Штамм бактерии bacillus stratosphericus, обладающий способностью продуцировать этанол из лигноцеллюлозной биомассы

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен штамм бактерий Bacillus stratosphericus ВКПМ В-11677, продуцирующий этанол из лигноцеллюлозной биомассы. Штамм проявляет активный рост на лигноцеллюлозной биомассе и обладает устойчивостью к токсичным составляющим лигноцеллюлозного гидролизата. 2 пр.

 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для промышленного производства этанола, а также в различных отраслях, например в медицине, пищевой промышленности и сельском хозяйстве для производства кормов.

К настоящему времени известны различные микроорганизмы, используемые для получения спирта. Наиболее распространенным продуцентом биоэтанола являются дрожжи - Saccharomyces cerevisiae. Эти микроорганизмы способны выдерживать высокие концентрации спирта и сахара, растут при высокой концентрации клеток, что позволяет им достигать значительной скорости наработки этанола. Однако все представители этого вида не способны к сбраживанию пентасахаров, что делает не выгодным их использование для переработки лигноцеллюлозной биомассы.

Например, известен штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae В-3855 - продуцент этилового спирта. Штамм является термотолерантным, способен эффективного сбраживать мелассную питательную среду с использованием геотермальной воды нефенольного класса с концентрацией углеводов 21.0 г/100 см3 при температурах 30-32°С (патент RU 2492229 С1, оп. 10.09.2013). Однако этот микроорганизм имеет ряд существенных недостатков: низкая скорость роста и требовательность к субстрату.

Были предприняты попытки использования других видов дрожжей, способных к сбраживанию ксилозы до этанола. Наиболее изучены в этом направлении три вида дрожжей: Pichia stipites (заявка WO 2009004273 A1, оп. 08.01.2009); Pachysolen tannophilus (заявка WO 1982003874 A1, оп. 11.11.1982) и Candida lusitaniae (заявка WO 2010072093 Al, оп. 01.07.2010). Главным недостатком этих микроорганизмов является их чувствительность к воздействию ингибирующих агентов, образующихся в результате гидролиза лигноцеллюлозной биомассы.

Известен способ получения этанола путем сбраживания пентозы гидролизатов кукурузной кочерыжки дрожжами Pachysolen Zannophilus (Besic S., Grba S. Fermentation of hydrolyzate of corn stover hemicellulose to ethanol by Pachysolen tannophlus. Kem. Ind. 1990, v. 39, N2, p. 57-67, однако данный способ характеризуется низким выходом этанола из гидролизатов древесины, так как гексоза (преобладающая в древесине) и пентоза эффективно сбраживаются разными видами дрожжей при различных условиях проведения процесса.

Другим распространенным продуцентом этилового спирта является бактерия Zymomonas mobilis. Данные бактерии способны продуцировать этиловый спирт в высоких концентрациях (заявка WO 1986004357 A1, оп. 31.07.1986). Недостатком является их не способность к сбраживанию пентасахаров.

Известно, что бактерии рода Clostridium при сбраживании различных углеводов синтезируют этанол. Так, штамм Clostridium acetobutylicum ВКМ B-2512D является продуцентом н-бутилового спирта, ацетона и этанола (патент RU 2393213 С1, оп. 27.06.2010).

Также известен штамм Clostridium thermocellum (заявка WO 2012109578 А2, оп. 16.08.2012), способный продуцировать этиловый спирт. Данный штамм несет мутантный генотип с делецией в гене фермента формиат пируват лиазы, что приводит к прекращению наработки формиата, соответственно к снижению выхода побочных продуктов.

Актуальной задачей на сегодняшний день является поиск новых штаммов бактерий, способных эффективно усваивать пентасахара, которые могут составлять до 40% от всех сахаров, содержащихся в растительной биомассе быстрорастущих травянистых растений. Такие растения являются наиболее перспективными источниками биомассы, которая может быть использована в качестве возобновляемого источника энергии и вещества целлюлозосодержащего сырья.

Наиболее близким к заявляемому штамму - прототипом является штамм бактерий Clostridium acetobutylicum, являющийся продуцентом бутанола, ацетона и этанола из целлюлозосодержащего сырья (патент RU 2381270 С1, оп. 10.02.2010). Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов, ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под номером B-2531D. Для культивирования штамма применяют питательные среды, содержащие автолизат кормовых дрожжей, биотин и парааминобензойную кислоту. Ферментацию ведут при термостатировании при 36-37°С в течение 40 часов. Выход этанола составляет 0,01-1,35%.

Недостатками известного штамма являются его анаэробность, что требует дополнительного оборудования и усложняет условия культивирования, а также потребность штамма в факторах роста (необходимость добавления в питательные среды пищевого сырья, например муки или отрубей, а также минеральных добавок).

Задачей изобретения является получение бактериального штамма, являющегося продуцентом этанола, способного к конверсии целлюлозосодержащего сырья в биоэтанол и устойчивого к токсичным составляющим лигноцеллюлозого гидролизата.

Поставленная задача достигается получением штамма Bacillus stratosphericus, обладающего способностью продуцировать этанол из лигноцеллюлозной биомассы.

Технический результат: упрощение условий культивирования штамма и расширение ассортимента штаммов-продуцентов для переработки лигноцеллюлозной биомассы в биоэтанол.

Предлагаемый штамм выделен из природного материала донного осадка озера Соленое, Новосибирская область (Баганский район) в результате целенаправленного поиска.

Полученный штамм Bacillus stratosphericus депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ГосНИИгенетика) под регистрационным номером ВКПМ В-11677.

Штамм Bacillus stratosphericus ВКПМ В-11677 характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки: грамположительные палочки, растут на средах LB-бульон, LB-агар, среда Гетчинсона с лигноцеллюлозной биомассой. При росте на агаризованной среде LB образует колонии неправильной формы белого цвета. Профиль колоний слегка выпуклый, размеры варьируют от 3 до 5 мм. Рост в жидких средах (LB-бульон) характеризуется ровным помутнением, осадок легко седиментирует.

Физиолого-биохимические признаки: аэроб, мезофил. Оптимальная температура роста 30-37°С. Хорошо растет в пределах рН среды от 6,5 до 7,5. Штамм характеризуется способностью использовать в качестве субстратов пептон, дрожжевой экстракт. Не утилизирует цитрат, маннитол, малонат, инозитол, адонитол, сорбитол, дульцит, пируват, сахара (глюкозу, целлобиозу, сахарозу, трегалозу, рамнозу, мелибиозу, раффинозу) и аминокислоты (лизин, орнитин, аргинин, триптофан, фенилаланин). Не способен к гидролизу мочевины.

Штамм не обладает инфекционным и общетоксическим действием.

Штамм является непатогенным и не включен в списки, приведенные в санитарных правилах СП 1.3.2322-08; штамм не несет опасных генетических конструкций.

Штамм идентифицирован на основе секвенирования фрагмента гена 16S рибосомальной РНК.

Хранение штамма осуществляют на среде Гетчинсона с глицерином при температуре -70°С.

Для культивирования штамма применяют среды следующего состава: Среда LB (г/л): хлорид натрия - 5.0; триптон - 10.0; дрожжевой экстракт - 5.0.

Среда Гетчинсона (г/л): NaNO3 - 2.5, K2HPO4 - 1, (NH4)2SO4 - 0.15, MgCl2 - 0.15, NaCl - 0.1, CaCl2 - 0.1, лигноцеллюлозная биомасса - 15, FeCl3*6H2O - 50 мкг.

Предлагаемый штамм бактерий Bacillus stratosphericus, обладающий способностью перерабатывать лигноцеллюлозную биомассу в биоэтанол, имеет ряд преимуществ, заключающихся в следующем.

1. Бактерии рода Bacillus имеют часть ферментов целлюлозолитического комплекса и, следовательно, продуцент этанола на основе штаммов Bacillus может стать хорошей основой для последующих работ, направленных на создание штамма, способного к прямой конверсии лигноцеллюлозной биомассы в биоэтанол.

2. На основе бактерий рода Bacillus возможно создание эффективных комплексов микроорганизмов, деградирующих лигноцеллюлозную биомассу и продуцирующих этанол.

3. Бактерии рода Bacillus обладают достаточно высокой скоростью роста и скоростью катаболических процессов, следовательно, скорость переработки лигноцеллюлозной биомассы в биоэтанол будет выше у других организмов.

4. Штамм бактерий Bacillus stratosphericus обладает устойчивостью к содержанию в среде ацетата и этанола, что делает его перспективным для использования в условиях производства.

5. Штамм является аэробом и мезофиллом, в связи с чем упрощаются условия его культивирования, поскольку не требуется дополнительный нагрев и поддержание высокой температуры среды культивирования.

6. Штамм проявляет более активный рост на лигноцеллюлозной биомассе, чем на богатых питательных средах (мясо-пептонный агар, Лурия-Бертани бульон), что будет способствовать удешевлению технологии переработки растительной биомассы.

7. Штамм устойчив к токсичным составляющим лигноцеллюлозого гидролизата, что позволит упростить технологию переработки растительной биомассы.

Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и он характеризуется уникальной способностью перерабатывать лигноцеллюлозную биомассу в биоэтанол, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень».

Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Выращивание штамма Bacillus stratosphericus и определение содержания этанола в культуральной жидкости.

Для получения биомассы и определения содержания биоэтанола в культуральной жидкости культуру штамма-продуцента рассевали штрихом на чашках с агаризованной средой Гетчинсона с лигноцеллюлозной биомассой таким образом, чтобы были получены отдельные колонии. Засеянные чашки культивировали в суховоздушном термостате в течение 24-48 часов при температуре 37°С. Затем 20 мл среды Гетчинсона с фильтратом лигноцеллюлозной биомассы инокулировали одной колонией нарабатываемого штамма. Культивировали при 37°С в течение 12 часов на орбитальном шейкере при скорости перемешивания 200 оборотов в минуту. После этого к 200 мл среды Гетчинсона с фильтратом лигноцеллюлозной биомассы в литровой конической колбе добавляли 4 мл наработанной культуры. Культивирование проводили при 37°С на орбитальном шейкере при скорости перемешивания 250 оборотов в минуту до достижения оптической плотности OD600~0.90-0.95. В полученной таким образом культуральной жидкости определяли содержание этанола.

Содержание этанола в культуральной жидкости определяли методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектором на хроматографе Agilent Technologies 6890N с квадрупольным масс-спектрометром Agilent Technologies 5973N и кварцевой колонной DB-1. Газ-носитель - гелий с постоянным потоком 1 мл/мин. Режим программирования температуры колонки: начальная температура термостата колонки 50°С, выдержка при начальной температуре 5 мин, далее нагрев до температуры 250°С со скоростью 25°С/мин, выдержка при конечной температуре 7 мин. Ввод пробы осуществляли с помощью микрошприца, объем вводимой пробы 1 мкл, температура инжектора 250°С. Ионизация электронным ударом (70 эВ). Через 15 часов культивирования отбирали 350 мкл культуральной жидкости в пробирку (1,7 мл) и добавляли 1050 мкл 0,5 M ТОА (триоктиламин) в ТБФ (трибутилфосфат). Экстракцию проводили при помощи перемешивания на шейкере (15 минут). Затем отбирали 1 мл органического растворителя с экстрактом в стеклянный бокс для хроматографа. Концентрацию этилового спирта определяли сравнением площадей пиков экспериментальных образцов с калибровочными растворами. Выход этанола составил 0,3%.

Пример 2. Наработка биоэтанола штаммом Bacillus stratosphericus.

Для определения количества биоэтанола, нарабатываемого штаммом Bacillus stratosphericus, было проведено культивирование штамма в вихревом биореакторе "Vortex-5" с программируемым блоком управления («Центр вихревых технологий», Россия) следующим образом.

Предварительно исследуемую культуру выращивали на питательной среде Гетчинсона с фильтратом лигноцеллюлозной биомассы при температуре 37°С в 1/10 объема от предполагаемого объема культуральной жидкости в биореакторе. Через 12 часов переносили инокулят в биореактор, заполненный 3-мя литрами среды Гетчинсона с фильтратом лигноцеллюлозной биомассы. В ходе культивирования поддерживали температуру 37°С и рН 7.0. Начальный этап культивирования проводили в аэробных условиях. Перемешивание осуществляли вихревым образом при помощи воздушной мешалки (2600 об/мин). В полученной культуральной жидкости определяли содержание этанола аналогично примеру 1. Выход этанола составил 0,4%.

Использование предлагаемого штамма позволит упростить процесс культивирования последнего и расширить ассортимент штаммов, обладающих способностью переработки лигноцеллюлозной биомассы в этанол.

Штамм бактерии Bacillus stratosphericus, депонированный под регистрационным номером ВКПМ В-11677, обладающий способностью продуцировать этанол из лигноцеллюлозной биомассы.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к композиции, включающей штаммы Lactobacillus plantarum, и применению штаммов и композиции. Композиция со снижающей холестерин активностью эффективное количество по меньшей мере, одного из штаммов, выбранных из группы штамм Lactobacillus plantarum CECT 7527, штамм Lactobacillus plantarum CECT 7528 и штамм Lactobacillus plantarum CECT 7529.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено применение соли угольной кислоты в качестве стабилизатора цвета в бактериальной композиции, содержащей бактериальные клетки, относящиеся к роду Bifidobacterium, и аскорбат.

Изобретение относится к области микробиологии. Штамм бактерий Kocuria sp., обладающий способностью быстро утилизировать нефть и нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат), депонирован в ВКМ под регистрационным номером Kocuria sp.

Изобретение относится к области микробиологии. Штамм бактерий Serratia plymuthica ELA-9, обладающий способностью быстро утилизировать нефть и нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат), депонирован в ВКМ под регистрационным номером Serratia plymuthica VKM B-2819D и может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в широком диапазоне температур от +4 до +30°C.
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения ксантана.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве препаратов для борьбы с колорадским жуком. Штамм Bacillus thuringiensis 16T100/18 (ВИЗР) обладает высокой инсектицидной активностью в отношении личинок и имаго колорадского жука.

Изобретение относится к санитарной микробиологии и может быть использовано при лабораторных исследованиях. Способ предпосевной обработки патологического материала для выделения нокардиоформных актиномицетов предусматривает измельчение патологического материала с последующим смешиванием с дезинфекционным средством "Септустин" в концентрации 0,1% в объемном соотношении 1:2 в течение 180 минут при комнатной температуре с последующей двукратной в течение 15 минут отмывкой стерильным физиологическим раствором.

Изобретение относится к области микробиологии. Штамм бактерий Rhodococcus sp.

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и биотехнологии. Штамм микромицета Trichoderma hamatum обладает антибактериальной активностью в отношении возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве питательных сред для суспензионного культивирования клеток, в частности суспензионного культивирования клеток почки сирийского хомячка.
Изобретение относится к гидролизной промышленности, в частности к способам очистки гидролизатов лигноцеллюлозного сырья от ингибиторов ацетонобутилового брожения, и может быть использовано при подготовке питательных сред для получения биоэтанола, биобутанола, ацетона.

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлен трансформированный микроорганизм - дрожжи Saccharomyces для получения этанола, где упомянутый микроорганизм трансформирован нуклеотидной последовательностью, кодирующей ксилозоизомеразу, и указанный микроорганизм трансформирован нуклеотидной последовательностью, кодирующей ксилулокиназу, или указанный микроорганизм трансформирован промотором, способным повышать экспрессию эндогенной ксилулокиназы.

Изобретение относится к спиртовой промышленности, в частности к способу подогрева бражки теплом барды. Способ включает подачу бражки в трубное пространство одного кожухотрубного теплообменника, при этом барда направляется в трубные пучки другого теплообменника, а межтрубное пространство заполняется жидким теплоносителем (лютером, технологической водой, ректификованным спиртом), который постоянно перекачивается насосом из межтрубного пространства одного теплообменника в межтрубное пространство другого, обеспечивая непрерывную циркуляцию теплоносителя между двумя теплообменниками и теплообмен в системе барда-теплоноситель-бражка.

Способ предусматривает получение этанола путём вываривания этилового спирта из бражки в бражной колонне, очистки бражного дистиллята от головных и промежуточных примесей в эпюрационной колонне, работающей по методу глубокой гидроселекции, ректификации эпюрата в спиртовой колонне, выделения примесей в колонне окончательной очистки, работающей в режиме повторной эпюрации, очистки фракций, содержащих головные примеси и метанол, в колонне концентрирования головных примесей.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен способ деградации предварительно обработанной лигноцеллюлозной биомассы, а также способ деградации лигноцеллюлозной биомассы.
Изобретение относится к способам сохранения углеводного сырья от микроорганизмов. Осуществляют контакт углеводного сырья при единичной операции.

Изобретение относится к способу получения этилового спирта и белкового продукта из зернового сырья. Способ предусматривает измельчение зернового сырья, его экструдирование и ферментативный гидролиз в одной экструзионно-гидролитической установке с подачей воды и ферментных препаратов, осахаривание и спиртовое брожение.

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются вектора, клетки-хозяина, содержащего вектор, генетически модифицированного микроорганизма Clostridium thermocellum, способа получения такого микроорганизма и способа преобразования лигноцеллюлозной биомассы в этанол.

Способ предусматривает перегонку бражки в брагоэпюрационной колонне с конденсацией части эпюрированного водно-спиртового пара в дополнительном бражном подогревателе, подачу в куб колонны предварительной очистки водно-спиртового пара из основного бражного подогревателя и направление в среднюю зону этой колонны конденсата из конденсатора сепаратора диоксида углерода, концентрирование головных примесей на тарелках этой колонны и в ее дефлегматоре и отбор фракции головных примесей из конденсатора колонны предварительной очистки.
Группа изобретений относится к контролю микробной контаминации в процессе спиртовой ферментации. Предложена противомикробная композиция, включающая от 1% до 5% по массе противомикробного агента семейства гуанидиновых, представляющего собой поли(гексаметилбигуанид); от 0,05% до 0,5% по массе антибиотика; и от примерно 94,5% до примерно 98,95% по массе поверхностно-активного вещества.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается применения штамма Rickettsia sibirca subsp. sibirica.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен штамм бактерий Bacillus stratosphericus ВКПМ В-11677, продуцирующий этанол из лигноцеллюлозной биомассы. Штамм проявляет активный рост на лигноцеллюлозной биомассе и обладает устойчивостью к токсичным составляющим лигноцеллюлозного гидролизата. 2 пр.

Наверх