Стабильные композиции с высокими концентрациями белков антител человека против tnf-альфа

Группа изобретений относится к медицине и касается жидкой фармацевтической композиции для лечения нарушения, при котором активность TNF-альфа является вредной, причем указанная композиция имеет pH от около 5,0 до 6,4 и включает приблизительно 35-55 мг/мл полиола и приблизительно 40-200 мг/мл антитела человека против TNF-альфа, где композиция не содержит наполнитель NaCl. Группа изобретений также касается способа лечения нарушения, связанного с вредной активностью TNF-альфа, у субъекта, включающего введение субъекту указанной композиции. Группа изобретений обеспечивает препараты с высокой концентрацией антитела, обладающие длительной стабильностью и полезными для подкожного введения характеристиками. 7 н. и 42 з.п. ф-лы, 11 пр., 26 ил., 27 табл.

 

Родственные заявки

Эта заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США с № 61/175380, поданной 4 мая 2009, полное содержание которой включено сюда посредством этой ссылки.

Предпосылки создания изобретения

Учитывая многочисленные желаемые свойства, которыми должна обладать композиция, чтобы быть экономически и терапевтически эффективной, например, стабильность, пригодность для введения, концентрацию, составление рецептур терапевтических белков, таких как антитела, часто является сложной задачей. Было известно, что во время производства, хранения и доставки терапевтические белки подвергаются физическим и химическим деградациям. Эти нестабильности могут снизить активность белка и увеличить риск неблагоприятных эффектов у пациентов и, следовательно, оказывать значительное влияние на разрешение регуляторного органа (см., например, Wang, et al. (2007) J. Pharm. Sci. 96: 1). Как таковая, стабильная белковая композиция необходима для эффективности терапевтического белка.

Необходимо введение высоких доз многих терапевтических белков, чтобы они были эффективными, которые предпочтительно составляют в композиции с высокими концентрациями. Композиции с высокими концентрациями белков являются желательными, поскольку они могут оказывать влияние на способ (например, внутривенный в противоположность подкожному) и частоту введения лекарственного средства субъекту.

Несмотря на преимущества композиций с высокими концентрациями белков, составление рецептур терапевтических белков в высоких концентрациях представляет многочисленные проблемы. Например, увеличение концентрации белка часто оказывает отрицательное влияние на агрегацию белка, его растворимость, стабильность и вязкость (см., например, Shire, et al. (2004) J. Pharm. Sci. 93: 1390). Повышенная вязкость, которая является очень часто встречающейся проблемой в случае растворов с высокими концентрациями белков, может иметь отрицательные последствия на введение композиции, например, синдромы ощущаемой боли и жжения и ограничения в производстве, обработке, на последнем этапе - наполнении и в вариантах устройств для доставки лекарственных средств (см., например, Shire, et al. (2004) J. Pharm. Sci. 93: 1390). Даже в случае терапевтических белков, обладающих общими структурными признаками, например, антител, разрешенные композиции до настоящего времени имели изменяющиеся ингредиенты и диапазоны концентраций. Например, антитело против CD20 - Ритуксан составлено для внутривенного введения в концентрации, составляющей 10 мг/мл, тогда как антитело против RSV - Синагис составлено для внутримышечного введения в концентрации, составляющей 100 мг/мл. Таким образом, композиции с высокими концентрациями белков, особенно композиции антител, которые можно использовать с терапевтической целью, остаются проблемой. Соответственно, существует потребность в стабильных композициях с высокими концентрациями белков, которые обеспечивают преимущества дозирования и введения.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение основывается, по крайней мере отчасти, на открытии новых композиций с высокими концентрациями антител человека против TNF-α, или их антигенсвязывающих фрагментов, например, адалимумаба. Композиции настоящего изобретения обеспечивают ряд неожиданных характеристик, учитывая высокую концентрацию антитела. Например, композиции настоящего изобретения сохраняют физическую и химическую стабильность в течение удлиненных периодов времени, несмотря на высокую концентрацию белка, и имеют коэффициент вязкости, подходящий для подкожного введения. Композиции настоящего изобретения основываются, по крайней мере отчасти, на неожиданном обнаружении того, что антитело человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающая часть, может оставаться растворимым при высокой концентрации (например, 100 мг/мл) и оставаться не агрегированным при сохранении коэффициента вязкости, подходящего для инъекции (например, подкожного введения). Композиция настоящего изобретения является также неожиданной в том отношении, что при высокой концентрации (например, 100 мг/мл) антитело человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающая часть, может оставаться растворимым и оставаться не агрегированным и химически стабильным (например, без окисления или дезамидирования) в пределах широкого диапазона pH, например, от приблизительно pH 5,2 до приблизительно pH 6,0. Эти полезные характеристики достигаются без необходимости использования NaCl в качестве стабилизатора и с помощью увеличения содержания наполнителя в виде сахароспирта.

В одном аспекте настоящего изобретения обеспечивается жидкая фармацевтическая композиция, включающая более чем 40 мг полиола и по крайней мере приблизительно 100 мг/мл антитела человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающей части.

В другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается жидкая фармацевтическая композиция, включающая более чем 20 мг полиола и по крайней мере приблизительно 100 мг/мл антитела человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающей части. В одном варианте осуществления композиции по настоящему изобретению не содержат NaCl.

Особенностью настоящего изобретения также является жидкая фармацевтическая композиция, имеющая pH от приблизительно 5,0 до 6,4 и включающая по крайней мере приблизительно 100 мг/мл антитела человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающей части, причем композиция не содержит NaCl и имеет мутность, составляющую менее 60 NTU (нефелометрических единиц мутности) согласно стандартному исследованию напряжения от перемешивания в течение 24 часов или после 24 месяцев длительного хранения в виде жидкости.

Настоящим изобретением, кроме того, обеспечивается жидкая фармацевтическая композиция, имеющая pH от приблизительно 5,0 до 6,4 и включающая по крайней мере приблизительно 100 мг/мл антитела человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающей части, причем композиция не содержит NaCl и имеет мутность, составляющую менее 100 NTU согласно стандартному исследованию напряжения от перемешивания в течение 48 часов.

Другой аспект настоящего изобретения включает жидкую фармацевтическую композицию, имеющую pH от приблизительно 5,0 до 6,4 и включающую по крайней мере приблизительно 100 мг/мл антитела человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающей части, причем композиция не содержит NaCl и имеет мутность, составляющую менее 40 NTU после хранения в течение 3 месяцев при 5°C, 25°C или 40°C.

Настоящим изобретением также обеспечивается жидкая фармацевтическая композиция, включающая по крайней мере приблизительно 100 мг/мл антитела человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающей части; более чем приблизительно 20 мг/мл полиола; 0,1-2,0 мг/мл поверхностно-активного вещества; приблизительно 1,15-1,45 мг/мл лимонной кислоты * H₂O; приблизительно 0,2-0,4 мг/мл дигидрата цитрата натрия; приблизительно 1,35-1,75 мг/мл Na₂HPO₄ * 2 H₂O; приблизительно 0,75-0,95 мг/мл NaH₂PO₄ * 2 H₂O, причем композиция имеет pH от приблизительно 4,7 до 6,5 и не включает NaCl.

Композиция настоящего изобретения подходит для подкожного введения. Как таковое, настоящее изобретение также включает применение композиции настоящего изобретения, включающей антитело человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающую часть, для лечения нарушения, связанного с вредной активностью TNF-альфа, у субъекта.

В одном варианте осуществления композиция настоящего изобретения имеет концентрацию антитела человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающей части, и вязкость, составляющую приблизительно 3,1-3,3 миллипаскаль*секунда.

В одном варианте осуществления композиция настоящего изобретения включает более чем 20 мг полиола. Дополнительные количества полиола, которые могут быть включены в композицию настоящего изобретения, составляют более чем 30 мг полиола. Альтернативно, в композиции настоящего изобретения может использоваться более чем 40 мг полиола, в том числе, но без ограничения, 40-45 мг или приблизительно 42 мг.

В одном варианте осуществления используемым в композиции настоящего изобретения полиолом является сахароспирт, такой как, но без ограничения, маннит или сорбит. В одном варианте осуществления композиция включает приблизительно 40-45 мг/мл либо маннита, либо сорбита.

Различные поверхностно-активные вещества, известные в данной области техники, могут использоваться в композиции настоящего изобретения. В одном варианте осуществления поверхностно-активным веществом является полисорбат 80. В дальнейшем варианте осуществляется в композиции настоящего изобретения используется приблизительно 0,1-2,0 мг/мл полисорбата 80.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция включает приблизительно 1,30-1,31 мг/мл лимонной кислоты * H₂O.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения композиция включает приблизительно 0,30-0,31 мг/мл дигидрата цитрата натрия.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция включает приблизительно 1,50-1,56 мг/мл Na₂HPO₄ * 2 H₂O.

В дальнейшем варианте осуществления настоящего изобретения композиция включает приблизительно 0,83-0,89 мг/мл NaH₂PO₄ * 2 H₂O.

В другом варианте осуществления pH композиции настоящего изобретения колеблется от приблизительно 4,8 до приблизительно 6,4. Например, pH композиции настоящего изобретения либо может колебаться от приблизительно 5,0 до приблизительно 5,4 (например, составлять приблизительно 5,2), либо может колебаться от приблизительно 5,8 до приблизительно 6,4 (например, составлять приблизительно 6,0).

Преимущество композиции настоящего изобретения заключается в том, что она обеспечивают высокую концентрацию антитела без увеличения агрегации белка, которая обычно возникает при увеличении концентрации белка. В одном варианте осуществления композиция настоящего изобретения содержит менее чем приблизительно 1% агрегированного белка.

В качестве части настоящего изобретения также предусматриваются описываемые здесь композиции, имеющие концентрацию, составляющую по крайней мере приблизительно 50 мг/мл антитела человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающей части.

В одном варианте осуществления антитело человека, или его антигенсвязывающая часть, включает легкую цепь, включающую CDR3-участок, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:3, и тяжелую цепь, включающую CDR3-участок, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:4.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело имеет CDR3-участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3 или последовательность, являющуюся результатом модификации SEQ ID NO:3 посредством одной замены на аланин в положении 1, 4, 5, 7 или 8 или посредством одной-пяти консервативных аминокислотных замен в положениях 1, 3, 4, 6, 7, 8 и/или 9, и имеет CDR3-участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4 или последовательность, являющуюся результатом модификации SEQ ID NO:4 посредством одной замены на аланин в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11 или посредством одной - пяти консервативных аминокислотных замен в положениях 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 и/или 12.

Антитело настоящего изобретения может иметь определенные функциональные свойства. Например, антитело человека, или его антигенсвязывающая часть, может подвергаться диссоциации от TNFα человека с Kd, составляющей 1×10^-8 M или меньше, подвергаться диссоциации от TNFα человека с константой скорости диссоциации K_off, составляющей 1×10^-3 сек^-1 или меньше, обе из которых являются определенными с помощью поверхностного плазмонного резонанса, и/или нейтрализовать индуцированную TNFα человека цитотоксичность в стандартном in vitro анализе с использованием клеток L929 с IC₅₀, составляющей 1×10^-7 M или меньше.

В одном варианте осуществления антителом человека, или его антигенсвязывающей частью, является IgG1 каппа антитело человека.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения легкая цепь антитела человека, или его антигенсвязывающей части, включает, кроме того, CDR2-участок, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:5, и CDR1-участок, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:7, и/или тяжелая цепь антитела человека включает CDR2-участок, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:6, и CDR1-участок, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:8. В другом варианте осуществления легкая цепь антитела человека, или его антигенсвязывающей части, включает аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:1, а тяжелая цепь антитела человека включает аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:2. В настоящее изобретение также включены антитела человека, или их антигенсвязывающие части, имеющие аминокислотные последовательности, которые идентичны представленным здесь SEQ ID NO на по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения антителом человека, или его антигенсвязывающей частью, является адалимумаб.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 представляет собой график, на котором отображено присутствие высокомолекулярного (hmw) белкового типа в растворе, содержащем 0,1% Solutol. Согласно MALS (рассеиванию света под множеством углов) (серая линия) молярные массы агрегатов равны приблизительно 10⁹ г/моль, составляя 2,6% общего белка (УФ280, черная линия). Хранение при 40°C в течение 12 недель.

Фиг.2А и 2В представляют собой графики, на которых отображено детектирование на ранней стадии высокомолекулярных (hmw) агрегатов, возникающих во время хранения при 40°C. Тогда как агрегаты невозможно было детектировать через посредство УФ280 (черная кривая), MALS (серая кривая) однозначно свидетельствовало о присутствии hmw типа. Хранение в течение одной недели (A) в сравнение с исходным образцом (B).

Фиг.3 представляет собой график, на котором отображена мутность в зависимости от числа циклов замораживания/оттаивания композиций F1-F6.

Фиг.4 представляет собой график, на котором отображен коэффициент полидисперсности в зависимости от числа циклов замораживания/оттаивания композиций F1-F6.

Фиг.5 представляет собой график, на котором отображены определенные с помощью SEC (гель-фильтрации) уровни агрегатов в зависимости от числа циклов замораживания/оттаивания композиций F1-F6.

Фиг.6 представляет собой график, на котором отображена определенная с помощью DSC (дифференциальной сканирующей калориметрии) Tm в °C композиций F1-F6 в TO.

Фиг.7 представляет собой график, на котором отображены определенные с помощью SEC уровни агрегатов в зависимости от времени перемешивания композиций F1-F6.

Фиг.8 представляет собой график, на котором отображено сравнение значений коэффициентов мутности, полученных в исследованиях стабильности после хранения в течение 3 месяцев F2, F6 и F7 (3 репрезентативных партий 01032-0134).

Фиг.9 представляет собой график, на котором отображено сравнение значений числа частиц видимого диапазона в соответствии с оценкой DAC, полученных в исследованиях стабильности после хранения в течение 3 месяцев F2, F6 и F7 (3 репрезентативных партий 01032-0134).

Фиг.10 представляет собой график, на котором отображено сравнение значений числа частиц довидимого диапазона (≥10 мкм), полученных в исследованиях стабильности после хранения в течение 3 месяцев F2, F6 и F7 (3 репрезентативных партий 01032-0134).

Фиг.11 представляет собой график, на котором отображено сравнение значений числа частиц довидимого диапазона (≥25 мкм), полученных в исследованиях стабильности после хранения в течение 3 месяцев F2, F6 и F7 (3 репрезентативных партий 01032-0134).

Фиг.12 представляет собой график, на котором отображено сравнение остаточных количеств мономеров, полученных в исследованиях стабильности после хранения в течение 3 месяцев F2, F6 и F7 (3 репрезентативных партий 01032-0134).

Фиг.13 представляет собой график, на котором отображено сравнение сумм вариантов лизина, полученных в исследованиях стабильности после хранения в течение 3 месяцев F2, F6 и F7 (3 репрезентативных партий 01032-0134).

Фиг.14 представляет собой график, на котором отображено основанное на данных по мутности сравнение F2, F6 и F7 по показателю стойкости к напряжению от перемешивания при различных скоростях перемешивания в течение 24 часов.

Фиг.15 представляет собой график, на котором отображено основанное на данных DLS (динамического рассеивания света) (значениях Z-средних размеров) сравнение F2, F6 и F7 по показателю стойкости к напряжению от перемешивания при различных скоростях перемешивания в течение 24 часов.

Фиг.16 представляет собой график, на котором отображено основанное на данных по мутности сравнение F2, F6 и F7 по показателю стабильности до и после нескольких циклов насосной эксплуатации.

Фиг.17 представляет собой график, на котором отображено основанное на данных DLS (Z-средних размерах) сравнение F2, F6 и F7 по показателю стабильности до и после нескольких циклов насосной эксплуатации.

Фиг.18 представляет собой график, на котором отображено основанное на полученных с помощью SEC данных (уровнях агрегатов) сравнение F2, F6 и F7 по показателю стабильности до и после нескольких циклов насосной эксплуатации.

Фиг.19 представляет собой график, на котором отображена визуальная оценка композиций с концентрацией 100 мг/мл после наполнения с использованием перистальтического насоса.

Фиг.20 представляет собой график, на котором отображена визуальная оценка композиций с концентрацией 100 мг/мл после наполнения с использованием поршневого насоса.

Фиг.21 представляет собой график, на котором отображена мутность композиций с концентрацией 100 мг/мл после наполнения с использованием перистальтического насоса.

Фиг.22 представляет собой график, на котором отображена мутность композиций с концентрацией 100 мг/мл после наполнения с использованием поршневого насоса.

Фиг.23 представляет собой график, на котором отображена мутность в TO и после хранения в течение 4 недель при 5°C композиций F8-F11.

Фиг.24 представляет собой график, на котором отображена доля мономеров в TO и после хранения в течение 4 недель при 5°C композиций F8-F11.

Фиг.25 представляет собой график, на котором отображены уровни агрегатов в TO и после хранения в течение 4 недель при 5°C композиций F8-F11.

Фиг.26 представляет собой график, на котором отображено количество частиц довидимого диапазона в TO и после хранения в течение 4 недель при 5°C композиций F8-F11.

Подробное описание изобретения

I. Определения

С тем чтобы настоящее изобретение можно было легче понять, сначала определены некоторые термины. Кроме того, следует обратить внимание, что повсюду, где приводится значение или диапазон значений параметра, предполагается, что частью этого изобретения также являются значения и диапазоны, промежуточные по отношению к приведенным значениям.

Термин «фармацевтическая композиция» относится к композициям, которые находятся в такой форме, что создается возможность для того, чтобы биологическая активность активных ингредиентов была неуклонно эффективной, и которые не содержат дополнительные компоненты, которые являются в значительной степени токсичными для субъектов, которым композиция будет вводиться.

Выражение «фармацевтически приемлемый носитель» принято в данной области техники и включает фармацевтически приемлемый материал, композицию или носитель, подходящий для введения млекопитающим. Носители включают жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, формообразующее средство, растворитель или герметизирующий материал, задействованный в перенос или транспортировку рассматриваемого агента из одного органа, или части тела, в другой орган, или часть тела. Каждый носитель должен быть «приемлемым» в том смысле, что он должен быть совместимым с другими ингредиентами композиции и не вредным или не затрагивающим безопасность пациента.

«Фармацевтически приемлемыми наполнителями» (носителями, добавками) являются наполнители, которые можно мотивировано вводить рассматриваемому млекопитающему для обеспечения эффективной дозы используемого активного ингредиента.

Термин «наполнитель» относится к агенту, который может быть добавлен к композиции для обеспечения желаемой консистентности, например, изменения объемных характеристик, для увеличения стабильности и/или для регулирования осмотической концентрации раствора. Примеры широко используемых наполнителей включают, но без ограничения, сахара, полиолы, аминокислоты, поверхностно-активные вещества и полимеры.

Широко используемым наполнителем является полиол. Как здесь используется, «полиол» представляет собой вещество с множеством гидроксильных групп и включает сахара (восстанавливающие и невосстанавливающие сахара), сахароспирты и сахарокислоты. Предпочтительные здесь полиолы имеют молекулярную массу, которая составляет менее чем приблизительно 600 кДа (например, находится в диапазоне от приблизительно 120 до приблизительно 400 кДа). Не ограничивающими примерами полиолов являются фруктоза, манноза, мальтоза, лактоза, арабиноза, ксилоза, рибоза, рамноза, галактоза, глюкоза, сахароза, трегалоза, сорбоза, мелезитоза, раффиноза, маннит, ксилит, эритрит, треит, сорбит, глицерин, соль L-глюконовой кислоты и их соли металлов.

Как здесь используется, «буфер» относится к забуференному раствору, который является устойчивым к изменениям pH благодаря действию кислотно-основных соединенных компонентов. Буферы этого изобретения имеют pH в диапазоне от приблизительно 4 до приблизительно 8; предпочтительно от приблизительно 4,5 до приблизительно 7 и наиболее предпочтительно имеют pH в диапазоне от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,5. Примеры буферов, которые будут контролировать pH в этом диапазоне, включают фосфатный, ацетатный (например, натрийацетатный), сукцинатный (например, натрийсукцинатный), глюконатный, глютаматный, гистидиновый, цитратный и включающие другие органические кислоты буферы. В одном варианте осуществления буфером, подходящим для применения в композициях настоящего изобретения, является цитратный и фосфатный буфер.

Термин «поверхностно-активное вещество» обычно включает те агенты, которые защищают белок в композиции от напряжений, вызываемых на границах раздела воздух/раствор и раствор/поверхность. Например, поверхностно-активное вещество может защищать белок от агрегации. Подходящие поверхностно-активные вещества могут включать, например, полисорбаты, полиоксиэтилен-алкиловые эфиры, такие как Brij 35.RTM., или полоксамер, такой как Tween 20, Tween 80 или полоксамер 188. Предпочтительными детергентами являются полоксамеры, например, Полоксамер 188, Полоксамер 407; полиоксиэтилен-алкиловые эфиры, например, Brij 35.RTM., Cremophor A25, Sympatens ALM/230; и полисорбаты/Tween, например, Полисорбат 20, Полисорбат 80, Mirj, и полоксамеры, например, Полоксамер 188 и Tween, например, Tween 20 и Tween 80.

«Стабильной» композицией является композиция, в которой антитело по существу сохраняет свою физическую стабильность и/или химическую стабильность и/или биологическую активность во время процесса производства и/или при хранении. В данной области техники имеются в наличии различные аналитические методы для определения стабильности белка, и их обзоры приведены в Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) и Jones, A. (1993) Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90. Например, в одном варианте осуществления стабильность белка определяют, исходя из процентного содержания мономерного белка в растворе, при низком процентном содержании деградированного (например, фрагментированного) и/или агрегированного белка. Предпочтительно, когда композиция является стабильной при комнатной температуре (приблизительно 30°C) или при 40°C в течение по крайней мере 1 месяца и/или стабильной при приблизительно 2-8° в течение по крайней мере 1 года или в течение по крайней мере 2 лет. Кроме того, композиция предпочтительно является стабильной после замораживания (например, до -70°C) и оттаивания композиции, ниже называемого «циклом замораживания/оттаивания».

Антитело «сохраняет свою физическую стабильность» в фармацевтической композиции, если оно, по существу, не демонстрирует признаки, например, агрегации, преципитации и/или денатурации, определяемые при визуальном исследовании цвета и/или прозрачности или определяемые с помощью рассеивания УФ света или гель-фильтрации. Агрегация является процессом, при котором отдельные молекулы или комплексы связываются ковалентно или нековалентно с образованием агрегатов. Агрегация может развиваться до такой степени, что образуется видимый преципитат.

Стабильность, такую как физическая стабильность композиции, можно определить с помощью хорошо известных в данной области техники способов, включающих измерение видимого поглощения света в образце (абсорбции или оптической плотности). Такое измерение поглощения света имеет отношение к мутности композиции. Мутность композиции является отчасти внутренним свойством белка, растворенного в растворе, и ее обычно определяют с помощью нефелометрии и измеряют в нефелометрических единицах мутности (NTU).

Степень мутности, например, в зависимости от концентрации одного или более компонентов в растворе, например, концентрации белка и/или соли, также называют «опалесценцией» или «опалесцирующим видом» композиции. Степень мутности можно рассчитать на основе стандартной кривой, созданной с использованием суспензий с известной мутностью. Стандартные контрольные образцы для определения степени мутности в случае фармацевтических композиций могут основываться на критериях Европейской Фармакопеи (European Pharmacopoeia, Fourth Ed., Европейский департамент по качеству медицинских препаратов (EDQM), Strasbourg, Франция). В соответствии с критериями Европейской Фармакопеи прозрачный раствор определяют как раствор с мутность, которая меньше или равна таковой контрольной суспензии, мутность которой равна приблизительно 3 в соответствии со стандартами Европейской Фармакопеи. Измерения мутности с помощью нефелометрии могут выявить релеевское рассеяние, которое обычно изменяется линейно в зависимости от концентрации, в отсутствие эффектов ассоциации или отклонения от идеальности. В данной области техники хорошо известны другие способы оценки физической стабильности.

Антитело «сохраняет свою химическую стабильность» в фармацевтической композиции, если химическая стабильность в конкретный момент времени является такой, что антитело, как считается, все еще сохраняет свою биологическую активность, определяемую ниже. Химическую стабильность можно определить посредством, например, детектирования и количественного анализа химически измененных форм антитела. Химическое изменение может включать изменение размера (например, усечение), которое можно оценить, используя гель-фильтрацию, электрофорез в SDS-ПААГ и/или ионизацию лазерной десорбции с использованием матрицы/времяпролетную масс-спектрометрию (MALDI/TOF MS), например. Другие типы химического изменения включают изменение заряда (например, возникающее в результате дезамидирования или окисления), оценку которого можно осуществить с помощью ионообменной хроматографии, например.

Антитело «сохраняет свою биологическую активность» в фармацевтической композиции, если антитело в фармацевтической композиции является биологически активным в случае намеченной для него цели. Например, биологическая активность сохраняется, если биологическая активность антитела в фармацевтической композиции находится в пределах приблизительно 30%, приблизительно 20% или приблизительно 10% (в границах ошибок исследования) биологической активности, продемонстрированной в тот момент времени, когда фармацевтическая композиция была приготовлена (например, определенной в анализе связывания антигена).

В фармакологическом значении, в контексте настоящего изобретения, «терапевтически эффективное количество» или «эффективное количество» антитела относится к количеству, эффективному в предупреждении или лечении, или ослаблении симптома нарушения, для лечения которого антитело является эффективным. «Нарушением» является любое состояние, лечение антителом которого принесет пользу. Оно включает хронические и острые нарушения или заболевания, в том числе те патологические состояния, которые вызывают предрасположенность субъекта к нарушению, о котором идет речь.

«Лечение» относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам. Те, кто нуждается в лечении, включают тех, кто уже имеют нарушение, а также тех, у которых нарушение должно быть предупреждено.

Используемые здесь выражения «парентеральное введение» и «вводимые парентерально» означают способы введения, отличные от энтерального и местного введения, обычно с помощью инъекции, и включают, без ограничения, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, подоболочечную, внутрикапсулярную, внутриглазничную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, подкапсулярную, субарахноидальную, внутричерепную, внутрисуставную, внутрипозвоночную и надчревную инъекцию и инфузию.

Используемые здесь выражения «системное введение», «вводимые системно», «периферическое введение» и «вводимые периферически» означают введение соединения, лекарственного средства или другого материала, отличное от введения непосредственно в центральную нервную систему, так что оно проникает в систему пациента и, таким образом, подвергается метаболизму и другим подобным процессам, например, подкожное введение.

Предполагается, что используемый здесь термин «TNF-альфа человека» (здесь сокращенно hTNF-альфа, TNFα или просто hTNF) относится к цитокину человека, который существует в виде секретируемой формы с М.м. 17 кДа и мембраносвязанной формы с М.м. 26 кДа, биологически активная форма которого состоит из тримера нековалентно связанных молекул с М.м. 17 кДа. Дополнительное описание структуры hTNF-альфа приведено, например, в Pennica, D., et al. (1984) Nature 312: 724-729; Davis, J. M., et al. (1987) Biochem. 26: 1322-1326; и Jones, E. Y., et al. (1989) Nature 338: 225-228. Предполагается, что термин «TNF-альфа человека» включает рекомбинантный TNF-альфа человека (rhTNF-альфа), который можно приготовить с помощью стандартных способов рекомбинантной экспрессии или купить (R & D Systems, каталожный № 210-TA, Minneapolis, Minn.).

Предполагается, что используемый здесь термин «антитело» относится к молекулам иммуноглобулинов, состоящим из четырех полипептидных цепей, двух тяжелых (H) цепей и двух легких (L) цепей, взаимно соединенных дисульфидными связями. В это определение также включены другие встречающиеся в природе антитела с измененной структурой, такие как, например, верблюжьи антитела. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (здесь сокращенно HCVR или VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (здесь сокращенно LCVR или VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, CL. VH- и VL-области можно далее подразделить на участки гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность участками (CDR), вперемежку с областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбоксильному концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция содержит антитело с последовательностями CDR1, CDR2 и CDR3, подобными таковым, описанным в патентах США с № 6090382 и 6258562, каждый из которых включен сюда посредством ссылки.

Используемый здесь термин «CDR» относится к определяющему комплементарность участку в последовательности вариабельной области антитела. В каждой из вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи существует три CDR, которые названы CDR1, CDR2 и CDR3, в случае каждой из вариабельных областей. Соответственно различным системам точные границы этих CDR были определены по-разному. Система, описанная Kabat (Id.), не только обеспечивает однозначную систему нумерации остатков, применимую к любой вариабельной области антитела, но также дает точные границы остатков, определяющие три CDR. Эти CDR можно назвать CDR по Kabat. Chothia и др. установили, что некоторые субфрагменты внутри CDR по Kabat принимают почти идентичные пептидные базовые конформации, несмотря на наличие огромного отличия на уровне аминокислотной последовательности (Chothia et al. (1987) Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883). Эти субфрагменты были названы L1, L2 и L3 или H1, H2 и H3, где «L» и «H» обозначает участки легкой цепи тяжелой цепи, соответственно. Эти участки можно назвать CDR по Chothia, которые имеют границы, перекрывающиеся с границами CDR по Kabat. Другие определяющие CDR границы, перекрывающиеся с таковыми CDR по Kabat, были описаны Padlan (1995) FASEB J. 9: 133-139 и MacCallum (1996) J. Mol. Biol. 262(5): 732-745. Кроме того, другие определения границ CDR могут не повторять точно одну из описанных здесь систем, но будут, тем не менее, перекрываться с CDR по Kabat, хотя они могут быть укороченными или удлиненными ввиду предсказания того или экспериментальных данных о том, что конкретные остатки или группы остатков или даже целые CDR не оказывают значительное влияние на связывание с антигеном. В применяемых здесь способах могут использоваться CDR, определенные в соответствии с любой из этих систем, хотя в определенных вариантах осуществления используются CDR, определенные по Kabat или Chothia.

Используемый здесь термин «антигенсвязывающая часть» антитела (или просто «часть антитела») относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность к специфическому связыванию с антигеном (например, hTNF-альфа). Было установлено, что функцию антитела, относящуюся к связыванию антигена, могут выполнять фрагменты полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, включаемых в термин «антигенсвязывающая часть» антитела, включают (i) Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из VL-, VH-, CL- и CH1-доменов; (ii) F(ab')₂-фрагмент, двухвалентный фрагмент, включающий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из VH- и CH1-доменов; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из VL- и VH-доменов одного плеча антитела, (v) dAb-фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), который состоит из VH-домена; и (vi) выделенный определяющий комплементарность участок (CDR). Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, их можно соединить, используя рекомбинантные способы, с помощью синтетического линкера, который позволяет создать их в виде одной белковой цепи, в которой VL- и VH-области спарены с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Предполагается, что такие одноцепочечные антитела также включены в термин «антигенсвязывающая часть» антитела. Также включены другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела. Диатела представляют собой двухвалентные, биспецифические антитела, в которых VH- и VL-домены представлены в одной полипептидной цепи, но используя линкер, который является слишком коротким для того, чтобы сделать возможным спаривание между двумя доменами в одной и той же цепи, вынуждая, тем самым, домены спариваться с комплементарными доменами в другой цепи и создавая два антигенсвязывающих сайта (см., например, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123). В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция содержит антигенсвязывающие части, описанные в патентах США с № 6090382 и 6258562, каждый из которых включен сюда посредством ссылки.

Более того, антитело или его антигенсвязывающая часть могут быть частью более больших иммуноадгезивных молекул, образованных благодаря ковалентному или нековалентному соединению антитела или части антитела с одним или несколькими другими белками или пептидами. Примеры таких иммуноадгезивных молекул включают использование центральной области стрептавидина для создания тетрамерных молекул scFv (Kipriyanov, S. M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6: 93-101) и использование остатка цистеина, пептида-маркера и C-концевой полигистидиновой метки для создания двухвалентных и биотинилированных молекул scFv (Kipriyanov, S. M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31: 1047-1058). Части антител, такие как Fab- и F(ab')₂-фрагменты, можно приготовить из целых антител, используя общепринятые методы, такие как расщепление папаином или пепсином, соответственно, целых антител. Кроме того, антитела, части антител и иммуноадгезивные молекулы можно получить, используя стандартные методы рекомбинантных ДНК, описанные здесь.

Предполагается, что используемый здесь термин «антитело человека» включает антитела, имеющие вариабельные и константные области, происходящие из последовательностей генов иммуноглобулинов зародышевой линии человека. Используемые в настоящем изобретении антитела человека могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями генов иммуноглобулинов зародышевой линии человека (например, мутации, введенные в результате неспецифического или сайт-специфического мутагенеза in vitro или в результате соматической мутации in vivo), например, в CDR и, в частности, в CDR3. Однако предполагается, что используемый здесь термин «антитело человека» не включает антитела, в которых последовательности CDR, происходящие из последовательностей генов зародышевой линии других видов млекопитающих, таких как мышь, были соединены с последовательностями каркасных областей человека.

Предполагается, что используемый здесь термин «рекомбинантное антитело человека» включает все антитела человека, которые являются приготовленными, экспрессированными, созданными или выделенными с помощью рекомбинантного способа, такие как антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного экспрессионного вектора, трансфецированного в клетку-хозяина, (описываемые далее в разделе II, ниже), антитела, выделенные из комбинаторной библиотеки рекомбинантных антител человека, (описываемые далее в разделе III, ниже), антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным по генам иммуноглобулинов человека, (см., например, Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295) или антитела, приготовленные, экспрессированные, созданные или выделенные с помощью любого другого способа, который включает сплайсинг последовательностей генов иммуноглобулинов человека с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека имеют вариабельные и константные области, происходящие из последовательностей генов иммуноглобулинов зародышевой линии человека. В определенных вариантах осуществления, однако, такие рекомбинантные антитела человека подвергают in vitro мутагенезу (или в случае использования животного, трансгенного по последовательностям Ig человека, in vivo соматическому мутагенезу), и поэтому аминокислотные последовательности VH- и VL-областей рекомбинантных антител являются последовательностями, которые, несмотря на то, что они являются происходящими из последовательностей VH и VL зародышей линии человек и являются родственными им, могут не встречаться в природе в репертуаре антител человека зародышевой линии in vivo.

Предполагается, что используемый здесь термин «выделенное антитело» относится к антителу, которое в значительной степени освобождено от других антител, обладающих отличными антигенными специфичностями, (например, выделенное антитело, которое специфически связывается с hTNF-альфа, в значительной степени освобождено от антител, которые специфически связываются с антигенами, отличными от hTNF-альфа). Однако выделенное антитело, которое специфически связывается с hTNF-альфа, может обладать перекрестной реактивностью с другими антигенами, такими как молекулы TNF-альфа других видов. Более того, выделенное антитело может быть в значительной степени освобождено от другого клеточного материала и/или химических веществ.

Предполагается, что используемый здесь термин «нейтрализующее антитело» (или «антитело, которое нейтрализует активность hTNF-альфа») относится к антителу, связывание которого с hTNF-альфа вызывает ингибирование биологической активности hTNF-альфа. Это ингибирование биологической активности hTNF-альфа можно оценить посредством измерения одного или нескольких показателей биологической активности hTNF-альфа, таких как индуцированная hTNF-альфа цитотоксичность (либо in vitro, либо in vivo), индуцированная hTNF-альфа клеточная активация и связывание hTNF-альфа с рецепторами hTNF-альфа. Эти показатели биологической активности hTNF-альфа можно оценить с помощью одного или более из нескольких стандартных in vitro или in vivo анализов, известных в данной области техники и описанных в патентах США с № 6090382 и 6258562, каждый из которых включен сюда посредством ссылки. Предпочтительно способность антитела к нейтрализации активности hTNF-альфа определяют по ингибированию индуцированной hTNF-альфа цитотоксичности в отношении клеток L929. В качестве дополнительного или альтернативного параметра активности hTNF-альфа можно определить способность антитела к ингибированию индуцированной hTNF-альфа экспрессии ELAM-1 в HUVEC, в качестве показателя индуцированной hTNF-альфа клеточной активации.

Используемый здесь термин «поверхностный плазмонный резонанс» относится к оптическому явлению, которое позволяет анализировать биоспецифические взаимодействия в режиме реального времени посредством детектирования изменений концентраций белов внутри матрицы биосенсора, например, используя систему BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Швеция и Piscataway, N.J.). Ради дополнительных описаний см. Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11: 620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8: 125-131; и Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277.

Предполагается, что используемый здесь термин «K_on» относится к константе скорости ассоциации связывающегося белка (например, антитела) с антигеном с образованием, например, комплекса антитело/антиген, как известно в данной области техники.

Предполагается, что используемый здесь термин «K_off» относится к константе скорости диссоциации антитела от комплекса антитело/антиген.

Предполагается, что используемый здесь термин «Kd» относится к константе диссоциации конкретной связи между антителом и антигеном и относится к величине, полученной в титриметрических анализах при равновесии или посредством деления константы скорости диссоциации (k_off) на константу скорости ассоциации (k_on).

Различные аспекты настоящего изобретения описываются в дополнительных деталях в следующих подсекциях.

II. Композиции настоящего изобретения

Особенностью настоящего изобретения являются жидкие фармацевтические композиции (например, композиции антител), имеющие улучшенные характеристики по сравнению с признанными в данной области техники композициями. Настоящее изобретение основывается на неожиданном обнаружении того, что посредством удаления NaCl и добавления более чем 20 мг/мл полиола, например, сахароспирта, концентрацию антитела человека против TNF-альфа в композиции можно увеличить до приблизительно 100 мг/мл. Несмотря на высокую концентрацию антитела, композиция настоящего изобретения способна сохранять растворимость и стабильность белка, например, во время производства, хранения и/или повторных технологических стадий замораживания/оттаивания или длительного местонахождения на увеличенных границах раздела воздух/раствор. Кроме того, в композиции настоящего изобретения сохраняется низкий уровень агрегации белка (т.е. менее чем 1%), несмотря на то, что она содержит приблизительно 100 мг/мл антитела. Как ни удивительно, в композиции настоящего изобретения также сохраняется низкий коэффициент вязкости в пределах диапазонов, подходящих для подкожной инъекции, несмотря на то, что она содержит приблизительно 100 мг/мл антитела. Кроме того, композиция настоящего изобретения, например, с высокой концентрацией антитела против TNF-альфа, сохраняет растворимость, сохраняет низкую вязкость, подходящую для подкожной инъекции, и сохраняет стабильность в пределах диапазона pH, составляющего почти единицу, например, от pH 5,2 до pH 6.0. В одном варианте осуществления мутность композиции составляет менее чем 100 NTU согласно стандартному исследованию напряжения от перемешивания в течение 48 часов. Таким образом, в композиции с высокой концентрацией антитела настоящего изобретения преодолен ряд известных для композиций проблем, включающих проблемы, связанные со стабильностью, вязкостью, мутностью и физической деградацией.

Неожиданной особенностью композиции настоящего изобретения является то, что в отсутствие NaCl итоговая вязкость композиции остается низкой (например, составляет приблизительно 3,1-3,3 миллипаскаль-секунда, например, приблизительно 3,00, 3,05, 3,10, 3,15, 3,20, 3,25, 3,30, 3,35 или приблизительно 3,40 миллипаскаль-секунда), несмотря на то, что концентрация антитела является высокой (например, составляет 100 мг/мл или больше). Как правило, вязкость увеличивается по мере увеличения концентрации белка (см. Shire et al. (2004) J Pharm Sci 93: 1390 ради обзора). Нейтрализацию такого увеличения почти всегда осуществляют посредством добавления ионных наполнителей, например, NaCl и MgCl₂, однако добавление таких наполнителей может также приводить к повышению мутности раствора. Повышенная мутность часто связана с образованием нерастворимых белковых агрегатов, преципитатов или белковых частиц (например, при агрегации). Таким образом, жидкая фармацевтическая композиция настоящего изобретения обеспечивает высокую концентрацию антитела (например, по крайней мере 100 мг/мл) при вязкости, подходящей для подкожного введения, без необходимости добавления NaCl.

В одном варианте осуществления композиции настоящего изобретения включают белки в высоких концентрациях из условия, чтобы жидкая композиция не демонстрировала значительную опалесценцию, агрегацию или преципитацию.

В другом варианте осуществления композиции настоящего изобретения включают белки в высоких концентрациях из условия, чтобы они подходили, например, для подкожного введения без значительной ощущаемой боли (например, определяемой с помощью оценки по визуальной аналоговой шкале (VAS)).

Композиции настоящего изобретения включают белки в высоких концентрациях, в том числе, например, белок в концентрации, составляющей приблизительно 50 мг/мл или приблизительно 100 мг/мл антитела человека против TNF-альфа или его антигенсвязывающей части. Соответственно, как описано в примере 1 ниже, в одном аспекте настоящего изобретения жидкая фармацевтическая композиция включает антитело человека против TNF-альфа в концентрации, составляющей приблизительно 50 мг/мл. Как описано в примерах 2-6 ниже, в другом аспекте настоящего изобретения жидкая фармацевтическая композиция включает антитело человека против TNF-альфа в концентрации, составляющей приблизительно 100 мг/мл. В еще одном аспекте настоящего изобретения жидкая фармацевтическая композиция включает антитело человека против TNF-альфа в концентрации, составляющей приблизительно 150 мг/мл. Хотя предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения являются композиции, включающие белки в высоких концентрациях, также предусматривается, что композиции настоящего изобретения могут включать антитело в концентрации, находящейся между приблизительно 1 мг/мл и приблизительно 150 мг/мл или между приблизительно 40 мг/мл и 125 мг/мл. Предполагается, что частью этого изобретения также являются концентрации и диапазоны, промежуточные по отношению к вышеперечисленным концентрациям, (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199 или 200 мг/мл).

В другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается жидкая фармацевтическая композиция, включающая полиол, поверхностно-активное вещество и буферную систему в количествах, достаточных для составления рецептуры антитела, например, адалимумаба, для терапевтического применения в концентрации, превышающей, например, приблизительно 100 мг/мл. В одном варианте осуществления жидкие фармацевтические композиции не включают NaCl.

Однако следует обратить внимание, что хотя предпочтительные композиции настоящего изобретения не включают NaCl, в композициях может присутствовать небольшое количество NaCl, например, от приблизительно 0,01 мМ до приблизительно 300 мМ. Кроме того, предполагается, что включено любое количество NaCl, промежуточное по отношению к приведенным значениям.

В одном аспекте настоящим изобретением обеспечивается жидкая фармацевтическая композиция, включающая антитело человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающий фрагмент, (например, адалимумаб), полиол, без добавления NaCl, в количествах, достаточных для составления рецептуры антитела для терапевтического применения.

Настоящим изобретением также обеспечиваются жидкие композиции, включающие антитело человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающий фрагмент, при pH от приблизительно 5,0 до 6,4 и имеющие мутность, составляющую менее чем приблизительно 60 NTU (например, приблизительно 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 или 63 NTU) согласно стандартному исследованию напряжения от перемешивания в течение 24 часов, без добавления NaCl. В другом аспекте настоящим изобретением обеспечиваются жидкие композиции, включающие антитело человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающий фрагмент, при pH от приблизительно 5,0 до 6,4 и имеющие мутность, составляющую менее чем приблизительно 100 NTU (например, приблизительно 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100 NTU) согласно стандартному исследованию напряжения от перемешивания в течение 48 часов, без добавления NaCl. В еще одном аспекте настоящим изобретением обеспечиваются жидкие композиции, включающие антитело человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающий фрагмент, при pH от приблизительно 5,0 до 6,4 и имеющие мутность, составляющую менее чем приблизительно 40 NTU (например, приблизительно 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 NTU) после хранения в течение 3 месяцев при 5°C, 25°C или 40°C, без добавления NaCl.

Особенностью композиции настоящего изобретения является включение полиола, например, сахароспирта, в концентрации, превышающей 20 мг/мл. В одном варианте осуществления полиолом является либо сорбит, либо маннит. Следует обратить внимание, что добавление сорбита или маннита к белковым растворам не всегда сопровождается увеличением стабильности белка. Например, сорбит не помогал против преципитации гормона роста свиньи после оценки в условиях термического стресса или межфазного напряжения - в противоположность Tween 20 и гидроксипропил-β-циклодекстрину, соответственно (Charman et al. (1993) Pharm. Res. 10(7): 954-62).

В одном варианте осуществления подходящим для применения в композициях настоящего изобретения полиолом является сахароспирт, например, маннит или сорбит. Жидкие композиции настоящего изобретения, включающие полиол, обычно включают более чем приблизительно 20 мг полиола. В одном варианте осуществления композиции включают более чем приблизительно 30 мг/мл полиола. В другом варианте осуществления композиции включают более чем приблизительно 40 мг/мл полиола. В другом варианте осуществления композиции включают приблизительно 40-45 мг/мл полиола, например, приблизительно 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 или 55 мг/мл. Кроме того, предполагается, что включены диапазоны значений, в качестве верхних и/или нижних пределов которых использована комбинация любых из вышеприведенных значений.

В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения готовят жидкую композицию, включающую антитело в pH-забуференном растворе. Буфер этого изобретения имеет pH, колеблющийся от приблизительно 4 до приблизительно 8, предпочтительно от приблизительно 4,5 до приблизительно 7,0, более предпочтительно от приблизительно 4,5 до приблизительно 6,0, даже предпочтительнее от приблизительно 4,8 до приблизительно 5,5, и наиболее предпочтительно он имеет pH от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,4. В одном варианте осуществления pH композиции настоящего изобретения составляет приблизительно 5,2. В другом варианте осуществления pH композиции настоящего изобретения составляет приблизительно 6,0. Предполагается, что частью этого изобретения также являются диапазоны, промежуточные по отношению к вышеперечисленным pH (например, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4). Предполагается, что включены диапазоны значений, в качестве верхних и/или нижних пределов которых использована комбинация любых из вышеприведенных значений, например, 5,2-5,8. Примеры буферов, которые будут контролировать pH в этом диапазоне, включают фосфатный, ацетатный (например, натрийацетатный), сукцинатный (например, натрийсукцинатный), глюконатный, глютаматный, гистидиновый, цитратный и включающие другие органические кислоты буферы.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения композиция включает буферную систему, которая содержит цитрат и/или фосфат, для сохранения pH в диапазоне от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,4. В одном варианте осуществления pH композиции составляет приблизительно 5,2. В другом варианте осуществления pH композиции составляет приблизительно 6,0.

В другом предпочтительном варианте осуществления буферная система включает моногидрат лимонной кислоты, натрия цитрат, дигидрат динатрия фосфата и/или дигидрат натрия фосфата однозамещенного. В дальнейшем предпочтительном варианте осуществления буферная система включают приблизительно 1,15-1,45 мг/мл лимонной кислоты (например, приблизительно 1,15, 1,20, 1,25, 1,30, 1,35, 1,40 или 1,45), приблизительно 0,2-0,4 мг/мл дигидрата цитрата натрия (например, приблизительно 0,2, 0,25, 0,3, 0,35 или 0,4), приблизительно 1,35-1,75 мг/мл дигидрата динатрия фосфата (например, 1,35, 1,40, 1,45, 1,50, 1,55, 1,60, 1,65, 1,70 или 1,75), приблизительно 0,75-0,95 мг/мл дигидрата натрия фосфата однозамещенного (например, приблизительно 0,75, 0,80, 0,85, 0,9 или 0,95).

Предполагается, что частью этого изобретения также являются значения и диапазоны, промежуточные по отношению к вышеперечисленным концентрациям. Кроме того, предполагается, что включены диапазоны значений, в качестве верхних и/или нижних пределов которых использована комбинация любых из вышеприведенных значений, например, 1,20-1,40 мг/мл.

В других вариантах осуществления буферная система включает 1,3-1,31 мг/мл лимонной кислоты (например, приблизительно 1,305 мг/мл). В другом варианте осуществления буферная система включает приблизительно 0,27-0,33 мг/мл дигидрата цитрата натрия (например, приблизительно 0,305 мг/мл). В одном варианте осуществления буферная система включает приблизительно 1,5-1,56 мг/мл дигидрата динатрия фосфата (например, приблизительно 1,53 мг/мл). В другом варианте осуществления буферная система включает приблизительно 0,83-0,89 мг/мл дигидрата натрия фосфата однозамещенного (например, приблизительно 0,86 мг/мл).

К композиции антитела настоящего изобретения может быть также добавлен детергент или поверхностно-активное вещество. Приводимые в качестве примеров детергенты включают неионные детергенты, такие как полисорбаты (например, полисорбаты 20, 80 и т.д.) или полоксамеры (например, полоксамер 188). Добавляемое количество детергента является таким, что оно уменьшает агрегацию составленного в рецептуру антитела и/или минимизирует образование частиц в композиции, и/или уменьшает адсорбцию. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения композиция включает поверхностно-активное вещество, которым является полисорбат. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения композиция содержит детергент полисорбат 80. В одном предпочтительном варианте осуществления композиция содержит между приблизительно 0,1 и приблизительно 2,0 мг/мл полисорбата 80, например, приблизительно 1 мг/мл.

Предполагается, что частью этого изобретения также являются значения и диапазоны, промежуточные по отношению к вышеперечисленным концентрациям, например, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9. Кроме того, предполагается, что включены диапазоны значений, в качестве верхних и/или нижних пределов которых использована комбинация любых из вышеприведенных значений, например, 0,3-1,1 мг/мл.

В одном варианте осуществления композиция настоящего изобретения по существу состоит из антитела человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающей части, в концентрации, составляющей по крайней мере приблизительно 100 мг/мл, поверхностно-активного вещества (например, полисорбата 80), полиола (например, более 20 мг/мл сорбита или маннита) и буферной системы (например, моногидрата лимонной кислоты, натрия цитата, дигидрата динатрия фосфата и/или дигидрата натрия фосфата однозамещенного) и не содержит NaCl.

В одном варианте осуществления композиция содержит определенные выше агенты (т.е. антитело в концентрации, составляющей по крайней мере приблизительно 100 мг/мл, буферную систему, полиол и поверхностно-активное вещество, без NaCl) и по существу не содержит консерванты, такие как бензиловый спирт, фенол, м-крезол, хлорбутанол и бензетония хлорид. В другом варианте осуществления в композицию может быть включен консервант. В композицию может быть включен один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, наполнителей или стабилизаторов, таких как те, которые описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences 16^th edition, Osol, A. Ed. (1980), при условии, что они не оказывают значительное неблагоприятное влияние на желаемые характеристики композиции. Приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и включают дополнительные буферные агенты, сорастворители, антиоксиданты, включающие аскорбиновую кислоту и метионин, хелатообразующие агенты, такие как EDTA, металлокомплексы (например, Zn-белковые комплексы), биоразрушаемые полимеры, такие как полиэфиры, и/или солеобразующие противоионы, такие как натрий.

Композиция настоящего изобретения может быть также объединена с одним или несколькими другими терапевтическими средствами, необходимыми для лечения конкретного симптома, предпочтительно средствами с дополняющими активностями, которые не оказывают неблагоприятное влияние на антитело композиции. Такие терапевтические средства соответственно присутствуют в комбинации в количествах, которые эффективны для намеченной цели. Дополнительные терапевтические средства, которые могут быть объединены с композицией настоящего изобретения, дополнительно описаны в патентах США с № 6090382 и 6258562, каждый из которых включен сюда посредством ссылки.

Композиции, используемые для in vivo введения, должны быть стерильными. Это легко осуществить посредством фильтрации через стерильные фильтрационные мембраны до или после приготовления композиции.

Как здесь описано, жидкая композиция настоящего изобретения обладает полезным свойством стабильности и стойкостью при хранении. Стабильность жидкой композиции не зависит от формы хранения и включает, но без ограничения, композиции, которые являются замороженными, лиофилизированными, высушенными распылением, или композиции, в которых активный ингредиент является суспендированным. Стабильность можно определить при выбранной температуре в течение выбранного периода времени. В одном аспекте настоящего изобретения белок в жидких композициях является стабильным в жидкой форме в течение по крайней мере приблизительно 3 месяцев; по крайней мере приблизительно 4 месяцев, по крайней мере приблизительно 5 месяцев; по крайней мере приблизительно 6 месяцев; по крайней мере приблизительно 12 месяцев; по крайней мере приблизительно 18 месяцев. Предполагается, что частью этого изобретения также являются значения и диапазоны, промежуточные по отношению к вышеперечисленным периодам времени, например, составляющие приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или приблизительно 24 месяца. Кроме того, предполагается, что включены диапазоны значений, в качестве верхних и/или нижних пределов которых использована комбинация любых из вышеприведенных значений в качестве верхних и/или нижних пределов. Предпочтительно, когда композиция является стабильной при комнатной температуре (приблизительно 30°C) или при 40°C в течение по крайней мере приблизительно 1 месяца и/или стабильной при приблизительно 2-8°C в течение по крайней мере приблизительно 1 года, или более предпочтительно стабильной при приблизительно 2-8°C в течение по крайней мере приблизительно 2 лет. Кроме того, предпочтительно, когда композиция является стабильной после замораживания (до, например, -80°C) и оттаивания композиции, ниже называемого «циклом замораживания/оттаивания».

Стабильность белка в жидкой композиции можно также определить как процентное содержание мономера, агрегата, или фрагмента, или их комбинации, белка в композиции. Белок «сохраняет свою физическую стабильность» в композиции, если он по существу не демонстрирует признаки агрегации, преципитации и/или денатурации, определяемые при визуальном исследовании цвета и/или прозрачности или определяемые с помощью рассеивания УФ света или гель-фильтрации. В одном аспекте настоящего изобретения стабильной жидкой композицией является композиция, содержащая менее чем приблизительно 10% и предпочтительно менее чем приблизительно 5% белка, присутствующего в виде агрегата в композиции.

В одной варианте осуществления физическую стабильность жидкой композиции определяют с помощью определения мутности композиции вследствие исследования напряжения от перемешивания, например, исследования напряжения от перемешивания в течение 24 часов или 48 часов. Например, исследование напряжения от перемешивания можно выполнить посредством помещения подходящего объема жидкой композиции в лабораторный стакан с магнитной мешалкой, например, Multipoint HP, 550 оборотов/мин), отбора аликвот в любое подходящее время, например, в T0-T48 (ч), и проведения на аликвотах подходящих целевых исследований. В качестве контроля служат образцы композиции в тех же условиях, но без перемешивания.

Определения мутности можно выполнить, используя лабораторную систему для определения мутности от Hach (Германия) и представить в виде нефелометрических единиц мутности (NTU).

Жидкие композиции настоящего изобретения также имеют полезные характеристики, относящиеся к переносимости. Переносимость оценивают на основе оценки ощущаемой субъектом боли в месте инъекции, используя визуальную аналоговую шкалу (VAS) для оценки боли.

VAS является средством определения, с помощью которого определяется боль, когда она колеблется по всему диапазону значений, например, от отсутствия боли до крайней степени боли. В эксплуатационном отношении VAS представляет собой горизонтальную линию длиной приблизительно 100 мм, с которой соотнесены числовые обозначения и/или словесные описания, например, 0 или 10, или «отсутствие боли» или «мучительная боль», необязательно с дополнительными словесными описаниями или числовыми обозначениями между крайними положениями, например, слабая, умеренная и сильная; или с 1 по 9 (см., например, Lee JS, et al. (2000) Acad. Emerg. Med. 7: 550).

Дополнительные показатели переносимости, которые можно определить, включают, например, шкалу Драйзе (кровотечение, точечное кровоизлияние, эритему, отек, зуд) и синяк.

III. Антитела для применения в композициях настоящего изобретения

Антителами, которые могут использоваться в композициях настоящего изобретения, являются антитела, направленные против антигена TNF-альфа, включающего TNF-альфа человека (или hTNF-альфа).

В одном варианте осуществления особенностью настоящего изобретения является выделенное антитело человека, или его антигенсвязывающая часть, которое связывается с TNF-альфа человека с высокой аффинностью и характеризуется низкой скоростью диссоциации, а также обладает высокой нейтрализующей способностью. Предпочтительно антителами человека, используемыми в настоящем изобретении, являются рекомбинантные, нейтрализующие антитела человека против hTNF-альфа. Самое предпочтительное рекомбинантное, нейтрализующее антитело настоящего изобретения названо здесь D2E7, также называемым HUMIRA^TM или адалимумабом (аминокислотная последовательность VL-области D2E7 представлена в SEQ ID NO:1; аминокислотная последовательность VH-области D2E7 представлена в SEQ ID NO:2). Свойства D2E7 (адалимумаба/HUMIRA®) были описаны в Salfeld et al., патентах США с № 6090382, 6258562 и 6509015, все из которых включены сюда посредством ссылки.

В одном варианте осуществления антитело человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающая часть, подвергается диссоциации от TNF-альфа человека с Kd, составляющей 1×10^-8 M или меньше, и с константой скорости диссоциации K_off, составляющей 1×10^-3 сек^-1 или меньше, обе из которых являются определенными с помощью поверхностного плазмонного резонанса, и нейтрализует индуцированную TNF-альфа человека цитотоксичность в стандартном in vitro анализе с использованием клеток L929 с IC₅₀, составляющей 1×10^-7 M или меньше. Более предпочтительно, когда выделенное антитело человека, или его антигенсвязывающая часть, подвергается диссоциации от TNF-альфа человека с K_off, составляющей 5×10^-4 сек^-1 или меньше, или даже предпочтительнее с K_off, составляющей 1×10^-4 сек^-1 или меньше. Более предпочтительно, когда выделенное антитело человека, или его антигенсвязывающая часть, нейтрализует индуцированную TNF-альфа человека цитотоксичность в стандартном in vitro анализе с использованием клеток L929 с IC₅₀, составляющей 1×10^-8 M или меньше, даже предпочтительнее с IC₅₀, составляющей 1×10^-9 M или меньше, и еще предпочтительнее с IC₅₀, составляющей 1×10^-10 M или меньше. В предпочтительном варианте осуществления антителом является выделенное рекомбинантное антитело, или его антигенсвязывающая часть.

В данной области техники хорошо известно, что CDR3-участки тяжелой и легкой цепей антител играют важную роль в специфичности связывания/аффинности связывания антитела с антигеном. Соответственно, в другом аспекте настоящее изобретение имеет отношение к лечению болезни Крона посредством введения антител человека, которые имеют медленную кинетику диссоциации в случае ассоциации с hTNF-альфа и которые имеют CDR3-участки легкой и тяжелой цепей, которые являются структурно идентичными или родственными таковым D2E7. Положение 9 CDR3 VL D2E7 может быть занято Ala или Thr без оказания значительного влияния на K_off. Соответственно, консенсусный мотив для CDR3 VL D2E7 включает аминокислотную последовательность Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A) (SEQ ID NO:3). Кроме того, положение 12 CDR3 VH D2E7 может быть занято Tyr или Asn, без оказания значительного влияния на K_off. Соответственно, консенсусный мотив для CDR3 VH D2E7 включает аминокислотную последовательность V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/N) (SEQ ID NO:4). Кроме того, как продемонстрировано в примере 2 патента США с № 6090382, в CDR3-участке тяжелой и легкой цепей D2E7 (в положении 1, 4, 5, 7 или 8 в пределах CDR3 VL или в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11 в пределах CDR3 VH) можно осуществить замену одним остатком аланина без оказания значительного влияния на K_off. Более того, квалифицированному специалисту будет понятно, что, принимая во внимание возможность осуществления замен на аланин в CDR3-участках VL и VH D2E7, может быть возможной замена других аминокислот в пределах CDR3-участков, в частности, замены консервативными аминокислотами, при сохранении низкой константы скорости диссоциации антитела. Предпочтительно, когда в пределах CDR3-участков VL и/или VH D2E7 осуществляют не более одной - пяти консервативных аминокислотных замен. Более предпочтительно, когда в пределах CDR3-участков VL и/или VH D2E7 осуществляют не более одной - трех консервативных аминокислотных замен. Кроме того, консервативные аминокислотные замены не должны осуществляться в положениях аминокислот, ответственных за связывание с hTNF-альфа. Положения 2 и 5 CDR3 VL D2E7 и положения 1 и 7 CDR3 VH D2E7, как представляется, ответственны за взаимодействие с hTNF-альфа, и поэтому консервативные аминокислотные замены предпочтительно не осуществляют в этих положениях (хотя приемлемой является замена на аланин в положении 5 CDR3 VH D2E7, как описано выше) (см. патент США с № 6090382).

Соответственно, в другом варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающая часть предпочтительно имеет следующие характеристики:

a) подвергается диссоциации от TNFα человека с константой скорости диссоциации K_off, составляющей 1×10^-3 сек^-1 или меньше, определенной с помощью поверхностного плазмонного резонанса;

b) имеет CDR3-участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3 или последовательность, являющуюся результатом модификации SEQ ID NO:3 посредством одной замены на аланин в положении 1, 4, 5, 7 или 8 или посредством одной - пяти консервативных аминокислотных замен в положениях 1, 3, 4, 6, 7, 8 и/или 9;

c) имеет CDR3-участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4 или последовательность, являющуюся результатом модификации SEQ ID NO:4 посредством одной замены на аланин в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11 или посредством одной-пяти консервативных аминокислотных замен в положениях 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 и/или 12.

Более предпочтительно, когда антитело, или его антигенсвязывающая часть, подвергается диссоциации от TNF-альфа человека с K_off, составляющей 5×10^-4 сек^-1 или меньше. Даже предпочтительнее, когда антитело, или его антигенсвязывающая часть, подвергается диссоциации от TNF-альфа человека с K_off, составляющей 1×10^-4 сек^-1 или меньше.

В еще одном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающая часть предпочтительно содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR), имеющую CDR3-участок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3 или последовательность, являющуюся результатом модификации SEQ ID NO:3 посредством одной замены на аланин в положении 1, 4, 5, 7 или 8, и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), имеющую CDR3-участок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4 или последовательность, являющуюся результатом модификации SEQ ID NO:4 посредством одной замены на аланин в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11. Предпочтительно LCVR, кроме того, имеет CDR2-участок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5 (т.е. CDR2 VL D2E7), а HCVR, кроме того, имеет CDR2-участок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 (т.е. CDR2 VH D2E7). Даже предпочтительнее, когда LCVR, кроме того, имеет CDR1-участок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7 (т.е. CDR1 VL D2E7), а HCVR имеет CDR1-участок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8 (т.е. CDR1 VH D2E7). Каркасные области для VL предпочтительно происходят из семейства генов VκI зародышевой линии человека, более предпочтительно из гена Vk зародышевой линии человека A20 и наиболее предпочтительно из последовательностей каркасных областей VL D2E7, представленных на фиг.1A и 1B патента США с № 6090382. Каркасные области для VH предпочтительно происходят из семейства генов VH3 зародышевой линии человека, более предпочтительно из гена VH зародышевой линии человека DP-31 и наиболее предпочтительно из последовательностей каркасных областей VH D2E7, представленных на фиг.2A и 2B патента США с № 6090382.

Соответственно, в другом варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающая часть предпочтительно содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR), включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 (т.е. VL D2E7) и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 (т.е. VH D2E7). В определенных вариантах осуществления антитело включает константную область тяжелой цепи, такую как константная область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD. Предпочтительно, когда константной областью тяжелой цепи является константная область тяжелой цепи IgG1 или константная область тяжелой цепи IgG4. Кроме того, антитело может включать константную область легкой цепи, либо константную область легкой цепи каппа, либо константную область легкой цепи лямбда. Предпочтительно, когда антитело включает константную область легкой цепи каппа. Альтернативно, частью антитела может быть, например, Fab-фрагмент или одноцепочечный Fv-фрагмент.

В опять же других вариантах осуществления настоящее изобретение включает применения выделенного антитела человека, или его антигенсвязывающей части, содержащего CDR3-участки VL и VH, родственные таковым D2E7, например, применения антител, или их антигенсвязывающих частей, с вариабельной областью легкой цепи (LCVR), имеющей CDR3-участок, включающий аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 и SEQ ID NO:26, и с вариабельной областью тяжелой цепи (HCVR), имеющей CDR3-участок, включающий аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34 и SEQ ID NO:35.

Используемое в способах и композициях настоящего изобретения антитело, или часть антитела, можно приготовить с помощью рекомбинантной экспрессии генов легкой и тяжелой цепей иммуноглобулинов в клетке-хозяине. Чтобы осуществить рекомбинантную экспрессию антитела, клетку-хозяина трансфецируют одним или несколькими рекомбинантными экспрессионными векторами, несущими фрагменты ДНК, кодирующие легкую и тяжелую цепи антитела - иммуноглобулина из условия, чтобы легкая и тяжелая цепи экспрессировались в клетке-хозяине и, предпочтительно, секретировались в среду, в которой культивируют клетки-хозяева, из которой можно выделить антитела. Для получения генов тяжелой и легкой цепей антитела, встраивания этих генов в рекомбинантные экспрессионные векторы и введения векторов в клетки-хозяева используют стандартные методики рекомбинантных ДНК, такие как те, которые описаны в Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F.M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) и патенте США с № 4816397, выданном Boss и др.

Чтобы экспрессировать адалимумаб (D2E7) или родственное адалимумабу (D2E7) антитело, сначала получают фрагменты ДНК, кодирующие вариабельные области легкой и тяжелой цепей. Эти ДНК можно получить с помощью амплификации и модификации последовательностей ДНК зародышевой линии для генов вариабельных областей легкой и тяжелой цепей, используя полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Последовательности ДНК зародышевой линии для генов вариабельных областей легкой и тяжелой цепей человека известны в данной области техники (см., например, базу данных, касающихся последовательностей зародышевой линии человека, «Vbase»; см. также Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I.M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227: 776-798; и Cox, J.P.L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line V78 Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24: 827-836; содержание каждой из которых включено сюда в словесной форме посредством ссылки). Для получения фрагмента ДНК, кодирующего вариабельную область тяжелой цепи D2E7 или родственного D2E7 антитела, с помощью стандартной ПЦР амплифицируют член семейства VH3 генов VH зародышевой линии человека. Наиболее предпочтительно, когда амплифицируют последовательность VH зародышевой линии DP-31. Для получения фрагмента ДНК, кодирующего вариабельную область легкой цепи D2E7 или родственного D2E7 антитела, с помощью стандартной ПЦР амплифицируют член семейства VκI генов VL зародышевой линии человека. Наиболее предпочтительно, когда амплифицируют последовательность VL зародышевой линии A20. Праймеры для ПЦР, подходящие для применения при амплификации последовательностей VH зародышевой линии DP-31 и VL зародышевой линии A20, можно сконструировать на основе нуклеотидных последовательностей, раскрытых в приведенных выше ссылочных документах, используя стандартные способы.

После получения фрагментов зародышевой линии для VH и VL эти последовательности можно мутировать так, чтобы они кодировали раскрытые здесь аминокислотные последовательности D2E7 или родственного D2E7 антитела. Сначала аминокислотные последовательности, кодируемые последовательностями ДНК зародышевой линии для VH и VL, сравнивают с аминокислотными последовательностями VH и VL D2E7 или родственного D2E7 антитела для идентификации аминокислотных остатков в последовательности D2E7 или родственного D2E7 антитела, которые отличаются от таковых в зародышевой линии. Затем соответствующие нуклеотиды последовательностей ДНК зародышевой линии мутируют из условия, чтобы мутированная последовательность зародышевой линии кодировала аминокислотную последовательность D2E7 или родственного D2E7 антитела, используя генетический код для определения того, какие изменения нуклеотидов следует осуществить. Мутагенез последовательностей зародышевой линии выполняют с помощью стандартных способов, таких как мутагенез с использованием ПЦР (в случае которого мутированные нуклеотиды встраивают в праймеры для ПЦР, так что продукт ПЦР содержит мутации) или сайт-направленный мутагенез.

Кроме того, следует обратить внимание на то, что, если последовательности «зародышевой линии», полученные в результате амплификации с помощью ПЦР, кодируют расхождения в аминокислотах каркасных областей от истинной конфигурации зародышевой линии (т.е. различия в амлифицированной последовательности по сравнению с истинной последовательностью зародышевой линии, например, в результате соматической мутации), желательным может быть превращение этих различий в аминокислотах обратно в истинные последовательности зародышевой линии (т.е. «обратная мутация» остатков каркасных областей в конфигурацию зародышевой линии).

После получения фрагментов ДНК, кодирующих сегменты VH и VL D2E7 или родственного D2E7 антитела, (например, посредством амплификации и мутагенеза генов VH и VL зародышевой линии, как описано выше), с этими фрагментами ДНК можно в дальнейшем манипулировать благодаря стандартным методам рекомбинантных ДНК, например, для превращения генов вариабельных областей в полноразмерные гены цепей антитела, в гены Fab-фрагментов или ген scFv. При этих манипуляциях кодирующий VL или VH фрагмент ДНК функционально связывают с другим фрагментом ДНК, кодирующим другой белок, такой как константная область антитела или гибкий линкер. Предполагается, что используемый в этом контексте термин «функционально связывают» означает, что два фрагмента ДНК соединяют из условия, чтобы аминокислотные последовательности, кодируемые двумя фрагментами ДНК, оставались в рамке считывания.

Выделенную ДНК, кодирующую VH-область, можно превратить в полноразмерный ген тяжелой цепи посредством функционального связывания кодирующей VH ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константные области тяжелой цепи (CH1, CH2 и CH3). Последовательности генов константных областей тяжелой цепи человека известны в данной области техники (см., например, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication № 91-3242), и фрагменты ДНК, включающие эти области, можно получить посредством стандартной амплификации с помощью ПЦР. Константной областью тяжелой цепи может быть константная область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD, но наиболее предпочтительно ей является константная область IgG1 или IgG4. Для получения гена тяжелой цепи Fab-фрагмента кодирующую VH ДНК можно функционально связать с другой молекулой ДНК, кодирующей лишь константную область CH1 тяжелой цепи.

Выделенную ДНК, кодирующую VL-область, можно превратить в полноразмерный ген легкой цепи (а также ген легкой цепи Fab-фрагмента) посредством функционального связывания кодирующей VL ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область легкой цепи, CL. Последовательности генов константной области легкой цепи человека известны в данной области техники (см., например, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication № 91-3242), и фрагменты ДНК, включающие эти области, можно получить посредством стандартной амплификации с помощью ПЦР. Константной областью легкой цепи может быть константная область каппа или лямбда, но наиболее предпочтительно ей является константная область каппа.

Для создания гена scFv фрагменты ДНК, кодирующие VH и VL, функционально связывают с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например, кодирующим аминокислотную последовательность (Gly4-Ser)3, из условия, чтобы последовательности VH и VL можно было экспрессировать в виде непрерывного одноцепочечного белка, при этом VL- и VH-области соединены с помощью гибкого линкера (см., например, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348: 552-554).

Чтобы экспрессировать антитела, или части антител, используемые в настоящем изобретении, ДНК, кодирующие неполные или полноразмерные легкую и тяжелую цепи, полученные, как описано выше, встраивают в экспрессионные векторы из условия, чтобы гены были функционально связанными с контролирующими транскрипцию и трансляцию последовательностями. Предполагается, что в этом контексте термин «функционально связанные» означает, что ген антитела лигирован с вектором так, что контролирующие транскрипцию и трансляцию последовательности внутри вектора исполняют предназначенную для них функцию регулирования транскрипции и трансляции гена антитела. Экспрессионный вектор и контролирующие экспрессию последовательности выбирают так, чтобы они были совместимыми с используемой для экспрессии клеткой-хозяином. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть встроены в отдельные векторы, или более типично оба гена встраивают в один и тот же экспрессионный вектор. Гены антитела встраивают в экспрессионный вектор с помощью стандартных способов (например, лигирования по комплементарным рестрикционным сайтам в фрагменте гена антитела и векторе, или лигирования по тупым концам в случае отсутствия рестрикционных сайтов). До встраивания последовательностей легкой или тяжелой цепей D2E7 или родственного D2E7 антитела экспрессионный вектор может уже содержать последовательности константных областей антитела. Например, одним способом превращения последовательностей VH и VL D2E7 или родственного D2E7 антитела в полноразмерные гены антитела является их встраивание в экспрессионные векторы, уже кодирующие константные области тяжелой цепи и легкой цепи, соответственно, из условия, чтобы VH-сегмент был функционально связан с CH-сегментом(ами) в векторе, а VL-сегмент был функционально связан с CL-сегментом в векторе. Дополнительно или альтернативно, рекомбинантный экспрессионный вектор может кодировать сигнальный пептид, который содействует секреции цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела можно клонировать в вектор из условия, чтобы сигнальный пептид был связан в рамке считывания с амино-концом гена цепи антитела. Сигнальным пептидом может быть сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологичный сигнальный пептид (т.е. сигнальный пептид из не являющегося иммуноглобулином белка).

Помимо генов цепей антитела, рекомбинантный экспрессионный вектор настоящего изобретения несет регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепей антитела в клетке-хозяине. Предполагается, что термин «регуляторная последовательность» включает промоторы, энхансеры и другие контролирующие экспрессию элементы (например, сигналы полиаденилирования), которые контролируют транскрипцию или трансляцию генов цепей антитела. Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Квалифицированным в данной области техники специалистам будет понятно, что конструирование экспрессионного вектора, включающее выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, подвергаемой трансформации, желаемый уровень экспрессии белка и т.д. Предпочтительные для экспрессии в клетках млекопитающих-хозяевах регуляторные последовательности включают вирусные элементы, которые ориентируют на высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, происходящие из цитомегаловируса (CMV) (такие как промотор/энхансер CMV), вакуолизирующего обезьяньего вируса 40 (SV40) (такие как промотор/энхансер SV40), аденовируса (например, основной поздний промотор аденовируса (AdMLP)) и полиомы. Ради дополнительного описания вирусных регуляторных элементов и их последовательностей см., например, патент США с № 5168062, выданный Stinski, патент США с № 4510245, выданный Bell и др., и патент США с № 4968615, выданный Schaffner и др.

Помимо генов цепей антитела и регуляторных последовательностей, рекомбинантные экспрессионные векторы, используемые в настоящем изобретении, могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, начала репликации) и гены селектируемых маркеров. Ген селектируемого маркера облегчает отбор клеток-хозяев, в которые был введен вектор (см., например, патенты США с № 4399216, 4634665 и 5179017, все из которых принадлежат Axel и др.). Например, ген селектируемого маркера обычно придает резистентность к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую был введен вектор. Предпочтительные гены селектируемых маркеров включают ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) (в случае использования в dhfr^- клетках-хозяевах с отбором/амплификацией в присутствии метотрексата) и ген neo (для отбора в присутствии G418).

Для экспрессии легкой и тяжелой цепей экспрессионный вектор(ы), кодирующий тяжелую и легкую цепи, трансфецируют в клетку-хозяина с помощью стандартных методов. Предполагается, что различные формы термина «трансфекция» включают широкий выбор методов, обычно используемых для введения экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина, например, электропорацию, преципитацию фосфатом кальция, трансфекцию с использованием DEAE-декстрана и т.п. Хотя теоретически можно экспрессировать антитела настоящего изобретения в либо прокариотических, либо эукариотических клетках-хозяевах, наиболее предпочтительной является экспрессия антител в эукариотических клетках, а еще предпочтительнее - в клетках млекопитающих-хозяевах, поскольку такие эукариотические клетки, и, в частности, клетки млекопитающих, с большей вероятностью, чем прокариотические клетки будут собирать и секретировать правильно свернутое и иммунологически активное антитело. Сообщалось, что экспрессия генов антител в прокариотических клетках является неэффективной для продукции больших количеств активного антитела (Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6: 12-13).

Предпочтительные для экспрессии рекомбинантных антител настоящего изобретения клетки млекопитающих - хозяева включают клетки яичника китайского хомячка (клетки CHO) (в том числе dhfr^- клетки CHO, описанные в Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, используемые вместе с селектируемым маркером DHFR, например, как описано в R.J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621), клетки миеломы NSO, клетки COS и клетки SP2. Когда рекомбинантные экспрессионные векторы, кодирующие гены антитела, вводят в клетки млекопитающих - хозяев, антитела продуцируют посредством культивирования клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для допуска экспрессии антитела в клетках-хозяевах или, предпочтительнее, секреции антитела в культуральную среду, в которой выращивают клетки-хозяева. Антитела можно выделить из культуральной среды, используя стандартные способы очистки белков.

Клетки-хозяева могут также использоваться для продукции частей интактных антител, таких как Fab-фрагменты или молекулы scFv. Понятно, что разновидности вышеприведенного способа находятся в пределах объема настоящего изобретения. Например, желательным может быть трансфецирование клетки-хозяина ДНК, кодирующей либо легкую цепь, либо тяжелую цепь (но не обе цепи) антитела этого изобретения. Технология рекомбинантных ДНК может также использоваться для исключения части или всей ДНК, кодирующей любую из двух или обе легкую и тяжелую цепи, которая не является необходимой для связывания с hTNF-альфа. Антитела настоящего изобретения также включают молекулы, экспрессируемые с таких усеченных молекул ДНК. Кроме того, могут быть продуцированы бифункциональные антитела, в которых одна тяжелая цепь и одна легкая цепь происходят из антитела настоящего изобретения, а остальные тяжелая и легкая цепи являются специфичными для антигена, отличного от hTNF-альфа, посредством сшивания антитела настоящего изобретения со вторым антителом с помощью стандартных химических способов сшивания.

В предпочтительной системе для рекомбинантной экспрессии антитела, или его антигенсвязывающей части, настоящего изобретения рекомбинантный экспрессионный вектор, кодирующий и тяжелую цепь антитела, и легкую цепь антитела, вводят в dhfr^-клетки CHO посредством трансфекции с использованием фосфата кальция. В рекомбинантном экспрессионном векторе как ген тяжелой цепи антитела, так и ген легкой цепи антитела функционально связаны с регуляторными элементами - энхансером CMV/промотором AdMLP для запуска транскрипции генов на высоких уровнях. Рекомбинантный экспрессионный вектор также несет ген DHFR, который делает возможным отбор клеток CHO, которые были трансфецированы вектором, используя отбор/амплификацию в присутствии метотрексата. Отобранные трансформированные клетки-хозяев культивируют для допуска экспрессии тяжелой и легкой цепей антитела, и интактное антитело выделяют из культуральной среды. Для приготовления рекомбинантного экспрессионного вектора, трансфекции клеток-хозяев, отбора трансформантов, культивирования клеток-хозяев и выделения антитела из культуральной среды используют стандартные методы молекулярной биологии.

Ввиду вышеизложенного, композиции нуклеиновых кислот, векторов и клеток-хозяев, которые могут использоваться для рекомбинантной экспрессии антител и частей антител, используемых в настоящем изобретении, включают нуклеиновые кислоты и включающие указанные нуклеиновые кислоты векторы, кодирующие антитело человека против TNF-альфа - адалимумаб (D2E7). Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи D2E7, представлена в SEQ ID NO:36. CDR1-участок LCVR охватывает нуклеотиды 70-102, CDR2-участок охватывает нуклеотиды 148-168, а CDR3-участок охватывает нуклеотиды 265-291. Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи D2E7, представлена в SEQ ID NO:37. CDR1-участок HCVR охватывает нуклеотиды 91-105, CDR2-участок охватывает нуклеотиды 148-198, а CDR3-участок охватывает нуклеотиды 295-330. Квалифицированному специалисту будет понятно, что нуклеотидные последовательности, кодирующие родственные D2E7 антитела, или их части (например, CDR-участок, такой как CDR3-участок), можно получить на основе нуклеотидных последовательностей, кодирующих LCVR и HCVR D2E7, используя генетический код и стандартные методы молекулярной биологии.

В одном варианте осуществления жидкая фармацевтическая композиция включает антитело человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающую часть, которое является биоэквивалентным или биоподобным антителу адалимумабу. В одном варианте осуществления биоподобным антителом является антитело, которое не демонстрируют клинически значимое различие после сравнения с контрольным антителом, например, адалимумабом. Биоподобное антитело характеризуется безопасностью, чистотой и эффективностью, равными таковым контрольного антитела, например, адалимумаба.

IV. Введение композиции настоящего изобретения

Преимущество композиции настоящего изобретения заключается в том, что он может использоваться для подкожной доставки субъекту высокой концентрации антитела человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающей части, (например, адалимумаба). Таким образом, в одном варианте осуществления композиция настоящего изобретения доставляется субъекту подкожно. В одном варианте осуществления субъект вводит композицию самому себе.

В одном варианте осуществления вводят эффективное количество композиции. Выражение «эффективное количество» композиции означает такое количество, которое необходимо или достаточно для ингибирования активности TNF-альфа, например, предупреждения различных морфологических и соматических признаков состояния, связанного с вредной активностью TNF-альфа. В другом варианте осуществления эффективным количеством композиции является количество, необходимое для достижения желаемого результата.

Примером эффективного количества композиции является количество, достаточное для ингибирования вредной активности TNF-альфа или лечения нарушения, в случае которого активность TNF-альфа является вредной. Предполагается, что используемый здесь термин «нарушение, в случае которого активность TNF-альфа является вредной», включает заболевания и другие нарушения, в случае которых присутствие TNF-альфа у страдающего нарушением субъекта, как установлено или как полагают, является либо ответственным за патофизиологию нарушения, либо фактором, вносящим вклад в ухудшение нарушения. Соответственно, нарушением, в случае которого активность TNF-альфа является вредной, является нарушение, в случае которого ожидают, что ингибирование активности TNF-альфа приведет к ослаблению симптомов и/или уменьшению прогрессирования нарушения. Доказательством таких нарушений может служить, например, увеличение концентрации TNF-альфа в биологической жидкости субъекта, страдающего нарушением, (например, увеличение концентрации TNF-альфа в сыворотке, плазме, синовиальной жидкости и т.д. субъекта), которое можно детектировать, используя, например, антитело против TNF-альфа.

Как описано в приводимых ниже примерах, одно преимущество композиций настоящего изобретения заключается в возможности приготовления композиций, включающих антитело в высоких концентрациях, без увеличения вязкости композиции. Следовательно, как к тому же описано ниже, новые композиции позволяют вводить большие количества (например, эффективные количества) антитела в меньших объемах по сравнению с прежними коммерческими композициями, что приводит, тем самым, к уменьшению боли.

В одном варианте осуществления эффективное количество антитела может устанавливаться в соответствии со схемой введения доз строго на основе веса тела (например, мг/кг) или может быть дозой на все тело (также называемой заданной дозой), которая не зависит от веса. В одном примере эффективное количество композиции составляет 0,8 мл композиции, в которых содержится доза на все тело, составляющая приблизительно 80 мг антитела (т.е. 0,8 мл композиции настоящего изобретения с концентрацией 100 мг/мл антитела). В другом примере эффективное количество композиции составляет 0,4 мл композиции настоящего изобретения, в которых содержится доза на все тело, составляющая приблизительно 40 мг антитела (т.е. 0,4 мл композиции настоящего изобретения с концентрацией 100 мг/мл антитела). В еще одном примере эффективное количество композиции составляет два раза по 0,8 мл композиции, содержащие дозу на все тело, составляющую приблизительно 160 мг антитела (т.е. две единицы, содержащие 0,8 мл каждая композиции настоящего изобретения с концентрацией 100 мг/мл антитела). В дальнейшем примере эффективное количество композиции составляет 0,2 мл композиции настоящего изобретения, в которых содержится доза на все тело, составляющая приблизительно 20 мг антитела (т.е. 0,2 мл композиции настоящего изобретения с концентрацией 100 мг/мл антитела). Альтернативно, эффективное количество может устанавливаться в соответствии со схемой введения доз, заданных на основе веса тела (см., например, заявку WO 2008/154543, включенную сюда посредством ссылки).

Настоящим изобретением обеспечивается стабильная композиция с высокой концентрацией белка с удлиненным сроком хранения, которая, в одном варианте осуществления, используется для ингибирования активности TNF-альфа у субъекта, страдающего нарушением, в случае которого активность TNF-альфа является вредной, включающего введение субъекту композиции настоящего изобретения, так что активность TNF-альфа у субъекта ингибируется. Предпочтительно TNF-альфа является TNF-альфа человека, а субъектом является являющийся человеком субъект. Альтернативно, субъектом может быть млекопитающее, экспрессирующее TNF-альфа, с которым антитело настоящего изобретения дает перекрестную реакцию. Более того, субъектом может быть млекопитающее, которому был введен hTNF-альфа (например, посредством введения hTNF-альфа или посредством экспрессии трансгена hTNF-альфа).

Композиция настоящего изобретения может вводиться являющемуся человеком субъекту с терапевтической целью (обсуждаемой далее ниже). В одном варианте осуществления настоящего изобретения легко вводимой является жидкая фармацевтическая композиция, которая включает, например, композицию, которую вводит сам пациент. В предпочтительном варианте осуществления композицию настоящего изобретения, предпочтительно однократного применения, вводят благодаря подкожной инъекции. Более того, композицию настоящего изобретения может вводиться не являющемуся человеком млекопитающему, экспрессирующему TNF-альфа, с которым антитело дает перекрестную реакцию, (например, примату, свинье или мыши) с целью ветеринарной помощи или при использовании в качестве модели заболевания человека на животном. Что касается таких моделей на животных, они могут быть полезны для оценки терапевтической эффективности антител настоящего изобретения (например, проверки доз и динамики введения).

В одном варианте осуществления жидкая фармацевтическая композиция настоящего изобретения может вводиться субъекту через посредство использования предварительно наполненного шприца, ручки-автоинъектора или безыгольного устройства для введения. Таким образом, особенностью настоящего изобретения также является ручка-автоинъектор, предварительно наполненный шприц или безыгольное устройство для введения, включающая(ий) жидкую фармацевтическую композицию настоящего изобретения. В одном варианте осуществления особенностью настоящего изобретения является устройство для доставки, включающее дозу композиции, включающей 100 мг/мл антитела человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающей части, например, ручка-автоинъектор или предварительно наполненный шприц включает дозу, составляющую приблизительно 19 мг, 20 мг, 21 мг, 22 мг, 23 мг, 24 мг, 25 мг, 26 мг, 27 мг, 28 мг, 29 мг, 30 мг, 31 мг, 32 мг, 33 мг, 34 мг, 35 мг, 36 мг, 37 мг, 38 мг, 39 мг, 40 мг, 41 мг, 42 мг, 43 мг, 44 мг, 45 мг, 46 мг, 47 мг, 48 мг, 49 мг, 50 мг, 51 мг, 52 мг, 53 мг, 54 мг, 55 мг, 56 мг, 57 мг, 58 мг, 59 мг, 60 мг, 61 мг, 62 мг, 63 мг, 64 мг, 65 мг, 66 мг, 67 мг, 68 мг, 69 мг, 70 мг, 71 мг, 72 мг, 73 мг, 74 мг, 75 мг, 76 мг, 77 мг, 78 мг, 79 мг, 80 мг, 81 мг, 82 мг, 83 мг, 84 мг, 85 мг, 86 мг, 87 мг, 88 мг, 89 мг, 90 мг, 91 мг, 92 мг, 93 мг, 94 мг, 95 мг, 96 мг, 97 мг, 98 мг, 99 мг, 100 мг, 101 мг, 102 мг, 103 мг, 104 мг, 105 мг и т.д. композиции.

Предпочтительно, когда композицию настоящего изобретения используют для лечения нарушений, в случае которых активность TNF-альфа является вредной. Предполагается, что используемый здесь термин «нарушение, в случае которого активность TNF-альфа является вредной», включает заболевания и другие нарушения, в случае которых присутствие TNF-альфа у страдающего нарушением субъекта, как установлено или как полагают, является либо ответственным за патофизиологию нарушения, либо фактором, вносящим вклад в ухудшение нарушения. Соответственно, нарушением, в случае которого активность TNF-альфа является вредной, является нарушение, в случае которого ожидают, что ингибирование активности TNF-альфа приведет к ослаблению симптомов и/или уменьшению прогрессирования нарушения. Доказательством таких нарушений может служить, например, увеличение концентрации TNF-альфа в биологической жидкости субъекта, страдающего нарушением, (например, увеличение концентрации TNF-альфа в сыворотке, плазме, синовиальной жидкости и т.д. субъекта), которое можно детектировать, используя, например, антитело против TNF-альфа, описанное выше.

Существуют многочисленные примеры нарушений, в случае которых активность TNF-альфа является вредной. Примеры нарушений, в случае которых активность TNF-альфа является вредной, также приведены в патентах США с №№ 6015557, 6177077, 6379666, 6419934, 6419944, 6423321, 6428787 и 6537549 и публикациях PCT-заявок с № WO 00/50079 и WO 01/49321, полное содержание каждого(й) из которых включено сюда посредством ссылки. Композиции настоящего изобретения могут также применяться для лечения нарушений, в случае которых активность TNF-альфа является вредной, описанных в патентах США с № 6090382 и 6258562 и публикации заявки на патент США с № US20040126372, полное содержание каждого(й) из которых включено сюда посредством ссылки.

Применение композиций настоящего изобретения при лечении конкретных, приводимых в качестве примеров нарушений обсуждается далее ниже.

A. Сепсис

Фактор некроза опухолей играет доказанную роль в патофизиологии сепсиса, при этом его биологические эффекты включают гипотонию, ослабление сердечной мышцы, синдром пропотевания жидкости через сосуды, некроз органов, стимуляцию выброса токсичных вторичных медиаторов и активацию каскада реакций свертывания крови (см., например, Tracey, K. J. and Cerami, A. (1994) Annu. Rev. Med. 45: 491-503; Russell, D and Thompson, R. C. (1993) Curr. Opin. Biotech. 4: 714-721). Соответственно, композиция настоящего изобретения может использоваться для лечения сепсиса в любой из клинических ситуаций, включающих септический шок, эндотоксический шок, сепсис, вызванный грамотрицательными бактериями, и синдром токсического шока.

Кроме того, для лечения сепсиса композиция настоящего изобретения может вводиться совместно с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, которые могут дополнительно ослаблять сепсис, такими как ингибитор интерлейкина-1 (такой как ингибиторы, описанные в публикациях PCT-заявок с № WO 92/16221 и WO 92/17583), цитокином интерлейкином-6 (см., например, публикацию PCT-заявки с № WO 93/11793) или антагонистом фактора активации тромбоцитов (см., например, публикацию заявки на Европейский патент с № EP 374510).

Кроме того, в предпочтительном варианте осуществления, композицию настоящего изобретения вводят являющемуся человеком субъекту в подгруппе пациентов с сепсисом, имеющих концентрацию IL-6 в сыворотке или плазме, превышающую 500 пг/мл, а более предпочтительно 1000 пг/мл, в момент лечения (см. публикацию PCT-заявки с № WO 95/20978).

B. Аутоиммунные заболевания

Было установлено, что фактор некроза опухолей вовлечен в принятие участия в патофизиологии ряда аутоиммунных заболеваний. Например, была установлена вовлеченность TNF-альфа в активацию воспаления тканей и вызов разрушения суставов при ревматоидном артрите (см., например, Tracey and Cerami, выше; Arend, W. P. and Dayer, J-M. (1995) Arth. Rheum. 38: 151-160; Fava, R. A., et al. (1993) Clin. Exp. Immunol. 94: 261-266). Было также установлено, что TNF-альфа вовлечен в ускорение гибели клеток островков и в опосредование резистентности к инсулину при сахарном диабете (см., например, Tracey and Cerami, выше; публикацию PCT-заявки с № WO 94/08609). Было также установлено, что TNF-альфа вовлечен в опосредование цитотоксичности в отношение олигодендроцитов и индукцию являющихся результатом воспалительной демиелинизации бляшек при рассеянном склерозе (см., например, Tracey and Cerami, выше). В аутоиммунные заболевания, которые можно лечить с использованием композиции настоящего изобретения, также включен ювенильный идиопатический артрит (JIA) (также называемый ювенильным ревматоидным артритом) (см. Grom et al. (1996) Arthritis Rheum. 39: 1703; Mangge et al. (1995) Arthritis Rheum. 8: 211).

Композиция настоящего изобретения может использоваться для лечения аутоиммунных заболеваний, в частности, тех, которые связаны с воспалением, включающих ревматоидный артрит, ревматоидный спондилит (также называемый анкилозирующим спондилитом), остеоартрит и подагрический артрит, аллергию, рассеянный склероз, аутоиммунный диабет, аутоиммунный увеит, ювенильный идиопатический артрит (также называемый ювенильным ревматоидным артритом) и нефротический синдром.

C. Инфекционные заболевания

Было установлено, что фактор некроза опухолей вовлечен в опосредование биологических эффектов, наблюдаемых при ряде инфекционных заболеваний. Например, была установлена вовлеченность TNF-альфа в опосредование воспаления головного мозга и тромбоза капилляров, и инфаркта вследствие закупорки капилляров при малярии (см., например, Tracey and Cerami, выше). Было также установлено, что TNF-альфа вовлечен в опосредование воспаления головного мозга, вызов разрушения гематоэнцефалического барьера, инициирование синдрома септического шока и активацию инфаркта вследствие закупорки вены при менингите (см., например, Tracey and Cerami, выше). Было также установлено, что TNF-альфа вовлечен в индукцию кахексии, стимуляцию пролиферации вирусов и опосредование повреждения центральной нервной системы при синдроме приобретенного иммунодефицита (СПИД) (см., например, Tracey and Cerami, выше). Соответственно, антитела, или части антител, настоящего изобретения могут использоваться при лечении инфекционных заболеваний, включающих бактериальный менингит (см., например, публикацию заявки на Европейский патент с № EP 585705), церебральную форму малярии, СПИД и СПИД-ассоциированный комплекс (ARC) (см., например, публикацию заявки на Европейский патент с № EP 230574), а также цитомегаловирусной инфекции на фоне трансплантации (см., например, Fietze, E., et al. (1994) Transplantation 58: 675-680). Композиция настоящего изобретения может также использоваться для ослабления симптомов, сопровождающих инфекционные заболевания, включающих лихорадку и миалгии вследствие инфекции (такой как грипп) и кахексии на фоне инфекции (например, на фоне СПИД или СПИД-ассоциированного комплекса).

D. Трансплантация

Было установлено, что фактор некроза опухолей является ключевым медиатором отторжения аллотрансплантатов и реакции «трансплантат против хозяина» (GVHD) и вовлечен в опосредование неблагоприятной реакции, которая наблюдалась, когда крысиное антитело OKT3, направленное против T-клеточного рецепторного CD3-комплекса, использовалось для ингибирования отторжения почечных трансплантатов (см., например, Tracey and Cerami, выше; Eason, J. D., et al. (1995) Transplantation 59: 300-305; Suthanthiran, M. and Strom, T. B. (1994) New Engl. J. Med. 331: 365-375). Соответственно, композиции настоящего изобретения могут использоваться для ингибирования отторжения трансплантатов, в том числе отторжений аллотрансплантатов и ксенотрансплантатов, и для ингибирования GVHD. Хотя антитело или часть антитела могут использоваться отдельно, оно может использоваться в комбинации с одним или несколькими другими агентами, которые ингибируют иммунную реакцию против аллотрансплантата или ингибируют GVHD. Например, в одном варианте осуществления, композиции настоящего изобретения используются в комбинации с OKT3 для ингибирования индуцируемых OKT3 реакций. В другом варианте осуществления композиция настоящего изобретения используется в комбинации с одним или несколькими антителами, направленными на другие мишени, вовлеченные в регуляцию иммунных реакций, такие как молекулы клеточной поверхности CD25 (рецептор-альфа интерлейкина-2), CD11a (LFA-1), CD54 (ICAM-I), CD4, CD45, CD28/CTLA4, CD80 (B7-1) и/или CD86 (B7-2). В еще одном варианте осуществления композиция настоящего изобретения используется в комбинации с одним или несколькими общими иммуносупрессивными средствами, такими как циклоспорин A или FK506.

E. Злокачественная опухоль

Было установлено, что фактор некроза опухолей вовлечен в индукцию кахексии, стимуляцию роста опухолей, увеличение способности к метастазированию и опосредование цитотоксичности при злокачественных развитиях (см., например, Tracey and Cerami, выше). Соответственно, композиции настоящего изобретения могут использоваться при лечении злокачественных опухолей, для подавления роста или метастазирования опухолей и/или уменьшения кахексии на фоне злокачественной опухоли.

F. Заболевания легких

Было установлено, что фактор некроза опухолей вовлечен в патофизиологию синдрома острой дыхательной недостаточности у взрослых, в том числе стимулируемую лейкоцитами активацию эндотелиальных клеток, направление цитотоксичности на пневмоциты и индукцию синдрома пропотевания жидкости через сосуды (см., например, Tracey and Cerami, выше). Соответственно, композиции настоящего изобретения могут использоваться для лечения различных заболеваний легких, включающих синдром острой дыхательной недостаточности у взрослых (см., например, публикацию PCT-заявки с № WO 91/04054), инфаркт легкого, хроническое воспалительное заболевание легких, саркоидоз легких, фиброз легких и силикоз.

G. Заболевания кишечника

Было установлено, что фактор некроза опухолей вовлечен в патофизиологию воспалительных заболеваний кишечника (см., например, Tracy, K. J., et al. (1986) Science 234: 470-474; Sun, X-M., et al. (1988) J. Clin. Invest. 81: 1328-1331; MacDonald, T. T., et al. (1990) Clin. Exp. Immunol. 81: 301-305). Химерные мышиные антитела против hTNF-альфа были подвергнуты клиническому испытанию на излечение болезни Крона (van Dullemen, H. M., et al. (1995) Gastroenterology 109: 129-135). Композиция настоящего изобретения также может использоваться для лечения заболеваний кишечника, таких как идиопатическое воспалительное заболевание кишечника, которое включает два синдрома: болезнь Крона и неспецифический язвенный колит.

H. Заболевания сердца

Композиция настоящего изобретения также может использоваться для лечения различных заболеваний сердца, включающих ишемическую болезнь сердца (см., например, публикацию заявки на Европейский патент с № EP 453898) и сердечную недостаточность (слабость сердечной мышцы) (см., например, публикацию PCT-заявки с № WO 94/20139).

I. Спондилоартропатии

Было установлено, что TNFα вовлечен в патофизиологию широкого ряда заболеваний, включающих воспалительные заболевания, такие как спондилоартропатии (см., например, Moeller, A., et al. (1990) Cytokine 2: 162-169; патент США с № 5231024, выданный Moeller и др.; публикацию Европейского патента с № 260610 B1, выданного Moeller, A). Пример спондилоартропатии, который можно лечить композицией настоящего изобретения, включает псориатический артрит. Было установлено, что фактор некроза опухолей вовлечен в патофизиологию псориатического артрита (Partsch et al. (1998) Ann. Rheum. Dis. 57: 691; Ritchlin et al. (1998) J. Rheumatol. 25: 1544).

J. Заболевания кожи и ногтей

В одном варианте осуществления композиция настоящего изобретения используется для лечения заболеваний кожи и ногтей. Предполагается, что используемый здесь термин «заболевание кожи и ногтей, в случае которого активность TNFα является вредной», включает заболевания кожи и/или ногтей и другие заболевания, в случае которых присутствие TNF-альфа у страдающего заболеванием субъекта, как установлено или как полагают, является либо ответственным за патофизиологию заболевания, либо фактором, вносящим вклад в ухудшение заболевания, например, псориаза. Примером заболевания кожи, которое можно лечить, используя композицию настоящего изобретения, является псориаз. В одном варианте осуществления композиция настоящего изобретения может использоваться для лечения бляшковидного псориаза. Было установлено, что фактор некроза опухолей вовлечен в патофизиологию псориаза (Takematsu et al. (1989) Arch. Dermatol. Res. 281: 398; Victor and Gottlieb (2002) J. Drugs Dermatol. 1(3): 264).

В одном варианте осуществления композиция настоящего изобретения используется для лечения ревматоидного артрита, псориатического артрита или анкилозирующего спондилита. Композиция настоящего изобретения, включающий выделенное антитело человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающую часть, (например, адалимумаб), может вводиться являющемуся человеком субъекту в соответствии со схемой введения доз и дозировкой, эффективной для лечения ревматоидного артрита, псориатического артрита или анкилозирующего спондилита. В одном варианте осуществления дозу, составляющую приблизительно 40 мг антитела человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающей части, (например, адалимумаба) (например, 0,4 мл 100 мг/мл композиции настоящего изобретения) в композиции настоящего изобретения, вводят являющемуся человеком субъекту через неделю для лечения ревматоидного артрита, псориатического артрита или анкилозирующего спондилита. В одном варианте осуществления композицию вводят подкожно, через неделю (один раз в две недели, см. способы введения, описанные в заявке US20030235585, включенной сюда посредством ссылки) для лечения ревматоидного артрита, псориатического артрита или анкилозирующего спондилита.

В одном варианте осуществления композиция настоящего изобретения используется для лечения болезни Крона. Композиция настоящего изобретения, включающая выделенное антитело человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающую часть, (например, адалимумаб), может вводиться являющемуся человеком субъекту в соответствии со схемой введения доз и дозировкой, эффективной для лечения болезни Крона. В одном варианте осуществления сначала примерно в день 1 являющемуся человеком субъекту вводят дозу, составляющую приблизительно 160 мг антитела человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающей части, (например, адалимумаба) (например, 1,6 мл 100 мг/мл композиции настоящего изобретения) в композиции настоящего изобретения, а затем спустя две недели последующую дозу, составляющую приблизительно 80 мг антитела (например, 0,8 мл 100 мг/мл композиции настоящего изобретения), с последующим введением приблизительно 40 мг (например, 0,4 мл 100 мг/мл композиции настоящего изобретения) раз в две недели для лечения болезни Крона. В одном варианте осуществления композицию вводят подкожно, в соответствии со схемой многократного введения переменных доз, включающей индукционную дозу(ы) и поддерживающую дозу(ы) (см., например, публикации заявок на патенты США с № US20060009385 и US20090317399, каждая из которых включена сюда посредством ссылки), для лечения болезни Крона.

В одном варианте осуществления композиция настоящего изобретения используется для лечения псориаза. Композиция настоящего изобретения, включающая выделенное антитело человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающую часть, (например, адалимумаб), может вводиться являющемуся человеком субъекту в соответствии со схемой введения доз и дозировкой, эффективной для лечения псориаза. В одном варианте осуществления являющемуся человеком субъекту вводят первоначальную дозу, составляющую приблизительно 80 мг антитела человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающей части, (например, адалимумаба) (например, 0,8 мл 100 мг/мл композиции настоящего изобретения) в композиции настоящего изобретения, а затем спустя неделю после введения первоначальной дозы последующую дозу, составляющую приблизительно 40 мг антитела (например, 0,4 мл 100 мг/мл композиции настоящего изобретения), каждые две недели. В одном варианте осуществления композицию вводят подкожно, в соответствии со схемой многократного введения переменных доз, включающей индукционную дозу(ы) и поддерживающую дозу(ы) (см., например, публикации заявок на патенты США с № US 20060009385 и WO 2007/120823, каждая из которых включена сюда посредством ссылки), для лечения псориаза.

В одном варианте осуществления композиция настоящего изобретения используется для лечения ювенильного идиопатического артрита (JIA). Композиция настоящего изобретения, включающая выделенное антитело человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающую часть, (например, адалимумаб), может вводиться являющемуся человеком субъекту в соответствии со схемой введения доз и дозировкой, эффективной для лечения JIA. В одном варианте осуществления 20 мг антитела человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающей части, в композиции настоящего изобретения (например, 0,2 мл 100 мг/мл композиции настоящего изобретения) вводят субъекту, имеющему вес от 15 кг (приблизительно 33 фунтов) до менее 30 кг (66 фунтов), каждые две недели для лечения JIA. В другом варианте осуществления 40 мг антитела человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающей части, в композиции настоящего изобретения (например, 0,4 мл 100 мг/мл композиции настоящего изобретения) вводят субъекту, имеющему вес, превышающий или равный 30 кг (66 фунтов), каждые две недели для лечения JIA. В одном варианте осуществления композицию вводят подкожно, в соответствии с заданной на основе веса тела дозировкой (см., например, публикацию заявки на патент США с № 20090271164, включенную сюда посредством ссылки) для лечения JIA.

В одном варианте осуществления выделенное антитело человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающая часть, (например, адалимумаб), может вводиться являющемуся человеком субъекту для лечения нарушения, связанного с вредной активностью TNFα, в соответствии со схемой введения доз раз месяц, в силу чего антитело вводится каждый месяц или раз в четыре недели. Как описано выше, примеры нарушений, которые можно лечить в соответствии со схемой введения доз раз месяц, включают, но без ограничения, ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилит, JIA, псориаз, болезнь Крона или псориатический артрит. Таким образом, композиция настоящего изобретения, включающая выделенное антитело человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающую часть, (например, адалимумаб), может вводиться являющемуся человеком субъекту для лечения нарушения, связанного с вредной активностью TNFα, в соответствии со схемой введения доз раз месяц. В одном варианте осуществления 80 мг антитела человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающей части, в композиции настоящего изобретения (например, 0,8 мл 100 мг/мл композиции настоящего изобретения) вводят субъекту, имеющему нарушение, связанное с вредной активностью TNFα.

Описываемые здесь дозировки могут доставляться в виде однократной дозы (например, однократной дозы, составляющей 40 мг в 0,4 ил или 80 мг в 0,8 мл), или в альтернативном случае они могут доставляться в виде многократных доз (например, четырех доз по 40 мг каждая или двух доз по 80 мг каждая для доставки составляющей 160 мг дозы).

Композиция настоящего изобретения, включающая выделенное антитело человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающую часть, (например, адалимумаб), может также вводиться субъекту в комбинации с дополнительным терапевтическим средством. В одном варианте осуществления композицию вводят являющемуся человеком субъекту для лечения ревматоидного артрита в комбинации с метотрексатом или другими базисными противоревматическими препаратами, модифицирующими течение болезни (DMARD). В другом варианте осуществления композицию вводят являющемуся человеком субъекту для лечения JIA в комбинации с метотрексатом или другими базисными противоревматическими препаратами, модифицирующими течение болезни (DMARD). Дополнительные комбинированные терапии описаны в патентах США с № 6258562 и 7541031 и публикации заявки на патент с № US20040126372, полные содержания всех из которых включены сюда посредством ссылки.

Композиция настоящего изобретения, включающая выделенное антитело человека против TNF-альфа, или его антигенсвязывающую часть, может также использоваться для лечения субъекта, в случае которого предшествующее лечение ингибитором TNF не было успешным, например, субъекта, у которого утрачена ответная реакция на инфликсимаб, или субъекта с непереносимость инфликсимаба.

Настоящее изобретение далее проиллюстрировано в следующих примерах, которые не должны рассматриваться как дополнительное ограничение.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Увеличение стабильности жидкой фармацевтической композиции антитела человека против TNF-альфа

В этом примере представлены результаты экспериментов, нацеленных на увеличение стабильности фармацевтической композиции антитела адалимумаба.

Материалы и методы

Адалимумаб (подкласс G₁, приблизительно 47 кДа) был составлен в модифицированную фармацевтическую композицию для создания жидкой лекарственной формы для парентерального введения в составляющей 50 мг/мл конечной концентрации лекарственного средства. В результате предшествующих экспериментов по составлению рецептур было установлено, что фосфатная/цитратная буферная система лучше других буферных систем в плане стабилизации белка адалимумаба. Как следствие, задача увеличения стабильности была решена через посредство добавления наполнителей в случае жидкой лекарственной формы с концентрацией 50 мг/мл. Все использованные наполнители были наполнителями высшей степени чистоты (степени чистоты «для анализа») и приобретены у Merck KGaA, Darmstadt, Германия. Маннит поставлялся Mallinckrodt Baker B. V., Deventer, Голландия.

Анализ твердых частиц видимого диапазона проводился в соответствии с инструкцией Европейской Фармакопеи 2002 (§ 2.9.20 Contamination with particulate matter - visible particles). Твердые частицы довидимого диапазона определяли методом светотени (SVSS-C⁴⁰, PAMAS GmbH, Rutesheim, Германия). Колонку Superose TM6 10/30 (Amersham Pharmacia Europe GmbH, Freiburg, Германия) использовали для анализа (оценки доли мономеров белка) с помощью SE-HPLC, в случае которой применяли скорость потока 0,5 мл/мин буфера PBS с pH 7,5 и которую сочетали со спектрофотомерией при УФ₂₈₀, определением показателя преломления и MALS для определения в режиме реального времени. Анализ каждого образца выполняли по крайней мере в трех повторах. За исключение случаев, указанных особо, в случаях всех данных, полученных с помощью SE-HPLC, значение S_rel было меньше 0,13, а в случае данных, полученных методом светотени, - меньше 2,3.

Отдельные белковые композиции готовили с помощью разбавления концентратов адалимумаба (~70 мг/мл) матричными растворами наполнителей. Матричный раствор с составляющей 70 мг/мл концентрацией адалимумаба готовили, используя смесь компонентов цитратного и фосфатного буфера (т.е. лимонную кислоту * H₂O, дигидрат цитрата натрия, Na₂HPO4 * 2 H₂O, NaH₂PO₄ * 2 H₂O), перечисленных в таблице 16.

Матричные растворы наполнителей создавали посредством растворения наполнителей в фосфатной/цитратной буферной среде, используя смесь компонентов цитратного и фосфатного буфера (т.е. лимонную кислоту * H₂O, дигидрат цитрата натрия, Na₂HPO4 * 2 H₂O, NaH₂PO₄ * 2 H₂O), перечисленных в таблице 16. До стерилизации фильтрованием (0,2 мкм, Minisart®, Sartorius AG, Goettingen, Германия) осуществляли доведение pH с помощью добавления кислотного/основного типа буферных компонентов. Все композиции готовили в по крайней мере двух повторах и создавали через посредство конечной фильтрации для стерилизации партий растворов в стерилизованные с помощью термообработки (180°C, 25 мин) 2R стеклянные флаконы (Schott Glas, Mainz, Германия) в стерильных условиях приграничного потока воздуха. Крышки из бутилкаучука с тефлоновым покрытием стерилизовали с помощью влажного жара (121°C) в соответствии с Европейской Фармакопеей до применения.

Различные композиции были подвергнуты краткосрочному хранению в течение 3 месяцев при трех различных температурах (5°C, 25°C, 40°C).

Концентраты адалимумаба были обеспечены путем диафильтрации нерасфасованного раствора адалимумаба с помощью аппаратов Vivaflow 50 (с отсечением по молекулярной массе 50 кДа, Vivascience G, Hannover, Германия), используя фосфатную/цитратную буферную среду для буферного обмена. Современные способы концентрирования и буферного обмена биофармацевтических растворов основаны на IEX, SE-HPLC, ультра-/диафильтрации и тангенциальной поточной фильтрации (Christy et al. (2002) Desalination, 144: 133-136). Диафильтрацию использовали, поскольку очистка, концентрирование и буферный обмен возможны при эксплуатации одного аппарата с использованием переменной гидродинамики, минимизируя, таким образом, белковое напряжение (таблица 1).

Таблица 1 Зависимость потери белка от числа циклов диафильтрации
Число циклов диафильтрации	Концентрация белка (мг/мл)
1	72,81
2	72,7
3	72,51
4	72,34
5	72,02
6	71,79
7	71,53
8	71,25
9	71
10	70,67

Каждый выполненный цикл служил причиной потери белка, составляющей ~0,25% от общего белка. Как правило, потеря белка не превышала 7% в ходе продукции концентрата.

На протяжении одного цикла диафильтрации концентрация белка удваивалась и вновь уменьшалась до исходной концентрации в результате разбавления, за исключением конечной стадии концентрирования. Следовательно, нежелательные растворенные вещества, присутствие которых не предполагается, могут быть эффективно удалены (например, составляющая 1,00% концентрация может быть уменьшена до 0,00098% за десять циклов диафильтрации). После очистки и концентрирования концентраты адалимумаба были подвергнуты центрифугированию (5°C, 3000 g, 20 минут).

Определение оптимального значения pH

Для определения оптимального pH раствора (т.е. pH 5,2 или pH 6,0) были исследованы две различных композиции адалимумаба, отличающиеся только по pH. Данные по стабильности композиций, содержащих 1 мг/мл Tween 80, проиллюстрированы в таблицах 2A и 2B.

Таблица 2A Влияние pH композиции на долю мономеров во время хранения при 40°C
Время хранения (недели)	Доля (%) мономеров при pH 5,2	Доля (%) мономеров при pH 6,0
0	98,9	98,86
1	98,59	98,19
4	97,54	97,01
12	95,53	95,53

Таблица 2B Влияние pH композиции на образование твердых частиц довидимого диапазона во время хранения
Температура хранения (°C)	Содержание частиц довидимого диапазона >1 мкм/мл при pH 5,2;	Содержание частиц довидимого диапазона >1 мкм/мл при pH 6,0
5	3564	179329
25	2547	50898
40	1532	36556

Что касается доли мономеров, установлено, что ни один pH лучше другого, поскольку обе композиции продемонстрировали сопоставимые потери мономеров при хранении при 40°C. Данные, полученные в условиях хранения при 25°C, были схожи с данными, полученными при 40°C, тогда как при 5°C все белковые растворы, проанализированные в ходе этого исследования, подверглись незначительным изменениям доли мономеров.

Однако были установлены различия в мутности. Составляющий 6,0 рН раствора приводил к образованию твердых частиц довидимого диапазона во время хранения в течение 12, независимо от температуры хранения. Поскольку существует связь интенсивности образования твердых частиц довидимого диапазона с более низкими температурами, происхождение частиц, как предполагается, не является белковым. В этой связи, если бы сильное образование твердых частиц было обусловлено только нестабильностью белка, существовала бы его связь с подверганием воздействию повышенных температур во время исследований стойкости при хранении (Constantino, et al. (1994b) J. Pharm. Sci. 83: 1662-1669).

Что касается композиции с составляющей 50 мг/мл концентрацией адалимумаба, содержащей 6,16 мг/мл NaCl вместо Tween 80, добавление соли приводило к образованию частиц довидимого диапазона, поскольку количество частиц размером, превышающим 1 мкм, увеличивалось в схожей степени в обоих растворах (см. таблицы 3A и 3B). Кроме того, спустя 12 недель полученные с помощью SE-HPLC данные показали, что растворы при pH 6,0 имеют большую долю мономеров, чем растворы при pH 5,2, хотя различия были минимальными (~0,3%), и не подкреплялись результатами, полученными при 25°C.

Таблица 3A Влияние pH на долю мономеров во время хранения при 40οC
Время хранения (недели)	Доля (%) мономеров при pH 5,2	Доля (%) мономеров при pH 6,0
0	98,9	98,7
1	98,59	98,11
4	97,46	96,97
12	95,29	95,22

Таблица 3B Влияние pH на образование твердых частиц довидимого диапазона (В) во время хранения
Температура хранения (°C)	Содержание частиц довидимого диапазона >1 мкм/мл при pH 5,2;	Содержание частиц довидимого диапазона >1 мкм/мл при pH 6,0
5	127707	241222
25	17760	80404
40	91356	180084

Как представлялось, образованию частиц способствовало добавление NaCl и хранение при pH 6,0, и оно уменьшалось с помощью добавления Tween 80 и при использовании pH раствора, составляющего 5,2. Поэтому Tween 80 был намечен в качестве ингредиента, который может уменьшить примесь частиц в растворах, содержащих соли, такие как NaCl (таблицы 4A и 4B). Затем были исследованы растворы, которые содержали как 6,16 мг/мл NaCl, так и 1 мг/мл Tween 80.

Таблица 4A Влияние pH на долю мономеров во время хранения
Время хранения (недели)	Доля (%) мономеров при pH 5,2	Доля (%) мономеров при pH 6,0
0	98,9	98,7
1	98,59	98,11
4	97,46	96,97
12	95,29	95,22

Таблица 4B Влияние pH на образование твердых частиц довидимого диапазона во время хранения при 40°С
Температура хранения (°C)	Содержание частиц довидимого диапазона >1 мкм/мл при pH 5,2;	Содержание частиц довидимого диапазона >1 мкм/мл при pH 6,0
5	152196	365213
25	61622	141182
40	111053	249876

Как показано в таблице 4B, в случае композиций, включающих соль и поверхностно-активное вещество, добавление поверхностно-активного вещества не оказывало влияние в части образования частиц довидимого диапазона, поскольку частицы довидимого диапазона выявлялись несмотря на добавление Tween 80. Интересно, что во всех образцах количества частиц были максимальными при самой низкой температуре хранения (5°C), что означает, что происхождение частиц, возможно, связано с неорганическим материалом. Кроме того, в результате визуального исследования растворов, содержащих соль, выявлено легкая мутность после хранения в течение 4 недель, независимо от температуры хранения. Преципитация неорганических компонентов видимого диапазона может быть результатом хранения при холодной температуре, даже в случае временного хранения, например, натрийфосфатные буферы могут дать относительно нерастворимый Na₂HPO₄* 12H₂O при 4°C (Borchert et al. (1986) PDA J. Pharm. Sci. Technol, 40: 212-241). Однако, в плане твердых частиц, являющихся оценочным показателем, pH раствора, составляющий 5,2, имел преимущества над pH 6,0 в случае исследованных растворов.

Однако, что касается доли мономеров, оба значения pH растворов приводили к равным долям мономеров во время хранения, и в случае NaCl-содержащих композиций (без Tween 80) при pH 6,0 выявлена, как представлялось, даже слегка большая стабильность. Несмотря на эти схожие кривые мономеров, является общепризнанным, что при значениях pH в сторону нейтральных или даже основных условий белки подвержены более широкому ряду возможных механизмов деградации (Wang (1999) Int. J. Pharm., 185: 129-188), например, более высокие значения pH способствуют реакциям недиссоциированных амидов в белках с образованием карбонильной группы-аминогруппы, (катализируемым основаниями) β-элиминациям и дезамидированиям способствуют, а также различным окислительным реакциям (Akers and DeFelippis, Peptides and proteins as parenteral solutions, in Pharmaceutical formulation development of peptides and proteins, ed. by Frokjaer, S; Hovgaard, L. (2000) 145-177). Следовательно, в заключение, pH раствора, составляющий 5,2, считался лучше значения 6,0 в плане длительной стабильности адалимумаба в концентрации 50 мг/мл.

Стабилизация с помощью наполнителей: поверхностно-активных веществ

Для определения способности поверхностно-активных веществ к стабилизации композиции с концентрацией 50 мг/мл адалимумаба к белковому раствору, содержащему 6,16 мг/мл NaCl, добавляли различные количества Tween 80 (0%, 0,03%, 0,1%). Обычно считается, что Tween 80 стабилизирует белки, например, при связывании благодаря гидрофобному поверхностному взаимодействию. Поскольку на характеристики поверхностей белков оказывает влияние присутствие солей, дополнительно был исследован эффект отсутствия NaCl (сообщенный как раствор с 0,1% Tween 80 без NaCl в таблице 5) (см. также Kheirolomoom et al. (1998) Biochem. Eng. J., 2: 81-88).

Таблица 5 Влияние Tween 80 на белковые композиции, содержащие 6,16 мг/мл NaCl (температура хранения - 40°C)
Время хранения (недели)	Доля (%) мономеров в случае 0% Tween	Доля (%) мономеров в случае 0,03% Tween	Доля (%) мономеров в случае 0,1% Tween	Доля (%) мономеров в случае 0,1% Tween без NaCl
0	98,86	98,91	98,9	98,9
1	98,55	98,58	98,59	98,59
4	97,39	97,49	97,46	97,54
12	95,18	92,55	95,29	95,53

В таблице 5 представлены результаты, полученные при различных количествах Tween 80 с NaCl и без него. Как продемонстрировано, Tween 80 был неспособен обеспечить стабильность композиции с NaCl или без него. Что касается комбинации 0,03% Tween 80/NaCl, она приводила к уменьшению доли мономеров после хранения в течение 12 недель при 40°C. Это результат противоречил большинству статей на эту тему, поскольку обычно стабилизирующий эффект Tween 80 увязан с увеличением концентраций поверхностно-активного вещества (действует в диапазоне от 0,001 до 1%) (см. Arakawa et al. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev., 46: 307-326).

Помимо концентрации мономера при различном процентном содержании Tween 80 с и без NaCl, также исследовали образование частиц довидимого диапазона при различных температурах (см. таблицу 6). При всех температурах хранения добавление Tween 80 приводило к значительному увеличению количеств частиц довидимого диапазона, особенно при концентрациях 0,03%, что подтверждало данные исследования с помощью SE-HPLC. Интересно, что отсутствие NaCl, как установлено, заметно уменьшает образование частиц довидимого диапазона, независимо от температуры хранения.

Таблица 6 Влияние Tween 80 на образование твердых частиц довидимого диапазона во время хранения при 40°C растворов, содержащих 6,16 мг/мл NaCl
Температура хранения ( ο C)	Содержание (%) частиц довидимого диапазона >1 мкм/мл в случае 0% Tween	Содержание (%) частиц довидимого диапазона >1 мкм/мл в случае 0,03% Tween	Содержание (%) частиц довидимого диапазона >1 мкм/мл в случае 0,1% Tween	Содержание (%) частиц довидимого диапазона >1 мкм/мл в случае 0,1% Tween без NaCl
5	127707	203884	152196	3564
25	17760	529244	61622	2547
40	91356	360929	111053	1533

Различные концентрации Tween 80 также исследовали применительно к образованию частиц после циклов замораживания/оттаивания. Установлено, что в противоположность незначительному стабилизирующему эффекту Tween 80 на жидкие композиции во время хранения, он придавал адалимумабу значительную стабильность во время циклов замораживания/оттаивания (таблица 7).

Таблица 7 Воздействие на белковые растворы с различными содержаниями Tween 80 посредством циклов замораживания/оттаивания
Число циклов замораживания/оттаивания	Содержание (%) частиц довидимого диапазона >1 мкм/мл в случае 0% Tween	Содержание (%) частиц довидимого диапазона >1 мкм/мл в случае 0,03% Tween	Содержание (%) частиц довидимого диапазона >1 мкм/мл в случае 0,1% Tween
0	5996	5391	5449
1	6178	6360	5049
2	13526	14520	6582
3	25509	26508	7850
4	38564	48392	8012
5	60507	69810	9533
6	69942	94742	12991
7	76209	99787	18111

Эффект Tween 80 был также определен при повторном подвергании растворов воздействию через посредство замораживания (-80°C, 12 часов) и оттаивания (5°C, 12 часов). Установлена близкая корреляция между числом примененных циклов замораживания/оттаивания и увеличением твердых частиц довидимого диапазона. Однако, тогда как эффектом 5 циклов замораживания/оттаивания на растворы с 0 или 0,03% содержанием Tween 80 было ~10-кратное увеличение примеси частиц (частиц ≥1 мкм), ситуация фактически оставалась неизменной в растворах с 0,1% Tween 80. Анализ с помощью SE-HPLC подтвердил эти результаты (таблица 8).

Таблица 8 Потеря мономеров в растворах адалимумаба с различным содержанием Tween 80, независимая от числа примененных циклов замораживания/оттаивания
Число циклов замораживания/оттаивания	Доля (%) мономеров в случае 0% Tween	Доля (%) мономеров в случае 0,03% Tween	Доля (%) мономеров в случае 0,1% Tween
0	98,41	98,48	98,43
1	98,29	98,38	98,42
2	98,33	98,45	98,41
3	98,3	98,46	98,43
4	98,29	98,46	98,45
5	98,22	98,45	98,42
6	98,15	98,49	98,41
7	98,12	98,48	98,42

В близком соответствии с результатами многочисленных опубликованных исследований эффекта циклов замораживания/оттаивания на другие белки стабильность адалимумаба в концентрации 50 мг/мл уменьшалась после подвергания воздействию через посредство повторных циклов замораживания/оттаивания в случае отсутствия поверхностно-активного вещества. Напротив, добавление поверхностно-активного вещества ограждало белок от вредных параметров, связанных с замораживанием/оттаиванием, поскольку доля природных мономеров оставалась неизмененной (что подтверждено с использованием рассеивания света под множеством углов (MALS)).

В заключение, добавление 0,1% Tween 80 к растворам с составляющей 50 мг/мл концентрацией адалимумаба было предпочтительным. Хотя 0,1% Tween увеличивал стабильность белка в хранимых жидкостях лишь ненамного, стабилизирующие эффекты во время таких процессов, как замораживание и оттаивание, были значительными. Тем не менее, добавление Tween 80 может принести большую пользу, поскольку замораживание является обычным типовым процессом при продукции, хранении и транспортировке белковых фармацевтических средств (Cao et al. (2003) Biotechnol. Bioeng. 82: 684-690). Кроме того, использование 0,1% Tween 80 в фармацевтических средствах является общепринятым, о чем свидетельствует разрешение FDA применения Orthoclone^TM (мышиного IgG2a) еще в 1986.

Помимо Tween 80, неионное поверхностно-активное вещество Solutol® HS 15 было исследовано в отношении его способности к стабилизации адалимумаба. Защитные свойства Solutol® в концентрациях, составляющих 0,03 и 0,1%, были недавно продемонстрированы на примере парентеральных препаратов Авискумина (Steckel et al. (2003) Int. J. Pharm., 257: 181-194). Следовательно, влияние Solutol® на растворы адалимумаба в плане образования примеси твердых частиц было сравнимым с таковым 0,1% Tween 80 на белковые растворы (таблица 9).

Таблица 9 Влияние содержащихся в растворах адалимумаба различных концентраций Solutol® на образование твердых частиц после хранения в течение 12 недель по сравнению с содержащимся в растворах адалимумаба 0,1% Tween 80
Температура хранения (°C)	Содержание (%) частиц довидимого диапазона >1 мкм/мл в случае 0,3 мг/мл Solutol®	Содержание (%) частиц довидимого диапазона >1 мкм/мл в случае 1 мг/мл Solutol®	Содержание (%) частиц довидимого диапазона >1 мкм/мл в случае 10 мг/мл Solutol®	Содержание (%) частиц довидимого диапазона >1 мкм/мл в случае 0,1% Tween
5	52760	57049	196929	152000
25	2978	1840	6827	61000
40	3884	1258	91333	111000

В противоположность растворам с 0,03% и 0,1% Solutol®, в растворах адалимумаба с 1% Solutol® и 0,1% Tween 80, соответственно, выявлено значительное увеличение твердых частиц во время хранения. Это положительное влияние низких концентраций Solutol® не было отображено в данных анализа с помощью SE-HPLC. После хранения в течение 12 недель (40°C) во всех растворах, содержащих Solutol®, была выявлена составляющая ~0,5% потеря доли мономеров по сравнению с контролем (0,1% Tween 80) (фиг.1).

Этот эксперимент также проиллюстрировал огромные преимущества, обеспечиваемые MALS, при детектировании высокомолекулярных (hmw) белковых агрегатов на ранней стадии (фиг.2A и 2B). Вследствие его высокой чувствительности к большим аналитам минимальные концентрации являются достаточными для детектирования агрегатов с помощью MALS, например, образование hmw агрегатов после хранения в течение 1 недели (40°C) можно было подтвердить с помощью MALS, но оно было фактически неопределяемым при использовании УФ₂₈₀-детектирования.

В результате, Solutol был исключен из списка возможных стабилизаторов, поскольку образование hmw агрегатов уже на ранних стадиях ускоренных исследований срока хранения, как правило, является неприемлемым. Известно, что даже минимальные количества белка (<0,1%) служат причиной преципитации (Hoffman, Analytical methods and stability testing of biopharmaceuticals, in Protein formulation and delivery, ed. by McNally, E. J., 3 (2000) 71-110). Вышеприведенные данные исследований подтверждают предшествующие исследования, в которых было установлено, что более высокие концентрации (>1%) Solutol® HS15 дестабилизировали растворы родственного серпинам ингибитора протеаз и способствовали явлению образования твердых частиц видимого диапазона (см., например, WO 2006037606).

Стабилизация с помощью наполнителей: полиолов

Многие сахара (например, сахароза, глюкоза, раффиноза, трегалоза) и полиолы (например, глицерин, сорбит, маннит) отнесены к категории стабилизирующих белки сорастворителей. В большой степени полагают, что эти вещества действуют, в основном, через механизм стерического вытеснения. Например, полиолы, такие как сорбит, часто используются для стабилизации парентеральных препаратов, например, в ряде фармацевтических средств в виде лиофилизированных вакцин, таких как Mumpsvax^TM, Meruvax^TM II и Attenuvax^TM, или вводимых внутривенно растворов, таких как Cardene^TM.

В противоположность другим наполнителям, таким как поверхностно-активные вещества, сахара и полиолы необходимо добавлять в более высоких концентрациях (>0,5 M) для полного раскрытия их способности к стабилизации. В результате сорбит в концентрации, составляющей 50 и 100 мг/мл, добавляли к растворам адалимумаба и подвергали хранению в течение 12 недель (таблица 10).

Таблица 10 Влияние сорбита на образование твердых частиц в растворах адалимумаба во время хранения в течение 12 недель
Температура хранения (°C)	Содержание (%) частиц довидимого диапазона >1 мкм/мл в случае 50 мг/мл сорбита	Содержание (%) частиц довидимого диапазона >1 мкм/мл в случае 100 мг/мл сорбита	Содержание (%) частиц довидимого диапазона >1 мкм/мл в случае отсутствия сорбита
5	1000	3040	152196
25	778	2800	61622
40	2636	460	111053

Сорбит уменьшал тенденцию к образованию частиц во время хранения по сравнению с растворами, в которых сорбит не присутствовал. Различие в количестве добавленного сорбита фактически не приводило к каким-либо различиям. Что касается доли мономеров, стабилизирующий эффект сорбита, как установлено, тесно зависит от концентрации. Присутствие NaCl уменьшает стабильность белка (таблица 11).

Таблица 11 Стабильность адалимумаба, отражением которой является доля мономеров белка, зависит от концентрации сорбита (числа означают концентрации в мг/мл; хранение при 40°C)
Время хранения (недели)	Доля (%) мономеров в отсутствие сорбита	Доля (%) мономеров в случае 100 мг/мл сорбита	Доля (%) мономеров в случае 50 мг/мл сорбита	Доля (%) мономеров в случае 50 мг/мл сорбита/4 мг/мл NaCl
0	99,66	99,65	99,65	99,66
1	99,09	99,2	99,19	99,13
4	97,93	98,41	98,38	98,1
8	96,52	97,54	97,48	96,98
12	95,32	96,8	96,49	96,13

В соответствии с таблицей 11 добавление 100 мг/мл сорбита увеличивало долю мономеров на ~1,5% во время хранения в течение 12 недель при 40°C. Уменьшение количества наполнителя приводит к уменьшению стабильности адалимумаба. Эти данные исследований подтверждают недавние исследования стабильности иммуноглобулинов лошади, в которых было установлено, что добавление 180 мл/мл сорбита лучше добавления 90 мг/мл в плане стойкости белка к тепловому воздействию (Rodrigues-Silva et al., 1999 Toxicon 37(1): 33-45). О зависимости стабилизирующего эффекта сахаров и происходящих из сахаров полиолов от их концентрации сообщалось (Chan et al. (1996) Pharm. Res. 13: 756-761; Fatouros et al. (1997b) Pharm. Res. 14: 1679-1684). Интересно, что добавление 4 мг/мл соли заметно снижало способность сорбита к стабилизации (на ~0,25% мономеров), как показано в таблице 11. С другой стороны, отсутствие NaCl в растворах адалимумаба, содержащих 0,1% Tween 80, приводило лишь к незначительному увеличению доли мономеров во время экспериментов, касающихся сроков хранения (как продемонстрировано в таблице 11).

Как продемонстрировано в таблице 12, эксперименты были повторены с использованием маннита вместо сорбита. Данные исследований сорбита были подкреплены при добавлении маннита к растворам адалимумаба: (1) растворы, пополненные 80 мг/мл маннита, превосходили растворы без маннита по доле мономеров белка на ~1,5% после хранения в течение 12 недель (40°C), (2) стабилизирующий вклад маннита находился в соответствии с зависимой от концентрации кривой, и (3) NaCl уменьшал увеличение доли мономеров, вызванное самим маннитом. Интересно, что эти данные были подтверждены идентичными экспериментами, выполненными при 25°C.

Таблица 12 Стабильность адалимумаба, отражением которой является доля мономеров белка, зависит от концентрации маннита (числа означают концентрации в мг/мл; хранение при 40°C)
Время хранения (недели)	Доля (%) мономеров в отсутствие маннита	Доля (%) мономеров в случае 80 мг/мл маннита	Доля (%) мономеров в случае 40 мг/мл маннита	Доля (%) мономеров в случае 40 мг/мл маннита/4 мг/мл NaCl
0	99,66	99,67	99,66	99,69
1	99,09	99,2	99,18	99,14
4	97,93	98,36	98,31	98,1
8	96,52	97,46	97,48	97,05
12	95,32	96,81	96,37	96,26

В заключение, стабилизация адалимумаба в концентрации 50 мг/мл обеспечивалась с помощью как сорбита, так и маннита. Этой стабилизации препятствовал NaCl. Данные о том, что NaCl не препятствует стабилизации адалимумаба после добавления к белковым растворам, содержащим 0,1% Tween 80, не расходились с выводами, сделанными выше.

Как продемонстрировано в таблице 13, количество природных мономеров в каждой композиции адалимумаба зависело от добавления полиолов и от композиционного наполнителя. Количества агрегатов и фрагментов менялись в равной степени. Доля агрегатов в суммарной потере мономеров оставалась постоянной, независимо от добавленных наполнителей, если вообще добавляли. Другими словами, отношение агрегаты: фрагменты адалимумаба находилось в равновесии (т.е. ~38% агрегатов и ~72% фрагментов), и на это равновесие не оказывало влияние добавление полиолов и солей. Если бы сорбит и маннит вносили вклад в стабильность адалимумаба исключительно благодаря стабилизации нативного состояния, это должно было найти отражение в изменениях доли агрегатов. Поскольку регистрировался не этот случай, должен был существовать дополнительный механизм стабилизации адалимумаба с помощью сорбита/маннита, приводящий к затруднению процессов фрагментации.

Таблица 13 Эффект добавления наполнителей на стабильность адалимумаба после хранения в течение 12 недель при 40°C (данные, полученные с помощью SE-HPLC)
Наполнители	% мономеров	% агрегатов	% фрагментов	Доля (%) агрегатов в суммарной потере мономеров
Отсутствие наполнителя	95,32	1,68	3,02	35,9
Сорбит 50 мг/мл	96,49	1,40	2,11	39,0
Сорбит 50 мг/мл NaCl 4 мг/мл	96,13	1,38	2,49	35,7
Сорбит 100 мг/мл	96,80	1,21	1,99	37,8
Маннит 40 мг/мл	96,37	1,42	2,21	39,1
Маннит 40 мг/мл NaCl 4 мг/мл	96,46	1,40	2,34	37,4
Маннит 80 мг/мл	96,81	1,28	1,91	39,9

В заключение, стабилизация адалимумаба в концентрации 50 мг/мл эффективно обеспечивалась с помощью добавления маннита к композиции. Помимо их содействия стабильности белка посредством защиты нативного состояния, маннит и сорбит стабилизировали белок через посредство дополнительно механизма, посредством которого уменьшалась фрагментация во время длительного хранения.

Стабилизация с помощью наполнителей: солей

NaCl является самой используемой солью при составлении белковых парентеральных композиции. Тем не менее, вышеприведенные результаты указывают на то, что при концентрации адалимумаба, составляющей 50 мг/мл, NaCl препятствовал стабилизации адалимумаба в присутствии полиолов и не увеличивал стабильность белка в качестве единственного наполнителя. При рассмотрении возможного стабилизирующего эффекта солей анализ их поведения в соответствии с лиотропным рядом Гофмейстера обеспечивал приближенное правило правой руки. Поэтому исследовали применение ацетат-аниона вместо хлорид-аниона в качестве противоиона в натриевых солях.

Как продемонстрировано в таблице 14, в отдельных растворах (т.е. 50 мг/мл сорбита/4 мг/мл Na-ацетата, 50 мг/мл сорбита/4 мг/мл NaCl и 50 мг/мл сорбита без соли) выявлена различность стабильность белка. Раствор адалимумаба, содержащий NaCl, был составленным против стабильности белка, поскольку спустя лишь 4 недели хранения (40°C) в результате сравнения композиций, содержащих либо NaCl, либо ацетат натрия, было установлено, что доля мономеров в пополненной натрия ацетатом партии была выше таковой в содержащих NaCl композициях на ~0,25%, сводясь к составляющему >0,4% различию через 12 недель. Следовательно, натрия ацетат вносил больший вклад в стабильность адалимумаба, чем натрия хлорид. Тем не менее, добавление натрия ацетата не увеличивало стабильность белка, поскольку композиция без соли характеризовалась равной долей мономеров.

Таблица 14 Стабильность адалимумаба в содержащих сорбит растворах зависит от добавления соли (числа означают концентрации в мг/мл хранение при 40°C)
Время хранения (недели)	Доля (%) мономеров в случае 50 мг/мл сорбита/4 мг/мл Na-ацетата	Доля (%) мономеров в случае 50 мг/мл сорбита/4 мг/мл NaCl	Доля (%) мономеров в случае 50 мг/мл сорбита без соли
0	99,66	99,66	99,65
1	99,21	99,13	99,19
4	98,36	98,1	98,38
8	97,34	96,98	97,48
12	96,46	96,13	96,49

По сравнению с обоими другими композициями (композициями с 50 мг/мл сорбита и либо без соли, либо с 4 мг/мг NaCl), в содержащих ацетат композициях выявлено большее количество частиц больше 1 мкм (~180000/мл в сравнение с <6000/мл).

Также были исследованы буферные системы, в результате чего были сравнены содержащие натрий и калий буферные системы с различными концентрациями сорбита. Как продемонстрировано в таблице 15, стабильность адалимумаба, растворенного в калийфосфатном буфере, равнялась такой, определенной в натрийфосфатных буферах. Данные исследований стойкости при хранении при 25°C подтвердили эти данные исследований. Кроме того, обе буферные системы были равными по показателю примеси твердых частиц. Поэтому считалось, что калия фосфат является предпочтительным в жидких белковых композициях.

Таблица 15 Стабильность адалимумаба в фосфатных буферных системах, в которых используются катионы натрия и калия в качестве противоионов, (концентрация буфера ~10 мМ, числа означают концентрации сорбита в мг/мл; хранение при 40°C)
Время хранения (недели)	Доля (%) мономеров в случае 100 мг/мл сорбита/иона калия	Доля (%) мономеров в случае 50 мг/мл сорбита/иона калия	Доля (%) мономеров в случае 100 мг/мл сорбита/иона натрия	Доля (%) мономеров в случае 50 мг/мл сорбита/иона натрия
0	99,67	99,67	99,65	99,65
1	99,21	99,22	99,2	99,19
4	98,39	98,37	98,41	98,38
8	97,61	97,59	97,54	97,48
12	96,88	96,46	96,8	96,49

В заключение, добавления NaCl следует избегать при составлении растворов с составляющей 50 мг/мл концентрацией адалимумаба. Если присутствие солей является преимущественным, например, по причине осмоляльности раствора - ацетат натрия имеет преимущество над хлоридом натрия. Аналогично, буферные системы на основе фосфата калия равнялись натрийфосфатным буферным системам в плане стабильности адалимумаба.

В заключение, pH раствора, составляющий 5,2, и добавление 0,1% Tween 80 обладали преимуществом над другими вариантами растворов с составляющей приблизительно 50 мг/мл концентрацией адалимумаба. В качестве оценочных показателей использовали стабильность белка и примесь твердых частиц согласно исследованиям с использованием замораживания/оттаивания и (ускоренным) исследованиям стойкости при хранении. Кроме того, полиолы, такие как маннит и сорбит, вносили существенный вклад в стабилизацию белка с фактически равной эффективностью. Преимущественное скопление белка в нативном состоянии не было единственным путем стабилизации, поскольку задерживались как агрегация, так и фрагментация белка. NaCl препятствовал стабилизации белка в присутствии полиолов. Добавление ацетата натрия не оказывало вредное влияние на стабильность белка.

Эти данные наводили на мысль о композиции, включающей калийфосфатный буфер, pH 5,2, 0,1% Tween 80 и ~50 мг/мл маннита или сорбита - с нацеливанием на конечные значения осмотической концентрации раствора, составляющие ~300 миллиосмоль/кг, в случае составляющей 50 мг/мл концентрации адалимумаба.

Пример 2

Композиция с высокой концентрацией адалимумаба

В следующем примере предоставлены ингредиенты для ряда композиций с высокой концентрацией белка, включающих антитело против TNFα - адалимумаб. Как ни удивительно, описываемые ниже композиции имели ряд преимущественных характеристик, несмотря на высокую концентрацию антитела, т.е. приблизительно 100 мг/мл.

Ряд характеристик, в том числе мутность, композиций (названных F1-F6) исследовали в сравнение с таковыми коммерческой композиции с составляющей 50 мг/мл концентрацией адалимумаба (F7). Мутность растворов определяли с помощью анализа неразведенного раствора. Мутность представлена в значениях NTU (в нефелометрических единицах мутности).

Примесь частиц видимого диапазона определяли с помощью визуального исследования, как описано в German Drug Codex. Частицы довидимого диапазона определяли методом светотени в соответствии с USP. Анализ разведенных растворов с использованием динамического рассеивания света (DLS) применяли для определения гидродинамического размера (представляемого в виде среднего значения или Z-среднего размера, рассчитываемого с помощью семиинвариантного анализа функции автокорреляции интенсивности, определенной с помощью DLS, и коэффициента полидисперсности, PDI, распределения частиц по размеру).

Физико-химическую стабильность композиций определяли с помощью SEC (гель-фильтрация), которая позволяет детектировать фрагменты и агрегаты. Для контролирования химической стабильности использовали SE-HPLC (детектирование фрагментов и подвергнутых гидролизу типов) и CEX-HPLC (катионообменную HPLC). CEX-HPLC разделяет различные изоформы лизина и продукты деградации (например, дезамидированные и окисленные типы), которые могут образоваться во время хранения.

Исследуемые композиции, содержащие 100 мг/мл адалимумаба в различных матрицах с охватом pH от 5,2 до 6,0, составленных с использованием различных полиолов и с использованием хлорида натрия или без него, названы F1-F6 (таблица 16).

Таблица 16 Компоненты композиций адалимумаба F1-F7
Компонент	F1	F2	F3	F4	F5	F6	F7
Адалимумаб	100	100	100	100	100	100	100
Маннит	12	42	-	12	42	-	12
Сорбит	-	-	42	-	-	42	-
Полисорбат 80	1	1	1	1	1	1	1
Лимонная кислота * H2O	1,305	1,305	1,305	1,305	1,305	1,305	1,305
Дигидрат цитрата натрия	0,305	0,305	0,305	0,305	0,305	0,305	0,305
Na2HPO4 * 2 H2O	1,53	1,53	1,53	1,53	1,53	1,53	1,53
Na2HPO4 * 2 H2O	0,86	0,86	0,86	0,86	0,86	0,86	0,86
NaCl	6,165	0	0	6,165	0	0	6,165
NaOH	q.s.	q.s.	q.s.	q.s.	q.s.	q.s.	q.s.
Целевой рН	5,2	5,2	5,2	6,0	6,0	6,0	5,2
q.s. - по необходимости

Вышеприведенные 100 мг/мл композиции (F1-F7) далее исследовали для определения общей стабильности и вязкости, как описано ниже в примерах 3-6.

Следующим описанием является описание того, как изготовить композиции с высокой концентрацией адалимумаба, в частности, по отношению к растворам F2 и F6. Исходным раствором является раствор очищенного антитела в низкой концентрации (ниже, чем высокие концентрации настоящего изобретения) в жидком буфере, например, буфере, полученном в результате предшествующей стадии процесса производства. В этом случае обеспечивался раствор адалимумаба в концентрации, составляющей приблизительно 70 мг/мл, в буферной системе, идентичной таковой F7 без поверхностно-активного вещества при pH 5,2. Затем исходный раствор концентрируют и подвергают диафильтрации посредством ультрафильтрации, предпочтительно в системе для тангенциальной поточной фильтрации, используя мембрану, способную к количественному удержанию антитела, например, с отсечением по молекулярной массе 10 кДа.

В качестве примера, репрезентативные композиции F2 и F6 были изготовлены посредством разведения концентрата до приблизительно 50 мг/л, используя соответствующую матрицу без поверхностно-активного вещества в качестве буфера для диафильтрации. Непрерывный буферный обмен был проведен с использованием системы для тангенциальной поточной фильтрации. Диафильтрацию обычно выполняли при постоянном объеме ретентата, с использованием по крайней мере 5 объемов и предпочтительно 8 объемов буфера для диафильтрации. На последней стадии подвергнутый диафильтрации раствор далее концентрировали до высокой концентрации, например, превышающей или равной 150 мг/мл. Затем конечный мутный ретентат удаляли из системы для ультрафильтрации посредством промывки трубок буфером для диафильтрации. После добавления соответствующего количества полисорбата 80 и доведения до целевой концентрации белка с использованием буфера для диафильтрации получали жидкую композицию с высокой концентрацией, которая была прозрачной - слегка опалесцирующей. После фильтрации через 0,22 мкм фильтр раствор был стабильным в течение по крайней мере приблизительно 12 месяцев в случае хранения при приблизительно 2-8°C.

Пример 3

Стойкость композиции с высокой концентрацией адалимумаба к воздействию через посредство замораживания/оттаивания

Для демонстрации стабильности композиций адалимумаба в составляющих 100 мг/мл концентрациях белка были выполнены эксперименты по воздействию через посредство замораживания/оттаивания (замораживания, выполненного при -80°C, оттаивания, выполненного при 25°C).

Ряд аналитических способов, чувствительных к образованию частиц, был использован для выявления возможной физической нестабильности. Мутность определяли в качестве показателя образования агрегатов частиц в коллоидном растворе или в видимом диапазоне. Мутность (представляемая в значениях NTU) не изменилась значительно даже после четверного цикла замораживания/оттаивания (фиг.3). Увеличенная мутность растворов с более высоким pH может объясняться увеличенными белок-белковыми взаимодействиями из-за уменьшенного отталкивания зарядов при pH, приближающегося к pI белка (адалимумаба - 8,5) (Wang et al. (2007) J. Pharm. Sci. 96(1): 2457-2468).

Динамическое рассеивание света использовали в качестве способа определения размера частиц в субмикронном диапазоне. Значение коэффициента полидисперсности, полученное в ходе определения распределения частиц по размеру, использовали в качестве другого чувствительно показателя агрегации в коллоидном растворе или в микрометровом диапазоне размеров. Подобно данным по мутности, ни одна из исследованных композиций не продемонстрировала каких-либо признаков физической нестабильности (фиг.4).

Кроме того, оценке были подвергнуты данные гель-фильтрации. На фиг.5 отображены уровни агрегатов. Признаки физико-химической нестабильности не были выявлены в зависимости от воздействия через посредство повторных циклов замораживания/оттаивания.

Широко известно, что обработка посредством замораживания/оттаивания может привести к значительной денатурации и агрегации белка, приводя к образованию растворимых и нерастворимых агрегатов (Parborji et al. (1994) Pharm. Res. 11(5): 764-771). Все представленные здесь композиции были подвергнуты обработке через посредство повторных циклов замораживания/оттаивания, и результаты показали, что ни одна из композиций не является чувствительной к повторным циклам замораживания/оттаивания (-80°C/25°C). Все композиции были равно стабильными независимо от их pH (во всех случаях не было значительного изменения по сравнению с исходными значениями), несмотря на более высокие pH композиций, которые были вблизи pI адалимумаба (т.е. 8,5).

Данные отдельного исследования, в котором сравнивались различные буферные растворы, подтвердили эти результаты. Установлено, что самой выгодной буферной системой, что касается гомогенного раствора (т.е. раствора с минимальным градиентом pH, осмоляльности, плотности) после замораживания/оттаивания и минимального сдвига pH во время замораживания/оттаивания, является состав буфера без добавления NaCl (см. пример 1). Установлено, что буферные системы без NaCl, составленные при pH 6, имеют минимальный сдвиг всех проверенных уровней pH.

Пример 4

Стабильность 100 мг/мл композиций, содержащих различные полиолы в качестве средства для придания изотоничности

Дифференциальную сканирующую калориметрию (DSC) использовали для проверки всех композиций с составляющей 100 мг/мл концентрацией адалимумаба на общую стабильность. Данные DSC были получены, используя форму DSC с использованием капиллярных ячеек из VP-Microcal. Все эксперименты проводили с использованием 1 теплового испытания, используя следующую стандартную процедуру: температурный диапазон: 20°-90°C, скорость нагревания: 1 K/мин, концентрация белка: 1 мг/мл).

Более высокие значения Tm обычно служат признаком повышенной конформационной стабильности (Singh et al. (2003) AAPS PharmSciTech 4 (3) article 42). На фиг.6 представлены значения Tm для композиций с составляющей 100 мг/мл концентрацией адалимумаба. Эти данные свидетельствовали о том, что все композиции достигают высоких значений Tm. Однако не содержащие хлорид натрия композиции (F2, F3, F5, F6) продемонстрировали значительно увеличенные значения Tm, что служит признаком стойкости этих композиций. После проверки композиций при 1 мг/мл сведения о Tm F1 были одинаковыми с таковыми о Tm F7, посредством чего подтверждается увеличенная стабильность 100 мг/мл композиций без хлорида натрия или при pH 6,0 относительно композиции F7.

Модель напряжения от перемешивания с использованием магнитной мешалки использовали для выявления физико-химической нестабильности новых композиций адалимумаба. В этой широко известной модели напряжение вызывается в результате подвергания адалимумаба длительному местонахождению на границах раздела воздух/раствор, а также связанной с перемешиванием кавитацией, что приводит к предсказуемому образованию растворимых и нерастворимых агрегатов белка.

Как правило, белки, составленные при значениях pH, находящихся в пределах соответствующих им pI (в случае адалимумаба pI=8,5, низкий результирующий заряд, минимизированные электростатические отталкивающие силы), наиболее подвержены связанной с местонахождением на границах раздела воздух/раствор агрегации вследствие уменьшенных отталкивающих сил. Дополнительно в агрегации белка играют роль ионные наполнители, такие как натрия хлорид, вследствие их ионных экранирующих свойств. Силы гидрофобного притяжения могут быть уменьшены в присутствии натрия хлорида, уменьшая, таким образом, белок-белковые взаимодействия и увеличивая стабильность коллоидного раствора (Shire et al. (2004) J. Pharm. Sci. 93(6): 1390-1402).

Данные по мутности подвергали оценке для выявления образования агрегатов, вызванного напряжением от перемешивания. В таблице 17 отражены нефелометрические значения в зависимости от состава композиции и времени перемешивания. На основе исходных значений мутности в случае растворов F1-F3 (составленных при более низком pH=5,2) выявлены различия между содержащим натрия хлорид раствором (F1) и растворами без NaCl (F2, F3). В противоположность, растворы, доведенные до более высокого pH=6,0, (F4-F6) характеризовались большей мутностью. В данной области техники известно, что NaCl может уменьшать прозрачность растворов мАт после механического воздействия, такого как перемешивание (см., например, Fesinmeyer et al. (2009) Pharm. Res. 26(4): 903-913).

Таблица 17 Мутность (NTU) в зависимости от времени перемешивания растворов F1-F6
	T0 ч	Т1 ч	Т5 ч	Т24 ч	Т48 ч
F1	31,5	33,25	36,05	46,9	54,85
F2	19,8	20,25	23,1	28,65	40
F3	18,8	19,75	22,2	27,3	39,5
F4	36,8	37,25	42,4	63,45	86,75
F5	36,1	38,85	44,5	64,3	76,7
F6	36,6	38,85	42,8	59,1	72,7

Перемешивание в течение вплоть до 48 часов вызывало увеличение значений мутности во всех исследованных композициях. Не содержащие NaCl композиции при более низком pH были в минимальной степени склонны к увеличению мутности в результате перемешивания. Как ни удивительно, все исследованные 100 мг/мл композиции продемонстрировали значительно меньшую мутность после перемешивания по сравнению с композициями с более низкой концентрацией (50 мг/мл) адалимумаба (таблица 18).

Как правило, опалесцирующий вид является простым результатом релеевского рассеяния и линейно связан с концентрацией белка. Однако появление опалесценции не приводит к физической нестабильности (Sukumar et al. (2004) Pharm. Res. 21(7): 1087-1093). Композиция с составляющей 50 мг/мл концентрацией адалимумаба продемонстрировала мутность, составляющую 63-130 NTU после перемешивания в течение 24 часов и 109-243 NTU через 48 часов, тогда как перемешивание композиций с составляющей 100 мг/мл концентрацией адалимумаба приводило к значениям, колеблющимся между 27-63 (через 24 часа) и 40-87 (через 48 часов). Согласно Treuheit и др. ((2002) Pharm. Res. 19(4): 511-516), увеличение концентрации белка уменьшает вызываемую на границах раздела воздух/жидкость агрегацию в растворе OPC-Fc в области концентрации ниже 10 мг/мл. Схожие результаты были сообщены Kiese и др. ((2008) J. Pharm. Sci. 97 (10): 4347-4366). Неожиданно, что новые композиции адалимумаба характеризовались повышенной стойкостью к напряжению от перемешивания в области намного более высоких концентраций белка - 100 мг/мл.

Следовательно, новые композиции имеют повышенную стойкость по сравнению с 50 мг/мл композициями.

Таблица 18 Данные экспериментальных исследований напряжения от перемешивания, выполненных с использованием различных партий композиций с составляющей 50 мг/мл концентрацией адалимумаба (F7)
	партия 201359А	партия 191299А	партия 221479А	партия 221489А	партия 241679А	партия 231649А
NTU T24	63,3 (22,85)	130,4 (39,24)	94,8 (28,98)	92,1 (30,88)	82,0 (29,75)	88,0 (30,15)
NTU T48	109 (52,50)	243 (84,23)	нет данных	178,4 (55,80)	136 (30,65)	175,7 (63,37)

Кроме того, на основе данных по гель-фильтрации было обнаружено, что все 100 мг/мл композиции имели уровни агрегатов <1% после перемешивания в течение 48 часов, что подтверждает заявление о стойкости новых композиций (фиг.7). Снова были полезными низкий pH и отсутствие натрия хлорида. Эти данные подтверждают неожиданное обнаружение того, что новые композиции являются стабильными, несмотря на значения pH, приближающиеся к pI адалимумаба, и что отсутствие NaCl является полезным, хоть обычно и считается, что низкий результирующий заряд при более высоком pH увеличивает нестабильность.

Пример 5

Длительная стабильность композиций с составляющей 100 мг/мл концентрацией адалимумаба, с натрием хлорида и без него, pH 5,2 и 6,0, с 2 различными полиолами

Новые композиции с составляющей 100 мг/мл концентрацией адалимумаба подвергали длительному хранению для подтверждения большей стабильности по сравнению со стандартной композицией с составляющей 50 мг/мл концентрацией. Осуществляли оценку данных по стабильности в течение 12 месяцев при 5°C (температуре хранения, рекомендуемой для коммерческого продукта). Действительно, данные говорят о том, что новые композиции не проявляли пониженную стабильность (таблица 19).

Говоря о SEC и IEX, значительная потеря в доли мономеров или определяемая деградации не имела место.

Кроме того, несмотря на более высокую концентрацию белка в новых композициях адалимумаба были достигнуты значительные улучшения по показателю примеси частиц довидимого диапазона по сравнению с данными, полученными спустя 12 месяцев для продаваемой композиции с составляющей 50 мг/мл концентрацией адалимумаба. В результате проверки на примесь частиц довидимого диапазона (служащей признаком явлений агрегации, преципитации и общей физической нестабильности) обнаружено, что новые композиции адалимумаба остаются практически свободными от частиц довидимого диапазона. Максимальные значения для исходного количества частиц, составляющего 28 (≥10) и 3 (≥25), были значительно ниже, чем в случае композиции F7 с концентрацией 50 мг/мл (703 и 38, соответственно).

Кроме того, уровни частиц не изменялись значительно на протяжении всего 12-месячного испытания на стойкость и оставались на значительно более низких уровнях, чем в случае F7.

Партии лекарственных продуктов были фактически равнозначными, что касается их физико-химической стабильности, во всех проверенных условиях хранения. Это является неожиданным, поскольку общепризнанной является тенденция к снижению физической стабильности при более высоких концентрациях белков (Wang W. (1999) Int. J. Pharm. 185: 129-188).

Таблица 19 Сравнение аналитических данных исследований стабильности F1-F7 (TO/12 месяцев)
	F1	F2	F3	F4	F5	F6	F7
Доля мономеров согласно SEC	99,699,4	99,0 99,4	99,7 99,4	99,4 99,2	98,7 99,1	99,499,1	99,899,4
Суммарное количество вариантов лизиса согласно IEX	85,9 83,5	85,7 83,2	86,9 83,2	86,0 84,9	85,884,7	86,084,6	85,182,6
Прозрачность	29,3	16,10	16,5	32,20	31,5	32,6	19,7
30,2	17,10	17,85	34,0	33,5	33,9	18,4
Оценка DAC	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,4
0,1	0,1	0,4	0,0	0,0	0,0	0,0
Количество частиц довидимого диапазона ≥10	31 2	4 4	2 3	6 7	18 8	28 5	703 746
Количество частиц довидимого диапазона ≥25	0 1	0 0	0 1	0 1	0 3	1 2	38 36

Для подтверждения результатов повышенной стойкости при хранении новых композиций с концентрацией 100 мг/мл 2 репрезентативных композиции, F2 и F6, были подвергнуты ускоренным исследованиям стойкости (3 месяца при 5°C, 25°C, 40°C) и сравнены с продаваемой композицией с концентрацией 50 мг/мл (репрезентативные партии регистрационных серий). Результаты этих исследований суммированы на фиг.8-13.

Данные по мутности этих партий подтверждают меньший характер изменений у не содержащих NaCl композиций в концентрации 100 мг/мл, особенно при более низком pH=5,2. Общеизвестно, что увеличение концентрации белка в растворе приводит к увеличению опалесценции и, тем самым, показания мутности вследствие релеевского рассеяния (Sukumar et al. (2004) Pharm. Res. 21 (7): 1087-1093). Как ни удивительно, в новых композициях без натрия хлорида выявлены уровни мутности, схожие с таковыми в композициях с концентрацией 50 мг/мл, при одинаковых рН (фиг.8).

На фиг.9-11 представлены выделенные данные по образованию частиц (частиц видимого и довидимого диапазонов) в новых композициях. Неожиданное обнаружение повышенной стойкости было подтверждено. В действительности, возможным было снижение оценки количества частиц довидимого и видимого диапазонов даже после хранения в течение 3 месяцев при повышенной температуре.

Представленные на фиг.12-13 данные служили дальнейшим подтверждением стабильности композиций с концентрацией 100 мг/мл, поскольку они не выявляют каких-либо проблем со стабильностью в случае использования метода анализа с помощью SEC, и химической стабильности, проверенной с использованием IEX.

Пример 6

Увеличенные возможности производства композиций с составляющей 100 мг/мл концентрацией адалимумаба по сравнению с композициями с составляющей 50 мг/мл концентрацией адалимумаба

В этом примере суммированы данные, относящиеся к повышенной стойкости в технологическом процессе новых композиций с составляющей 100 мг/мл концентрацией адалимумаба (репрезентативных композиций F2 и F6) по сравнению с продаваемым в настоящее время продуктом с составляющей 50 мг/мл концентрацией.

Механическое напряжение, создаваемое в результате процессов насосной эксплуатации, фильтрации, смешивания, последнего этапа - наполнения, транспортировки или встряхивания, может вызвать денатурацию и в последовательном порядке агрегацию вследствие местонахождения белка на границах раздела воздух/вода, поверхностях материалов и действия сил сдвигов (Mahler at al. (2005) Eur. J. Pharm. Biopharm. 59: 407-417; Shire et al. (2004) J. Pharm. Sci. 93(6): 1390-1402).

Значения вязкости сначала определяли в качестве основного параметра, характеризующего эксплуатационные характеристики белковых растворов. В таблице 20 представлены данные по вязкости, полученные для композиций F1-F7. Увеличение концентрации белка приводило к увеличенной вязкости по сравнению с композицией с концентрацией 50 мг/мл (F7).

По прогнозам, исключение электростатически экранирующего агента NaCl увеличивает гидрофобные взаимодействия белковых молекул, особенно при значениях pH, приближающихся к pI адалимумаба, что приводит, таким образом, к увеличению вязкости. Согласно сообщениям этот эффект был наиболее выраженным при концентрации NaCl <200 мМ (Shire et al. (2004) J. Pharm. Sci. 93(6): 1390-1402).

Однако неожиданно исключение NaCl (F1 содержит ~105 мМ NaCl) из композиций привело к все еще относительно низким значениям вязкости, составляющим приблизительно 3,1-3,3 миллипаскаль-секунда (F2, F3, F5 и F6). Это было особенно неожиданным для растворов с более высоким значением pH=6,0 (F5 и F6).

В заключение, все композиции характеризуются коэффициентами вязкости в диапазоне, являющимся оптимальным для процессов производства с последним этапом - наполнением жидкостью.

Таблица 20 Сравнение коэффициентов вязкости F1-F7 при 25°C
композиция	Коэффициент вязкости [миллипаскаль-секунда]
F1	2,8902
F2	3,1278
F3	3,1223
F4	2,9018
F5	3,2585
F6	3,2279
F7	1,3853

В лабораторной модели, имитирующей напряжение, вызываемое при стерилизации фильтрованием в ходе стерильного процесса производства, с использованием двух репрезентативных новых композиций, содержащих 100 мг/мл адалимумаба, были обеспечены аналитические данные, демонстрирующие стойкость всех композиций к связанному с фильтрацией сдвиговому напряжению. Данные DLS не свидетельствовали о каких-либо признаках образования агрегатов с повышенной молекулярной массой, поскольку коэффициент полидисперсности, чувствительный показатель низких уровней субпопуляций с повышенной молекулярной массой, не увеличился значительно. Измерения DLS используют, в частности, для детектирования небольших количеств продуктов с повышенной молекулярной массой, например, агрегатов, в распределении по размерам, поскольку эти продукты обладают более высокой интенсивностью рассеивания (пропорциональной d6) и в силу этого будут значительно влиять на Z-средний размер и коэффициент полидисперсности в качестве показателя распределения по Z-среднему размеру. Кроме того, полученные с помощью SEC данные не подтвердили вызов агрегации при фильтрации.

Как ни удивительно, даже композиции с концентрацией 100 мг/мл не продемонстрировали какую-либо нестабильность. Даже после множества стерилизаций фильтрованием в качестве худшего случая эксплуатационные характеристики сохранялись на высоком уровне несмотря на увеличенное содержание белка.

Таблица 21 Основанное на DLS- и SEC-данных сравнение F2, F6 и F7 по показателю стойкости к напряжению, вызываемому при стерилизации фильтрованием
Способ	F2, 100 мг/мл	F6, 100 мг/мл	F7, 50 мг/мл
DLS (нм)
PDL до фильтрации	0,058	0,054	0,022
PDL после 5 циклов фильтрации	0,057	0,050	0,032
SEC (% агрегатов)
До фильтрации	0,235	0,429	0,220
После 5 циклов фильтрации	0,238	0,426	0,310

Для дальнейшей демонстрации высокой стойкости новых композиций адалимумаба к связанному с технологическим процессом напряжению композиции проверяли в модели напряжения от перемешивания, сравнивая их характеристики в зависимости от различных скоростей перемешивания с использованием магнитной мешалки (напряжение от перемешивания возникает в условиях продукции на стадии процесса смешивания).

В результате сравнения стойкости к напряжению от перемешивания не обнаружено увеличение мутности при составляющей 100 мг/мл концентрации белка (фиг.14). Обе репрезентативные композиции с концентрацией 100 мг/мл без натрия хлорида и увеличенного содержания полиолов вели себя подобно тому, как вела себя коммерческая композиция при PH 5,2, при всех проверенных скоростях перемешивания. При более высоких скоростях перемешивания все композиции продемонстрировали слегка увеличенные значения мутности после перемешивания в течение 24 часов, однако было выявлено заметно увеличенной подверженности нестабильности вследствие сдвигового напряжения при 100 мг/мл.

Сравнение изменений гидродинамических размеров, полученных с помощью определения DLS, дало в результате схожие данные. Обе композиции с концентрацией 100 мг/мл вели себя схоже с композициями с концентрацией 50 мг/мл, несмотря на то, что композиции с более высокими концентрациями белков, как полагают, более чувствительны к напряжению от перемешивания. Как ни удивительно, в композиции F2 с наивысшим pH обнаружено наименьшее относительное увеличение и коэффициента мутности, и гидродинамических размеров в качестве аналитических данных (фиг.15).

Это неожиданное обнаружение схожей стойкости к технологическому процессу даже при более высокой концентрации белка было в дальнейшем подтверждено с помощью модели механического напряжения, имитирующей напряжение, вызываемое в результате процесса насосной эксплуатации. Эта последняя стадия процесса производства заключает в себе сдвиговое напряжение, создаваемое перистальтическим насосом, увеличивая, тем самым, риск нестабильностей растворов. И снова, данные, полученные, используя определение мутности (фиг.16) и DLS (фиг.17, таблица 22), подтвердили, что новые композиции с концентрацией 100 мг/мг не подвергаются реакциям образования частиц и остаются стабильными подобно композиции с концентрацией 50 мг/мл. Не было выявлено подверженности образованию агрегатов, вызванному напряжением от насоса. Эти данные наблюдений были, кроме того, подтверждены данными SEC, в которых не обнаружены какие-либо различия исследованных композиций в зависимости от числа циклов насосной эксплуатации (фиг.18).

Таблица 22 Основанное на DLS-данных (PDI) сравнение стабильности F2, F6 и F7 до и после нескольких циклов насосной эксплуатации
Число циклов насосной эксплуатации	Коммерческая композиция, рН 5,2	Маннит, рН 5,2 (композиция 2)	Сорбит, рН 6 (композиция 6)
0	0,06	0,055	0,028
1	0,059	0,064	0,029
10	0,061	0,058	0,032
20	0,059	0,069	0,022

Используя различное оборудование для наполнения (вращающийся поршень и перистальтические насосы), были оценены различия в стабильности композиций с концентрацией 100 мг/мл.

Эти исследования показали, что более высокое сдвиговое напряжение, создаваемое в поршневых насосах, приводило к увеличению количеств частиц видимого диапазона, особенно в случае содержащих натрия хлорид композиций при более высоком pH (F1 и F4). Недавно были опубликованы схожие результаты, полученные Bausch, Ursula J. (Impact of filling processes on protein solutions. 2008, PhD Thesis, University of Basel, Faculty of Science; http://edoc.unibas.ch/845/l/DissB_8427.pdf), но только при концентрациях белка в растворах ритуксимаба, составляющих 10 мг/мл. Как ни удивительно, содержащие натрия хлорид композиции со 100 мг/мл адалимумаба продемонстрировали улучшенные эксплуатационные характеристики в условиях высокого сдвигового напряжения при использовании поршневых насосов.

На фиг.19-22 представлены количества частиц и данные по мутности, подтверждающие повышенную чувствительность содержащих NaCl растворов адалимумаба к условиям повышенного напряжения в технологическом процессе: Определение диапазонов размеров частиц ≥10 мкм и ≥25 мкм в соответствии с визуальным способом оценки DAC обеспечивает существенный показатель качества в случае лекарственных средств для парентерального введения. Поэтому уменьшение частиц довидимого диапазона в не содержащих NaCl композициях обусловливает значительное улучшение композиций.

Как отображено на фиг.19, наполнение с использованием перистальтического насоса не приводило к образованию частиц видимого диапазона сразу же после наполнения (TO) и после хранения. Напротив, наполнение с использованием поршневого насоса приводило к значительным количествам частиц даже в TO в случае растворов, составленных при рН 6,0 (фиг.20). Наибольшие значения были определены в F4, содержащем натрия хлорид, тогда как оценка F5-F6 дала в результате меньшие показатели, что служит подтверждением повышенной стойкости не содержащих натрия хлорид композиций к напряжению в ходе технологического процесса.

Служащие подтверждением результаты были получены при измерениях мутности (фиг.21-22). Исходные значения растворов после наполнения с использованием поршневого насоса были выше таковых после процесса наполнения с использованием перистальтического насоса. Не содержащие натрия хлорид композиции дали в результате пониженный коэффициент мутности по сравнению с содержащими натрия хлорид композициями. Кроме того, сдвиговое напряжение, создаваемое при наполнении с использованием поршневого насоса, позволило установить различие между F4 (с натрия хлоридом) и F5-F6 (без натрия хлорида) по показателю мутности.

Пример 7

Сравнение различных концентраций полиолов в не содержащих натрия хлорид композициях

Было проведено исследование влияния концентрации полиола на стойкость при краткосрочном хранении при 5°C следующих композиций, содержащих 100 мг/мл адалимумаба, без натрия хлорида.

Композиции доводили до pH 6,0, который представлял плохие условия в плане тенденции к агрегации и образованию частиц.

Таблица 23 Обзор композиций, исследованных в примере 6
	F8	F9	F10	F11
Компонент	#1 Маннит (12 мг/мл)	#2 Маннит (42 мг/мл)	#3 Сорбит (12 мг/мл)	#4 Сорбит (42 мг/мл)
Адалимумаб	100	100	100	100
Маннит	12	42	-	-
Сорбит	-	-	12	42
Tween 80	1	1	1	1
Лимонная кислота * H2O	1,305	1,305	1,305	1,305
Цитрат натрия * 2 H2O	0,305	0,305	0,305	0,305
Na2HPO4 * 2 H2O	1,53	1,53	1,53	1,53
NaH2PO4 * 2 H2O	0,86	0,86	0,86	0,86
NaCl	0	0	0	0
NaOH	q.s.	q.s.	q.s.	q.s.
Целевой рН	6,0	6,0	6,0	6,0
q.s. - по необходимости.

Маннит или сорбит использовали в концентрации 42 мг/мл для удовлетворения требованиям в отношении тоничности для не содержащих натрия хлорид растворов. Данные показали, что по сравнению с ранее используемой концентрацией 12 мг/мл оба полиола не только вносили вклад в осмоляльность растворов, но, кроме того, оказывали значительное влияние на стабильность белка.

Данные по стабильности говорили о повышенной стабильности в случае более высоких концентраций полиолов, независимо от типа полиола. В условиях, которые обычно расцениваются как неоптимальные (например, pH 6,0 вблизи pI адалимумаба), композиции с более высокими концентрациями полиолов продемонстрировали повышенную стабильность даже после короткого хранения, составляющего 4 недели, при 5^οC. Это наблюдали при использовании нескольких аналитических метолов.

На фиг.23 показано, что прозрачность исследованных композиций значительно снижалась при увеличении концентрации полиолов и могла сохраняться на более низких уровнях в течение периода исследования. Кроме того, через 4 недели при 5°C наблюдали небольшое уменьшение агрегации, приводящее к большей доли мономеров, при более высоких концентрациях полиолов (фиг.24 и 25). При более высоких концентрациях полиолов было уменьшено количество частиц довидимого диапазона ≥10 мкм (например, в TO).

Пример 8

Стабильные композиции с высокими концентрациями белков - антител человека против TNF-альфа

Различные композиции адалимумаба были проверены на возможность применения для сохранения физической и химической стабильности адалимумаба и в условиях ускоренных испытаний стабильности, и в условиях длительного хранения при рекомендуемой температуре хранения (см. таблицу 1 ниже). Композиции отличались по pH (pH 5,2 в сравнение с pH 6), характеристикам, связанным с наполнителями (например, концентрациям маннита и сорбита), характеристикам, связанным с солью/ионной силой, (например, концентрации NaCl) и концентрации белка (50 мг/мл в сравнение с 100 мг/мл).

Таблица 24 Обзор композиций, упоминаемых в следующих примерах (все концентрации относятся к мг/мл)
Компонент	F1	F2	F3	F4	F5	F6	F7
Адалимумаб	100	100	100	100	100	100	50
Маннит	12	42	-	12	42	-	12
Сорбит	-	-	42	-	-	42	-
Полисорбат 80	1	1	1	1	1	1	1
Лимонная кислота * H2O	1,305	1,305	1,305	1,305	1,305	1,305	1,305
Дигидрат цитрата натрия	0,305	0,305	0,305	0,305	0,305	0,305	0,305

Na2HPO4 * 2 H2O	1,53	1,53	1,53	1,53	1,53	1,53	1,53
NaH2PO4 * 2 H2O	0,86	0,86	0,86	0,86	0,86	0,86	0,86
NaCl	6,165	0	0	6,165	0	0	6,165
NaOH	q.s.	q.s.	q.s.	q.s.	q.s.	q.s.	q.s.
Целевой рН	5,2	5,2	5,2	6,0	6,0	6,0	5,2
q.s. - по необходимости.

В таблице 2 представлен обзор стрессовых температур и моментов времени отбора образцов. Композиции F2 и F6 были идентифицированы как композиции, которые сохраняют как физическую, так и химическую стабильность адалимумаба в течение по крайней мере 18 месяцев и 12 месяцев, соответственно. Замена в композиции наполнителя NaCl маннитом (композиция F2) и сорбитом (композиция F6) придает высокую способность к стабилизации, несмотря на увеличение на 100% концентрации белка (с 50 мг/мл в композиции F7 до 100 мг/мл в композициях F2 и F6). Как ни удивительно, физические стабильности обоих композиций сохранялись в течение по крайней мере 12 и 18 месяцев, соответственно. Даже после хранения в течение 12 месяцев обе композиции содержали более 99% мономеров (данные SEC), и уровни агрегатов были ниже 1%.

Так же на всем протяжении контролирования стабильности сохранялась химическая стабильность, которая очень часто является фактором, ограничивающим срок годности белковых лекарственных продуктов, поскольку служащая признаком стабильности сумма вариантов лизина (L0+L1+L2) превышала 80%.

Дополнительные исследования, признанные в данной области техники в качестве исследований, подходящих для контролирования физической и/или химической стабильности белковых композиций, например, тестирование частиц довидимого диапазона, измерение мутности, визуальное исследование, контролирование прозрачности или цвета, подтвердили способность к стабилизации композиций F2 и F6.

Относительно важно, что исследование способности к нейтрализации TNF, служащей признаком эффективности, показало, что обе композиции сохраняли эффективность адалимумаба на всем протяжении схемы отбора образцов, и данные находились в пределах диапазона высоких уровней качества от 75 до 125%.

Таблица 25 Данные по стабильности, полученные для композиций F2 и F6, при различных температурах в течение различного числа месяцев
	5°С	25°С/60% относительная влажность	40°С/75% относительная влажность
F2	9 месяцев	6 месяцев	6 месяцев
F6	3 месяца	3 месяца	3 месяца
F2	18 месяцев	6 месяцев	6 месяцев
F6	12 месяцев	6 месяцев	6 месяцев

Пример 9

Исследование на предмет боли адалимумаба в высоких концентрациях

Пациенты, подвергаемые лечению моноклональными антителами посредством подкожной инъекции, могут ощущать боль или дискомфорт в месте инъекции (см., например, Fransson, J.; Espander-Jansson, A. (1996) Journal of Pharmacy and Pharmacology 48(10): 1012-1015; Parham, S. M.; Pasieka, J. L. (1996) Can. J. Surg. 39: 31-35; Moriel E Z; Rajfer J. (1993) The Journal of urology 149(5 Pt 2), 1299-300). Модель на животном, которая имитирует данные ощущений пациента, использовали для оценки болевых эффектов и переносимости и для определения возможных модификаций композиции до применения для человека. Имеющиеся в наличии модели на животных были оценены на возможность их применения для дифференциации характеристик белковых композиций. Определения включали издание звуков в ответ на инъекцию, вздрагивание лапы от боли (через 0-10 минут после инъекции), исследования механической аллодинии и термической аллодинии (через 30 минут после инъекции). Отмечали также ноцицептивные поведения животных, такие как лизание травмированной лапки или встряхивание ею, и покраснение или опухание в месте инъекции.

Модель вздрагивания от боли была выбрана для оценки боли в месте инъекции и использовалась для оценки эффекта состава композиции на переносимость и ощущения боли.

Переносимость различных композиций с составляющей 100 мг/мл концентрацией адалимумаба сравнивали с композицией F7 (композицией с составляющей 50 мг/мл концентрацией адалимумаба). Полученные данные подтвердили неожиданные обнаружения улучшенной переносимости композиций с концентрацией 100 мг/мл в месте инъекции после подкожной инъекции по сравнению с композициями с концентрацией 50 мг/мл (F7).

Новые композиции с концентрацией 100 мг/мл подвергли оптимизации для уменьшения связанных с подкожной инъекцией побочных эффектов, таких как боль в месте инъекции. Боль в месте инъекции включает как боль, связанную с проколом иглой, так и ощущения, связанные с инфузией раствора в подкожное депо. Несмотря на то, что имеющиеся в литературе данные говорили о том, что определенные конструкции игл могут быть полезными для уменьшения дискомфорта в месте инъекции, не было четких данных о вкладе композиции (см., например Chan, G. C. F., et al. (2003) American Journal of Hematology 76(4): 398-404).

Данные авторов настоящего изобретения, которые использовали модель боли на крысе, говорили о том, что новые композиции с концентрацией 100 мг/мл являются эффективными в ослаблении боли в месте инъекции после подкожной инъекции схожих терапевтических доз по сравнению с продаваемой в настоящее время композицией Humira®. Это было достигнуто с помощью уменьшения инъецируемого объема новых композиций с концентрацией 100 мг/мл, что демонстрирует крайне значимую полезность оптимизирования лечений пациентов и увеличивает соблюдение режима терапии пациентом.

В то же время авторы настоящего изобретения экспериментально обнаружили, что pH композиции в диапазоне, приемлемом для составления композиции с концентрацией 100 мг/мл, не влияет на боль в месте инъекции. Интересно, что композиции с более низкими значениями pH, которые находятся дальше от диапазона физиологических pH, могли назначаться со схожей переносимостью.

Способ, применяемый для исследования переносимости:

Исследования вздрагивания лапы от боли и ноцицептивных поведений

Взрослых самцов крыс Sprague Dawley подвергали акклимации к условиям исследования в течение 20-30 минут перед (подкожной) инъекцией в лапу исследуемых растворов в правую заднюю лапу. Отмечали число вздрагиваний лапы, и определяли время, проведенное в ноцицептивном поведении (защитной фиксации или лизании лапы), в течение первых 10 минут после инъекции. Все исследуемые растворы инъецировали в общем объеме, составляющем 150 мкл, кроме особо оговоренных случаев. Эксперименты были закодированными и проводились слепым, случайным образом. Солевой раствор и капсаицин (2,5 мкг) использовали в качестве отрицательных и положительных контролей, соответственно.

Эффект объема

Эффект инъецируемого объема на ответную реакцию в виде вздрагивания лапы от боли исследовали в случае как плацебо, так и исследуемой композиции F7. Для определения, могла ли ответная реакция быть ослаблена посредством уменьшения физического объема, исследовали эффект различных инъецируемых объемов (10 мкл, 50 мкл и 150 мкл в лапу) на последствия в виде вздрагиваний от боли.

Данные исследования позволяют сделать следующие выводы в отношении эффекта объема. Число вздрагиваний значительно возрастало при инъекции 150 мкл как плацебо (32±12), так и F7 по сравнению с солевым раствором (4±2), но было неотличимым от такового при инъекции солевого раствора в меньших объемах. Тогда как больший инъецируемый объем, составляющий 150 мкл, раз за разом вызывал более сильные ответные реакции в виде вздрагиваний от боли, меньший объем (10 мкл и 50 мкл) приводил к значительно меньшим ответным реакциям.

Этот результат говорит о том, что снижение объема вводимого раствора приводит к вызову меньшего раздражения, что говорит о том, что композиции с высокими концентрациями, такие как F2 и F6, являются предпочтительнее, что касается переносимости и ощущения боли, композиций с более низкими концентрациями, таких как F7.

• Число вздрагиваний лапы от боли в течение 0-10 минут после инъекций плацебо:

Однофакторный дисперсионный анализ: инъецируемый объем 10; 50; 150 мкл
Источник	DF	SS	MS	F	P
Показатель	2	2696	1348	4,32	0,033
Отклонение	15	4679	312
Сумма	17	7376

S=17,66 R-Sq=36,56% R-Sq (скорректированный)=28,10%

• Число вздрагиваний лапы от боли в течение 0-10 минут после инъекции в случае активных инъекций (исследуемой композиции F7):

Однофакторный дисперсионный анализ: инъецируемый объем 10; 50; 150 мкл
Источник	DF	SS	MS	F	P
Показатель	2	4075	2037	6,96	0,007
Отклонение	15	4390	293
Сумма	17	8465

S=17,11 R-Sq=48,14% R-Sq (скорректированный)=41,22%

Пример 10

Эффект pH содержащих адалимумаб растворов на переносимость/боль

Дополнительный эксперимент был проведен с содержащими адалимумаб активными растворами. Исследованными композициями были F2 (при pH 5,2), F5 и F7, соответствующие композиции со значениями pH, более близкими к физиологическим условиям.

Данные указывали на то, что pH, не оказывает эффект на ответную реакцию животного, определяемую, используя ответную реакцию в виде вздрагивания лапы от боли и время, проведенное в ноцицептивном поведении. Данные в случае положительного и отрицательного контролей находились в пределах ожидаемого диапазона. В литературе убедительно подтверждено доказательствами, что более низкий pH композиции (т.е. кислотный) может увеличить риск непереносимости и ощущений боли при парентеральном введении, особенно с помощью подкожных инъекций. Поэтому было неожиданным, что в случае композиций адалимумаба F2 и F5 pH композиций не оказывал влияние на переносимость и/или ощущение боли. Это очень полезно, поскольку это позволяет разработчикам рецептур задать другие параметры, такие как pH композиции, физическая стабильность и уровни агрегатов (которые, возможно, связаны с рисками иммуногенности), первостепенной важности в части принятия решения в отношении композиции.

• Данные, касающиеся времени, проведенном в ноцицептивном поведении, [сек]:

Однофакторный дисперсионный анализ: отрицательный контроль; F2; F5; F8
Источник	DF	SS	MS	F	P
Показатель	4	919856	229964	27,81	0,000
Отклонение	55	454773	8269
Сумма	59	1374629

S=90,93 R-Sq=66,92 R-Sq (скорректированный)=64,51%

• Число вздрагиваний лапы от боли в течение 0-10 минут после инъекции:

Однофакторный дисперсионный анализ: солевой раствор; F2; F5; F8; капсаицин
Источник	DF	SS	MS	F	P
Показатель	4	91404	22851	49,81	0,000
Отклонение	55	25234	459
Сумма	59	116638

S=21,42 R-Sq=78,37 R-Sq (скорректированный)=76,79%

Пример 11

Эффект pH не содержащих адалимумаб растворов

Для исследования влияния состава композиции (например, влияния буферов, таких как фосфатный буфер, наполнителей, таких как маннит, или поверхностно-активных веществ, таких как полисорбат 80), был проведен дополнительный эксперимент, в котором аналогичные данные были получены с использованием не содержащих белок композиций. pH растворов плацебо варьировал в диапазоне приблизительно 5-7 и, как ни удивительно, не оказывал, как представлялось, эффект ослабления боли, поскольку ответные реакции в виде вздрагиваний, отмеченные в случае композиций с различными pH, были схожими. Как объяснено раньше, это очень полезно при разработке лекарственных продуктов в виде биопрепаратов, поскольку это позволяет разработчикам рецептур задать другие параметры, такие как pH композиции, физическая стабильность и уровни агрегатов (которые, возможно, связаны с рисками иммуногенности), первостепенной важности в части принятия решения в отношении композиции.

Число вздрагиваний лапы от боли в течение 0-10 минут после инъекции в случае инъекций плацебо:

Однофакторный дисперсионный анализ: солевой раствор; 5,2; 6; 7; капсаицин
Источник	DF	SS	MS	F	P
Показатель	4	12241	3060	12,41	0,000
Отклонение	20	4933	247
Сумма	24	17174

S=15,70 R-Sq=71,28 R-Sq (скорректированный)=65,53%

В заключение, представленные выше данные вне всякого сомнения демонстрируют преимущества композиций с составляющей 100 мг/мл концентрацией адалимумаба, заключающиеся в том, что эти вязкие растворы с высокой концентрацией белка можно вводит в меньших объемах по всему диапазону рН без уменьшения переносимости и/или увеличения ощущений боли.

Включение посредством ссылки

Содержания всех приведенных ссылок (включающих, например, литературные ссылки, патенты, заявки на патенты и Web-сайты), которые могут быть приведены на всем протяжении этой заявки, включены, таким образом, в словесной форме посредством ссылки в их полном объеме для любой цели. При осуществлении на практике настоящего изобретения будут применяться, если не указано иное, общепринятые методы составления композиций белков, которые широко известны в данной области техники.

Эквиваленты

Настоящее изобретение может быть реализовано в других конкретных формах без отступа от его сущности или существенных характеристик. Поэтому вышеизложенные варианты осуществления должны считаться во всех отношениях иллюстративными, а не ограничением описанного здесь изобретения. Таким образом, объем настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения, а не вышеприведенным описанием, и поэтому предполагается, что сюда включены все изменения, которые попадают под значение и в зону эквивалентности притязаний.

1. Жидкая фармацевтическая композиция для лечения нарушения, при котором активность TNF-альфа является вредной, причем указанная композиция имеет pH от около 5,0 до 6,4 и включает приблизительно 35-55 мг/мл полиола и приблизительно 40-200 мг/мл антитела человека против TNF-альфа, где антитело содержит легкую цепь, включающую CDR3-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 3, CDR2-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 5, и CDR1-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 7, и содержит тяжелую цепь, включающую CDR3-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 4, CDR2-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 6, и CDR1-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 8,
причем композиция не содержит наполнитель NaCl.

2. Композиция по п. 1, которая включает приблизительно 35-50 мг/мл полиола.

3. Композиция по п. 1, которая включает приблизительно 40-50 мг/мл полиола.

4. Композиция по п. 1, которая включает приблизительно 40-45 мг/мл полиола.

5. Композиция по п. 1, в которой полиолом является сахароспирт.

6. Композиция по п. 5, в которой сахароспиртом является маннит или сорбит.

7. Композиция по п. 1, в которой антителом человека является IgG1 каппа антитело человека.

8. Композиция по п. 1, в которой легкая цепь антитела человека включает аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 1, а тяжелая цепь антитела человека включает аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 2.

9. Композиция по п. 1, в которой антителом является адалимумаб.

10. Жидкая фармацевтическая композиция для лечения нарушения, при котором активность TNF-альфа является вредной, причем указанная композиция имеет pH от приблизительно 5,0 до 6,4 и включает приблизительно 40-200 мг/мл антитела человека против TNF-альфа и приблизительно 35-55 мг/мл полиола,
где указанное антитело включает легкую цепь, включающую CDR3-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 3, CDR2-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 5, и CDR1-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 7, и включает тяжелую цепь, включающую CDR3-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 4, CDR2-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 6, и CDR1-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 8,
и где композиция не содержит NaCl и имеет мутность приблизительно 20-60 NTU (нефелометрических единиц мутности) согласно стандартному исследованию напряжения от перемешивания в течение 24 часов.

11. Жидкая фармацевтическая композиция для лечения нарушения, при котором активность TNF-альфа является вредной, причем указанная композиция имеет pH от приблизительно 5,0 до 6,4 и включает приблизительно 40-200 мг/мл антитела человека против TNF-альфа и приблизительно 35-55 мг/мл полиола,
где указанное антитело включает легкую цепь, включающую CDR3-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 3, CDR2-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 5, и CDR1-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 7, и включает тяжелую цепь, включающую CDR3-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 4, CDR2-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 6, и CDR1-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 8, и
где композиция не содержит NaCl и имеет мутность приблизительно 35-100 NTU согласно стандартному исследованию напряжения от перемешивания в течение 48 часов.

12. Жидкая фармацевтическая композиция для лечения нарушения, при котором активность TNF-альфа является вредной, причем указанная композиция имеет pH от приблизительно 5,0 до 6,4 и включает приблизительно 40-200 мг/мл антитела человека против TNF-альфа и приблизительно 35-55 мг/мл полиола, где антитело включает легкую цепь, включающую CDR3-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 3, CDR2-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 5, и CDR1-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 7, и включает тяжелую цепь, включающую CDR3-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 4, CDR2-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 6, и CDR1-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 8, и
где композиция не содержит NaCl и имеет мутность приблизительно 20-40 NTU после хранения в течение 3 месяцев при 5°C, 25°C или 40°C.

13. Композиция по любому из пп. 10-12, которая включает приблизительно 35-50 мг/мл полиола.

14. Композиция по любому из пп. 10-12, которая включает приблизительно 40-50 мг/мл полиола.

15. Композиция по любому из пп. 10-12, которая включает приблизительно 40-45 мг/мл полиола.

16. Композиция по любому из пп. 10-12, в которой полиолом является сахароспирт.

17. Композиция по п. 16, в которой сахароспиртом является маннит или сорбит.

18. Композиция по любому из пп. 10-12, pH которой составляет либо приблизительно 5,0-5,4, либо приблизительно 5,8-6,4.

19. Композиция по любому из пп. 10-12, содержащая менее чем приблизительно 1% агрегированного белка.

20. Композиция по любому из пп. 10-12, в которой антителом человека является IgG1 каппа антитело человека.

21. Композиция по любому из пп. 10-12, в которой легкая цепь антитела человека включает аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 1, а тяжелая цепь антитела человека включает аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 2.

22. Композиция по любому из пп. 10-12, в которой антителом является адалимумаб.

23. Жидкая фармацевтическая композиция для лечения нарушения, при котором активность TNF-альфа является вредной, причем указанная композиция включает приблизительно 40-200 мг/мл антитела человека против TNF-альфа, которое включает легкую цепь, включающую CDR3-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 3, СDR2-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 5, и CDR1-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 7, и тяжелую цепь, включающую CDR3-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 4, CDR2-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 6, и CDR1-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 8;
приблизительно 35-55 мг/мл сахароспирта;
приблизительно 0,1-2,0 мг/мл поверхностно-активного вещества;
приблизительно 1,15-1,45 мг/мл лимонной кислоты * H₂O;
приблизительно 0,2-0,4 мг/мл дигидрата цитрата натрия;
приблизительно 1,35-1,75 мг/мл Na₂HPO₄*2H₂O;
приблизительно 0,75-0,95 мг/мл NaH₂PO₄*2H₂O,
причем композиция имеет pH от приблизительно 4,7 до 6,5 и не включает NaCl.

24. Композиция по п. 23, в которой сахароспиртом является либо манит, либо сорбит.

25. Композиция по п. 24, включающая приблизительно 40-45 мг/мл либо маннита, либо сорбита.

26. Композиция по п. 23, в которой поверхностно-активным веществом является полисорбат 80.

27. Композиция по п. 26, включающая приблизительно 1 мг/мл полисорбата 80.

28. Композиция по п. 23, включающая приблизительно 1,30-1,31 мг/мл лимонной кислоты * H₂O.

29. Композиция по п. 23, включающая приблизительно 0,30-0,31 мг/мл дигидрата цитрата натрия.

30. Композиция по п. 23, включающая приблизительно 1,50-1,56 мг/мл Na₂HPO₄*2H₂O.

31. Композиция по п. 23, включающая приблизительно 0,83-0,89 мг/мл NaH₂PO₄*2H₂O.

32. Композиция по п. 23, pH которой составляет приблизительно 5,2.

33. Композиция по п. 23, pH которой составляет приблизительно 6,0.

34. Композиция по п. 23, в которой антителом человека является IgG1 каппа антитело человека.

35. Композиция по п. 23, в которой легкая цепь антитела человека включает аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 1, а тяжелая цепь антитела человека включает аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 2.

36. Композиция по п. 23, в которой антителом является адалимумаб.

37. Композиция по любому из пп. 1, 10-12 и 23, которая подходит для подкожного введения.

38. Способ лечения нарушения, связанного с вредной активностью TNF-альфа, у субъекта, включающий введение субъекту композиции по любому из пп. 1, 10-12 и 23.

39. Жидкая фармацевтическая композиция для лечения нарушения, при котором активность TNF-альфа является вредной, причем указанная композиция имеет pH от приблизительно 5,0 до 6,4 и включает
приблизительно 35-55 мг/мл полиола,
приблизительно 40-200 мг/мл антитела человека против TNF-альфа, и
приблизительно 0,01-300 мМ NaCl,
где антитело против TNF-альфа включает легкую цепь, включающую CDR3-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 3, CDR2-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 5, и CDR1-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 7; и включает тяжелую цепь, включающую CDR3-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 4, CDR2-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 6, и CDR1-домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 8.

40. Композиция по п. 39, где антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 1, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 2.

41. Композиция по п. 39, где антитело представляет собой адалимумаб.

42. Композиция по п. 39, где полиол представляет собой сахароспирт.

43. Композиция по п. 42, где сахароспирт представляет собой маннит или сорбит.

44. Композиция по любому из пп. 1, 10-12 и 39, дополнительно содержащая поверхностно-активное вещество.

45. Композиция по п. 44, где поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат.

46. Композиция по п. 45, где полисорбат представляет собой полисорбат 80.

47. Композиция по п. 46, содержащая 1 мг/мл полисорбата 80.

48. Композиция по любому из пп. 1, 10-12 и 39, дополнительно содержащая буффер, выбранный из группы, состоящей из цитратного и фосфатного буфера, ацетатного буфера, сукцинатного буфера и гистидинового буфера.

49. Композиция по любому из пп. 1-9, где состав имеет менее чем приблизительно 1% агрегированного антитела после 12 месяцев хранения при 5°C в жидком состоянии.