарственные препараты A61K); регуляторы роста растений (соединения вообще C01,C07,C08; удобрения C05; вещества, улучшающие или стабилизирующие состояние почвы C09K 17/00)

Владельцы патента RU 2551570:

НОВАСИ (FR)

Изобретение относится к раствору для фиксации биологических клеток. Фиксирующий раствор предназначен для сохранения in vitro цитологического образца, содержащего ядерные клетки и эритроциты. Он содержит от 80% до 95% по объему смеси: 590 мл физраствора, 10 мл полиэтилен гликоля (Carbowax®), 203 мл изопропилового спирта, 193 мл чистого этанола, 0,01% по объему азида натрия, и от 20% до 5% по объему забуференного 4% формалина, pH фиксирующего раствора находится в диапазоне от 6,4 до 7,4. Изобретение позволяет обеспечить хорошую сохранность целостности ядерных клеток. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 пр.

 

Настоящее изобретение относится к раствору для фиксации биологических клеток (фиксирующий раствор), предназначенному для сохранения in vitro цитологического образца, типа содержащего спирт раствора для фиксации клеток. Более конкретно изобретение относится к области цитологии.

Фиксирующие растворы или фиксаторы предусмотрены для сохранения и консервации цитологических проб или образцов, включая клетки, для их последующего анализа цитологом. Образцы клеток могут быть, например, получены пункцией иглой, промыванием, соскабливанием или сбором мочи у пациента. Клетки могут быть клетками любого органа, например матки, печени, желудка, молочной железы, и тому подобными. Образец клеток может быть, например, образцом жидкости, более конкретно мочи, асцита, плевральной или перикардиальной жидкости; мазком, более конкретно мазком из шейки матки, мазком из влагалища; пункцией органа, более конкретно наружного органа, такого как молочная железа, щитовидная железа или внутреннего органа, такого как поджелудочная железа или печень и тому подобных.

Под «цитологическим фиксатором» или «цитологическим фиксирующим раствором» подразумевают раствор, обычно применяемый при цитологических анализах для фиксации клеток.

Фиксация является операцией, предназначенной для максимально возможного сохранения морфологии клеток в том состоянии, в котором они находились до их отбора. Самыми лучшими фиксаторами являются те, которые, оказывая быстрое действие, вызывают минимально возможное число вторичных или искусственных изменений, способных помешать анализу внутренней морфологии клеток.

Известен и давно применяется, в частности в сельскохозяйственной и ветеринарной области, уксусный формальдегидный спирт или AFA. AFA содержит метиловый или этиловый спирт, формалин и ледяную уксусную кислоту. Формалин представляет собой смесь, состоящую из муравьиной кислоты, формальдегида, параформальдегида и метанола. Примером является AFA компании Locquin, имеющий следующий состав:

Этиловый спирт крепостью 80° 100 см3
Лабораторный формалин концентрацией 38% 10 см3
Ледяная уксусная кислота 5 см3
Сахароза 10 г
Дистиллированная вода 20 см3

Так, ледяная уксусная кислота разрушает эритроциты и растворяет их содержимое, вследствие чего образуются отложения гемоглобина, очень мешающие при анализе после стандартного окрашивания, более конкретно по Папаниколау, или окрашивания по Май-Грюнвальду-Гимзе (MGG), или очень мешающие при имуноцитохимических или других исследованиях. Более того, с позиции нормативных актов при такой концентрации этиловый спирт считается воспламеняющимся веществом, а формалин - токсичным и канцерогенным веществом.

Цель изобретения заключается в предоставлении раствора для фиксации биологических клеток, обеспечивающего хорошую сохранность целостности ядерных клеток и эритроцитов для их анализа, но менее опасного для пользователя.

В этой связи объектом изобретения является раствор для фиксации биологических клеток вышеназванного типа, содержащий физраствор для предотвращения осмотического шока на уровне клеточной стенки, формалин и полиэтиленгликоль для сохранения размера и целостности ядерных клеток и эритроцитов, фиксированных упомянутым раствором.

Согласно другим аспектам изобретения раствор для фиксации биологических клеток обладает одним или несколькими следующими свойствами:

- фиксирующий раствор не содержит ни ацетона или соединений класса кетонов, ни уксусной кислоты для сохранения целостности эритроцитов.

- спирт является этанолом или изопропанолом;

- спирт является смесью этанола и изопропанола;

- количество спирта значительно ниже 45% по объему фиксирующего раствора;

- количество формалина по существу составляет от около 0,2 до 1% по объему фиксирующего раствора.

- фиксирующий раствор содержит буфер, гарантирующий, что рН фиксирующего раствора по существу составляет от 6,4 до 7,4; и

- фиксирующий раствор содержит от 80% до 95% по объему:

- 590 мл физраствора,

- 10 мл полиэтилен гликоля (Carbowax®),

- 203 мл изопропилового спирта,

- 193 мл чистого этанола,

- 0,01% по объему азида натрия,

и от 20% до 5% по объему формалина, забуференного из расчета 4%.

Так, этот раствор обеспечивает лучшую сохранность клеточных соотношений, более конкретно размеров ядра относительно размеров клетки, и, более конкретно прекрасную сохранность эритроцитов.

Кроме того, этот фиксирующий раствор слабовоспламеним, нетоксичен и не канцерогенен.

Изобретение будет лучше понятно при ознакомлении с описанием ниже, приведенным только для примера и составленного со ссылками на рисунки, на которых:

- фигура 1 представляет собой фотографию образца клеток, полученного из молочной железы, который был сохранен в фиксирующем растворе по изобретению,

- фигура 2 представляет собой фотографию образца клеток, отобранного из щитовидной железы, который был сохранен в фиксирующем растворе по изобретению.

Настоящее изобретение относится к фиксирующему раствору, предназначенному для сохранения in vitro цитологического образца, содержащего биологические клетки, предназначенные для анализа цитологом.

Фиксирующий раствор содержит изотонический раствор хлорида натрия или физраствор вместо дистиллированной или деионизированной воды, обычно применяемой в качестве основы традиционно использующихся фиксирующих растворов.

Физраствор известен давно, он содержит хлорид натрия, растворенный в дистиллированной воде из расчета 9 граммов хлорида натрия на 1 литр воды. Физраствор является изоосмолярным, что поддерживает клетки в состоянии правильной осмолярности, предотвращающем любой осмотический шок на уровне клеточной стенки и, следовательно, разрушение клеток разрывом цитоплазматических и ядерных мембран. Осмолярность физраствора составляет 308 мОсмоль на литр.

Осмолярность представляет собой концентрацию среды. Это возвращает нас к понятию осмоса, который является диффузией растворителя через полупроницаемую мембрану, разделяющую два раствора с различной концентрацией, например, фиксирующий раствор и цитоплазматическую жидкость клеток.

Кроме того, фиксирующий раствор содержит спирт для сохранения клеток в их состоянии, фиксируя их в спиртовой среде.

Предпочтительно количество спирта значительно ниже 45% по объему фиксирующего раствора с тем, чтобы он был слабовоспламенимым. Таким образом, это небольшое содержание спирта позволяет легче транспортировать и хранить фиксирующий раствор, поскольку он менее опасен. Более конкретно под слабой воспламеняемостью подразумевают то, что раствор по изобретению не требует нанесения на упаковку раствора значка безопасности, предупреждающего о воспламеняемости продукта.

Более конкретно спирт является этанолом или изопропанолом.

По одному из вариантов осуществления изобретения спирт является смесью этанола и изопропанола.

Однако спирт является обезвоживающим уменьшающим веществом, изменяющим таким образом размер клеток за счет сокращения ядра и цитоплазмы.

Для компенсации этого недостатка фиксирующий раствор также содержит формалин для сохранения размера клеток. Факт, что фиксирующий раствор может также содержать Carbowax® или полиэтиленгликоль, известен и опубликован Саккоманно (Saccomanno) и коллегами. Известен и опубликован тот факт, что формалин может сочетаться с веществами, удаляющими соли кальция или антиагрегантами, такими как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) и ее соли. Также известен и опубликован тот факт, что к образцам, содержащим слизь, можно добавлять муколитическое вещество, в частности дитиотреитол (DTT) или ацетилцистеин.

Формалин позволяет сохранить эритроциты и ядерные клетки, не лизируя их и гарантируя соотношение по размеру, что позволяет цитологу ставить более точный диагноз.

Более конкретно, как можно видеть на фигурах 1 и 2, образцы клеток, которые хранили в фиксирующем растворе по изобретению эритроциты, отмеченные цифрой 1 на фигурах, прекрасно сохранились и не нарушены, что позволяет провести точный анализ этих образцов.

Предпочтительно количество формалина по существу составляет от около 0,2 до 1% по объему фиксирующего раствора. При такой концентрации формалин или формальдегид считается простым раздражающим средством по токсикологическому реестру, выпущенному Национальным институтом научных исследований и безопасности (INRS), в отличие от обычно применяемых концентраций от 1 до 25%, при которых формалин является коррозионным и канцерогенным. Таким образом упаковка раствора по изобретению также не требует нанесения значка безопасности, предупреждающего о том, что продукт является коррозионно-опасным.

Следовательно, при концентрации ниже 1% с раствором можно безопасно совершать манипуляции, поскольку уровень мер предосторожности для совершения манипуляций с ним ниже.

Известно, что фиксирующий раствор может содержать противомикробную добавку.

Фиксирующий раствор содержит буфер, гарантирующий уровень рН фиксирующего раствора по существу от 6,4 до 7,4. Этот диапазон рН соответствует оптимальным условиям хранения клеток и крови тела человека.

Приведенные ниже примеры иллюстрирую изобретение, не ограничивая его объем.

Пример 1

Раствор, образованный на 80% по объему из:

- 590 мл физраствора,

- 10 мл полиэтилен гликоля (Carbowax®),

- 203 мл изопропилового спирта,

- 193 мл чистого этанола,

- 0,01% по объему азида натрия,

и на 20% по объему забуференного 4% формалина.

В одном из вариантов раствор может быть образован из 90% по объему указанной выше смеси и из 10% по объему забуференного 4% формалина или из 95% по объему указанной выше смеси и из 5% по объему забуференного 4% формалина.

Следует также отметить, что фиксирующий раствор по изобретению не содержит ни ацетона или соединений класса кетонов, ни уксусной кислоты. Эти продукты лизируют эритроциты, при разрушении которых высвобождается гемоглобин, который оседает на клетках. Некоторые типы окрашивания, например окрашивание по Папаниколау, с учетом сложности красителей, объединяющих несколько ядерных красителей и гемоглобина, делают в этом случае цитологический анализ, и более конкретно исследование ядра очень трудным, если ни невозможным. Иммуноцитохимические исследования также зачастую оказываются затрудненными отложениями гемоглобина.

Использование фиксирующего раствора по изобретению улучшает последующие анализы образца с окрашиванием по Папаниколау или Иммуноцитохимические исследования образца, фиксированного в фиксирующем растворе, описанном в настоящем документе и не содержащем ни ацетона или соединений класса кетонов, ни уксусной кислоты.

Таким образом, описанный выше фиксирующий раствор обеспечивает прекрасную сохранность целостности ядерных клеток и эритроцитов для их анализа.

1. Фиксирующий раствор, предназначенный для сохранения in vitro цитологического образца, содержащего ядерные клетки и эритроциты, характеризующийся тем, что он содержит от 80% до 95% по объему:
- 590 мл физраствора,
- 10 мл полиэтилен гликоля (Carbowax®),
- 203 мл изопропилового спирта,
- 193 мл чистого этанола,
- 0,01% по объему азида натрия,
и от 20% до 5% по объему забуференного 4% формалина.

2. Фиксирующий раствор по п. 1, характеризующийся тем, что он содержит буфер, обеспечивающий pH фиксирующего раствора от 6,4 до 7,4.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к гидротехническому, мелиоративному, дорожному и другим видам строительства, где необходимо оценить качество насыпей и искусственных оснований.
Изобретение относится к ветеринарии и медицине, в частности к способу окраски мазков крови для микроскопического определения структурной организации и фаз активности клеток, и может быть использовано в цитофизиологии, цитопатологии и цитогенетике, а также рекомендовано к применению при проведении гематологических исследований при определении функционального состояния клеток крови.

Изобретение относится к сельскому хозяйству и мелиорации земель и может быть использовано при отборе горизонтального монолита-образца почвогрунтов ненарушенного (природного) сложения с целью определения их водно-физических и фильтрационных свойств при проведении почвенно-мелиоративных изысканий и исследований для строительства, осушения и использования мелиорированных земель.

Изобретение относится преимущественно к области океанологии и предназначено для забора глубинной воды морей и океанов с заданных горизонтов для последующих физических, химических, биологических исследований или для извлечения из нее отдельных минеральных или газовых компонентов в промышленных целях.

Изобретение относится к технике определения расходов и периодического отбора проб воды с различных фиксированных по глубине горизонтов торфяной залежи. Техническим результатом является упрощение конструкции.

Изобретение относится к измерительному зонду для измерения и взятия проб в металлическом расплаве. Зонд выполнен с расположенной на штанге измерительной головкой, которая содержит, по меньшей мере, датчик температуры и камеру для проб.

Изобретение относится к устройству для фильтрации и отбора проб жидкостей в сосудах под давлением и может быть использовано в обогатительно-металлургической и химической областях промышленности, в частности в качестве средств контроля химического состава раствора в автоклавах, резервуарах, трубах или других емкостях, где рабочая среда находится при высоких давлениях и температурах.

Изобретение относится к медицинским токсикологическим исследованиям, в частности к санитарной токсикологии, и может быть использовано для количественного определения пентахлорфенола в крови.
Раскрыты раствор для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания, который элюирует содержащую парафин заливочную среду с предметного стекла с образцом ткани, залитым в среду, и извлекает антигенность образца ткани, и который можно использовать три или более раз, и концентрат раствора для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания, который обеспечивает возможность легкого получения раствора для предварительной обработки.

Изобретение относится к лабораторной испытательной технике, а именно к устройству для формирования и испытания образца тонких покрытий в нагрузочных устройствах, например, для испытания тонких керамических теплозащитных покрытий на механическую прочность растяжением.
Рентгеноконтрастная цветная масса для наливки сосудов и способ ее приготовления для анатомических исследований. Цветная рентгеноконтрастная масса состоит из сульфата бария, глицерина, акриловой краски и водного раствора желатина.

Изобретение относится к медицине - консервированию гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) человека. Проводят вскрытие флакона криопротектора в ламинарном боксе, заправку криопротектора в специальный шприц шприцевого насоса, введение ограждающего раствора криопротектора - 55% диметилсульфоксида с 5% декстран 40 при температуре +4°C во взвесь ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками в криопакете с концентратом и одновременное механическое перемешивание в аппарате для перемешивания, перенос системы вместе с флаконом криопротектора в ламинарный бокс, выпуск воздуха из криопакета и части взвеси, запайку и помещение его в термоусадочный пакет и осуществление программного многоэтапного замораживания, на первом этапе которого смесь взвеси со стволовыми клетками и криопротектором - образец замораживания - выдерживают 10 мин при температуре +4°C, на втором этапе охлаждают со скоростью 1°C/мин до температуры -12°C, на третьем этапе охлаждают со скоростью 20°C/мин до температуры -60°C, на четвертом этапе нагревают образец со скоростью 10°C/мин до температуры -18°C, на пятом этапе охлаждают образец со скоростью 1°C/мин до -60°C и в конце программы замораживания образец охлаждают со скоростью 3°C/мин до температуры -100°C, после замораживания образец помещают в карантинный дьюар с жидким азотом, до определения результатов тестов на инфекционные агенты и бактериологическую грибковую контаминацию.

Изобретение относится к способу получения 1,6-бис-(1,5,3 -дитиазепан-3-ил)-2,5-дисульфанилгексана формулы (1), обладающего фунгицидной активностью против Botrytis cinerea и Rhizoctonia solani.
Изобретение относится к области консервации биологических объектов, в частности палеонтологических объектов с мягкими тканями, и может быть использован в палеонтологии и музейном деле.
Изобретение относится к физиологии, криобиологии и медицине, а именно к технологии консервирования ядерных клеток крови человека с применением инертного газа. Способ включает насыщение клеток в пластикатном контейнере «Компопласт 300», помещенном в металлический криобароконтейнер, инертным газом ксеноном под давлением 0,6 атм в течение 20 мин в условиях комнатной температуры 21±2°C с последующим удалением избытка газа и извлечением из металлического контейнера, замораживанием биообъекта до -28°C в этиловом спирте и перемещением в электроморозильник на -80°C.

Изобретение относится к области криобиологии. Способ снижения влияния низкотемпературного скачка на раствор криопротектора обеспечивается за счет дистанционной обработки раствора криопротектора с клетками живых организмов ультразвуковым излучением частотой 0,50-10 перед его замораживанием.
Изобретение относится к области медицины, в частности к области нормальной анатомии, трансплантологии, и может быть использовано с целью подготовки трупов для обучения хирургов-трансплантологов приемам забора и пересадки внутренних органов.

Изобретение относится к способу лиофилизации композиции, содержащей очищенный антитромбин III (AT III) и кристаллизующееся вещество, выбранное из аланина, маннита, глицина или NaCl.

Настоящее изобретение относится к новым соединениям общей формулы (I), где Х=S, SO или SO2, и один из радикалов R1 и R2 представляет собой атом водорода, а другой имеет значения, перечисленные в формуле изобретения, которые используют для депигментации кожи, и/или волос на голове, и/или волосяного покрова и для дезинфекции кожи, к косметическому применению предложенных соединений, а также соединений формулы (I), в которой R1 и R2 могут также одновременно представлять собой атом водорода.
Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантологии, и может быть использовано для презервирования миокарда при трансплантации. Для этого проводят перфузию и хранение изолированного сердца с использованием раствора Кустодиол при температуре 2-4°C.

Изобретение относится к области медицины, в частности гематологии. Криоконсервирование гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови проводят при добавлении ограждающего раствора криопротектора - диметилсульфоксида - во взвесь ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками. Осуществляют подготовку к замораживанию путем охлаждения взвеси со стволовыми клетками в камере охлаждения до температуры +4°C. Многоэтапное замораживание взвеси со стволовыми клетками проводят при использовании криопротектора - раствора 55% диметилсульфоксида с 5% декстран 40, который вносят во взвесь лейкоцитарного концентрата со стволовыми клетками, размещенными в криопакете. Затем механически перемешивают в аппарате для перемешивания и добавляют криоконсервант при температуре +4°C, выпускают воздух из криопакета и часть взвеси, закрывают пакет, запаивают, помещают его в термоусадочный пакет и осуществляют программное многоэтапное замораживание. На первом этапе смесь взвеси со стволовыми клетками и криопротектором (далее образец) выдерживают 10 мин при температуре +4°C, затем охлаждают со скоростью 1°C/мин до температуры -12°C, далее охлаждают со скоростью 15°C/мин до температуры -60°C, после оттаивания образца со скоростью 10°C/мин его охлаждают со скоростью 1°C/мин до -60°C и в конце программы замораживания образец охлаждают со скоростью 3°C до температуры -100°C. После окончания программы замораживания образец, помещенный в криокоробку, размещают в карантинный сосуд Дьюара с жидким азотом до определения результатов тестов на наличие или отсутствие инфекционных агентов и бактериологической и грибковой контаминации, По истечении карантинного срока хранения образец с гемопоэтическими стволовыми клетками, полученными из пуповинной крови, переносят на длительное хранение при температуре не менее -150°C в сосуд Дьюара с жидким азотом при условии отрицательных результатов тестирования. Изобретение позволяет повысить жизнеспособность клеток. 1 табл., 1 ил.
Наверх