Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора н комплемента человека

Группа изобретений относится к медицинской иммунологии, а именно к способу определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах, а также набору для определения функциональной активности фактора Н комплемента человека. Сущность изобретения состоит в том, что в лунках микропанели сорбируют IgG антитела к фактору Н, затем вносят в лунки микропанели пробу, содержащую определяемый функционально активный фактор H, проводят инкубацию, во время которой происходит иммунохимическое связывание фактора Н с антителами на поверхности лунок, затем после промывки лунок вносят в лунки микропанели препарат компонента С3 и после очередной инкубации и промывки лунок определяют количество связавшегося компонента С3 с активными молекулами фактора Н с помощью конъюгата антител против С3 с ферментом и хромогенного субстрата для этого фермента. Расчет активности фактора Н проводят по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции. Группа изобретений позволяет определять функциональную активность фактора Н комплемента человека и обладает хорошей воспроизводимостью результатов. 1 ил., 1 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Фактор Н принадлежит к белкам системы комплемента с концентрацией в сыворотке крови 400-800 мкг/мл. Функция его состоит в регуляции активации альтернативного пути комплемента. Отсутствие в плазме крови достаточной активности этого фактора приводит к нерегулируемой спонтанной активации комплемента с развитием воспаления и поражения собственных тканей организма. Заболевания, связанные с дефицитом активного фактора Н, включают поражения почек: атипичный гемолитикоуремический синдром [1], мембранопролиферативный гломерулонефрит [2], а также глаз - возрастная макулярная дегенерация [3]. Дефицит активности фактора Н может быть обусловлен либо пониженной продукцией активного белка, либо продукцией его мутантных форм [1-3]. Мутации затрагивают, как правило, участки молекулы фактора H, ответственные за связывание фрагмента C3b третьего компонента комплемента. Важным функциональным свойством фактора H является способность связываться с этим фрагментом, поскольку фактор Н является кофактором протеолитического расщепления C3b фактором I, которое необходимо для регуляции образования С5-конвертазы - основного фермента, ответственного за воспаление и лизис клеток. Таким образом, определение активности фактора Н (в частности, по его способности связывать C3b) необходимо для диагностики ряда тяжелых заболеваний и выявления их причины.

Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови, а также их функциональной активности является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. Для количественного определения содержания фактора Н в сыворотке крови имеются коммерческие ИФА системы. Однако определение функциональной активности фактора Н в литературе не описано.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа иммуноферментного определения функциональной активности фактора Н комплемента человека.

Поставленная задача достигается путем разработки иммуноферментного способа и набора для иммуноферментного определения функциональной активности фактора Н комплемента человека, который предусматривает: сорбцию в лунках микропанели IgG антител к фактору Н, внесение в лунки микропанели образцов проб, содержащих определяемый функционально активный фактор H, проведение инкубации, во время которой происходит иммунохимическое связывание фактора Н с антителами на поверхности лунок, затем после промывки лунок внесение в лунки микропанели препарата компонента С3 [4], неизбежно содержащего фрагмент C3b, а также «C3b-подобный» белок - С3(H2O) [5, 6], образующиеся в результате спонтанной инактивации компонента С3, и после очередной промывки лунок определение количества связавшегося компонента C3b с активными молекулами фактора H на поверхности лунок с помощью конъюгата антител против С3 с ферментом и хромогенного субстрата для этого фермента. Метод основан на способности функционально активного фактора Н связываться с C3b или С3(H2O) [6].

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка иммуноферментного способа и набора для определения функциональной активности фактора Н, позволяющих при сравнении с результатами количественного определения содержания фактора Н в тех же образцах диагностировать наличие мутантных форм этого белка с измененной функциональной активностью.

Пример 1. Способ иммуноферментного определения функциональной активности фактора Н комплемента человека.

IgG-антитела к фактору Н в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5, с конечной концентрацией 15-50 мкг/мл, вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°С. Три раза отмывают планшет фосфатным буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, (ЗФР) по 250 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В каждую лунку планшета вносят по 100 мкл раствора, содержащего определяемый фактор Н в подходящем разведении в ЗФР. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, трехкратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 M NaCl и 0,05% Твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл препарата компонента С3 человека, в концентрации 50 мкг/мл в ЗФР. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, трехкратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата антител против С3 с пероксидазой. По окончании инкубации в течение 1 ч при 37°С удаляют содержимое лунок и промывают пять раз по 200 мкл буфером ЗФР-Твин. Вносят в каждую лунку по 100 мкл субстратного буфера (3,3′,5,5′-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 15-30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Количество активного фактора Н рассчитывают по стандартной кривой (рис. 1). На рис.1 представлено определение функциональной активности фактора H комплемента человека методом иммуноферментного анализа.

Пример 2. Набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора H.

Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированными антителами к фактору Н, препарат компонента С3 комплемента человека, конъюгат фермента с антителами к компоненту С3 комплемента человека, субстратный буфер и стандарт с известной активностью фактора H человека. Данный набор используется в соответствии с примером 1.

Из приведенных на рисунке результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно зависит от концентрации активного фактора Н с коэффициентом корреляции R2=0,99, что позволяет достоверно определять функциональную активность фактора H заявленным способом в концентрациях от 5 нг/мл с использованием описанного набора.

Кроме того, для проверки адекватности метода было проведено сравнение активностей фактора Н в сыворотках крови 6 пациентов, у четырех из которых генетическими исследованиями были выявлены мутации фактора Н, и в пуле 10 сывороток здоровых доноров крови. Определение количественного содержания фактора Н во всех исследованных сыворотках было проведено с использованием коммерческой тест-системы («Фактор Н системы комплемента, кат. номер HK342-01» - Набор реагентов для количественного определения фактора Н системы комплемента методом иммуноферментного анализа, БИОХИММАК, Москва). Во всех сыворотках количество фактора Н было примерно одинаково и составляло 790±180 мкг/мл.

Результаты определений приведены в таблице 1. Как следует из данных таблицы, низкая активность фактора Н была обнаружена только в сыворотках крови, содержащих мутантный фактор Н.

Таблица 1. Определение активности фактора Н в сыворотках крови пациентов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Westra D., Vernon K.A., Volokhina E.B., Pickering M.C., van de Kar N.C., van den Heuvel L.P. Atypical hemolytic uremic syndrome and genetic aberrations in the complement factor H-related 5 gene // J. Hum. Genet. 2012. V. 57. P. 459-464.

2. Wong E.K., Anderson H.E., Herbert A.P., Challis R.C., Brown P., Reis G.S., Tellez J.O., Strain L., Fluck N., Humphrey A., Macleod A., Richards A., Ahlert D., Santibanez-Koref M., Barlow P.N., Marchbank K.J., Harris C.L., Goodship Т.Н., Kavanagh D. Characterization of a Factor H Mutation That Perturbs the Alternative Pathway of Complement in a Family with Membranoproliferative GN // J. Am. Soc. Nephrol. 2014. Apr 10. [Epub ahead of print].

3. Hoffman J.D., Cooke Bailey J.N., D'Aoust L.N., Cade W., Ayala-Haedo J., Fuzzell M.D., Laux R.A., Adams L., Reinhart-Mercer L., Caywood L., Whitehead-Gay P., Agarwal A., Wang G., Scott W.K., Pericak-Vance M., Haines J.L. Rare Complement Factor H Variant Associated with Age-related Macular Degeneration in the Amish // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2014. Jun 6. pii: IOVS-13-13684. doi: 10.1167 / iovs. 13-13684. [Epub ahead of print].

4. Козлов Л.В., Дьяков В.Л., Мишин А.А., Гузова В.А., Баталова Т.Н., Лысакова С.В. Способ получения компонента С3 комплемента человека. Патент РФ №2144365. 20.01.2000. Бюл. №2.

5. Andersson J., Ekdahl K.N., Larsson R., Nilsson U.R., Nilsson В. С3 Adsorbed to a Polymer Surface Can Form an Initiating Alternative Pathway // J. Immunology. 2002. V. 168. P. 5786-5791.

6. Oran A.E., Isenman D.E. Identification of residues within the 727-767 segment of human complement component C3 important for its interaction with factor H and with complement receptor 1 (CR1, CD35) // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 5120-5130.

1. Способ иммуноферментного определения функциональной активности фактора H комплемента человека, отличающийся тем, что сорбируют в лунках микропанели IgG-антитела к фактору Н, затем в лунки вносят анализируемую пробу, содержащую фактор Н с неизвестной активностью, проводят инкубацию, в процессе которой фактор Н связывается с сорбированными в лунках микропанели IgG-антителами, выливают содержимое лунок, а затем вносят в них препарат компонента С3 человека и после инкубации и отмывки определяют количество связавшегося С3 с помощью конъюгата фермента с антителами к компоненту С3 и субстратного буфера для этого фермента, после чего проводят расчет активности фактора Н по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.

2. Набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора Н комплемента человека, связанного с сорбированными в лунках микропанели антителами к нему, отличающийся тем, что он содержит плоскодонную микропанель с сорбированными антителами к фактору Н, препарат компонента С3 человека, конъюгат фермента с антителами к компоненту С3 человека, субстратный буфер и стандарт для расчета активности фактора Н.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для повышения репродуктивной способности американской норки Standard (+/+ +/+) и жизнеспособности ее приплода.

Изобретение относится к медицине, хирургии. Осуществляют реконструкцию молочной железы.

Изобретение относится к медицине, а именно к профилактике вредных эффектов токсического и генотоксического действия наночастиц оксида меди на организм. Способ заключается в том, что лицам, относящимся к группе риска, назначают комплекс биологически активных препаратов, включающий глютаминовую кислоту, глицин, цистеин, пектиновый энтеросорбент, препарат рыбьего жира, богатый неэстерифицированными жирными кислотами класса омега-3, а также поливитаминно-полиминеральный комплекс, содержащий такие биомикроэлементы, как молибден, марганец, цинк и железо, причем лица группы риска принимают препараты комплекса повторными курсами 1-2 раза в год в течение 4-6-недель ежедневно в дозах, обеспечивающих получение в день 300 мг глицина, 600 мг цистеина, 4 г глутаминовой кислоты, 25 мл рыбьего жира с 12-15%-ным содержанием неэстерифицированных жирных кислот класса омега-3, 4-5 г пектина, а также микроэлементы и витамины в дозах, обеспечивающих нормальные физиологические потребности организма.
Представленное изобретение относится к области ветеринарии и касается средства для профилактики мастита у коров в период лактации. Охарактеризованное решение содержит в качестве пробиотических бактерий для обработки сосков после доения пробиотические штаммы Bacillus subtilis - B-5225 (1×108) 4 мас.%, Enterococcus faecium СТФ 1/56 (1×108) 4 мас.%, глицерин (2 мас.%) и стерильную воду 90%.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для лечения урогенитальных микоплазмозов собак. Способ включает подкожное введение антибактериального препарата энроксил 5% в дозе 0,1 мл/кг ежедневно 1 раз в день в течение 7 дней и внутримышечное введение гомеопатического препарата оваринин в дозе 1 мл/кг 1 раз в 4 дня, 4-кратно.

Изобретение относится к новым (R)-стереоизомерам замещенных 2-тиоксо-имидазолидин-4-онов формулы 1 или их спироаналогам, которые обладают свойствами антагониста андрогенового рецептора, к вариантам способа их получения и к промежуточным соединениям 2.1-.2.4 для получения соединений формулы 1.
Группа изобретений относится к медицине, а именно к способу лечения или профилактики эпилепсии. Для этого пациенту со сниженной концентрацией BDNF в сыворотке и/или плазме крови вводят рекомбинантный интерлейкин-2 человека.

Изобретение относится к медицине, а именно к фотосенсибилизаторам для фотодинамической терапии. Предложено применение мезо-тетра(3-пиридил)бактериохлорина структурной формулы (I) в качестве фотосенсибилизатора в ближней ИК области спектра для фотодинамической терапии.

Изобретение относится к медицине - консервированию гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) человека. Проводят вскрытие флакона криопротектора в ламинарном боксе, заправку криопротектора в специальный шприц шприцевого насоса, введение ограждающего раствора криопротектора - 55% диметилсульфоксида с 5% декстран 40 при температуре +4°C во взвесь ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками в криопакете с концентратом и одновременное механическое перемешивание в аппарате для перемешивания, перенос системы вместе с флаконом криопротектора в ламинарный бокс, выпуск воздуха из криопакета и части взвеси, запайку и помещение его в термоусадочный пакет и осуществление программного многоэтапного замораживания, на первом этапе которого смесь взвеси со стволовыми клетками и криопротектором - образец замораживания - выдерживают 10 мин при температуре +4°C, на втором этапе охлаждают со скоростью 1°C/мин до температуры -12°C, на третьем этапе охлаждают со скоростью 20°C/мин до температуры -60°C, на четвертом этапе нагревают образец со скоростью 10°C/мин до температуры -18°C, на пятом этапе охлаждают образец со скоростью 1°C/мин до -60°C и в конце программы замораживания образец охлаждают со скоростью 3°C/мин до температуры -100°C, после замораживания образец помещают в карантинный дьюар с жидким азотом, до определения результатов тестов на инфекционные агенты и бактериологическую грибковую контаминацию.

Изобретение относится к медицине, в частности к онкоурологии, и может быть использовано при консервативном лечении больных злокачественной опухолью предстательной железы на разных ее стадиях.

Изобретение относится к биохимии. Описаны способы определения наличия или метастазов опухоли, скрининга наличия опухоли среди популяции высокого риска, прогноза для пациента, имеющего опухоль, определения эффективности хирургического вмешательства, радиационной терапии или химиотерапии. Способы включают обнаружение уровня полипептида с указанной последовательностью в плазме с помощью антитела, где Thr90 полипептида является фосфорилированным. Также описаны диагностические наборы для определения наличия метастазов опухоли, для скрининга наличия опухоли среди популяции высокого риска, для определения прогноза для пациента, для определения эффективности хирургического вмешательства, радиационной терапии или химиотерапии в отношении пациента, имеющего опухоль, и/или определения того, когда лечение должно быть прекращено. Диагностические наборы включают полипептид с приведенной в материалах последовательностью, где Thr90 полипептида является фосфорилированным. 12 н. и 15 з.п. ф-лы, 20 ил., 18 пр.

Изобретение относится к медицине, хирургии. Выполняют уретропластику у детей с проксимальными формами гипоспадии. Для замещения дефекта уретры используют имплантат из подложки биоматрикса из желатиновой губки с культивированными на одной ее стороне аллогенными мезенхимальными стромальными клетками человека в концентрации не менее 0,1·105 кл./см2, на другой - суспензии аутологичных кератиноцитов в концентрации 2·105 кл./см2. На вентральной поверхности мошонки в области без волосяных фолликулов выполняют U-образный разрез, окаймляющий меатальное отверстие. Дистальные концы разреза соответствуют пено-скротальному углу. Осуществляют мобилизацию мягких тканей вглубь до эректильной ткани собственной уретры без вскрытия белочной оболочки. Устанавливают уретральный катетер 10Ch. Прямоугольный лоскут имплантата укладывают кератиноцитами в сторону катетера, фиксируют узловыми швами. Мягкие ткани ушивают над артифициальной уретрой. На область промежности накладывают давящую повязку на 24 часа. Способ позволяет восстановить дефект уретры, минимизирует риск послеоперационных осложнений за счет применения клеточного имплантата. 10 ил., 3 пр.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к средству для лечения и профилактики гастрита и язвенной болезни желудка. Средство для лечения и профилактики гастрита и язвенной болезни желудка, содержащее водный экстракт полыни горькой, плодов шиповника, травы тысячелистника и почек сосны, а также мед майский, сок алоэ, растительный экстракт бефунгина, коньяк, при этом оно выполнено в виде суспензионно-эмульсионной композиции с размером частиц дисперсной фазы, не превышающих 0,1 мм, кроме того, оно дополнительно содержит масло авокадо, масло льна, водный экстракт корня алтея и семян льна. Средство обладает повышенной эффективностью воздействия за счет снижения скорости вывода средства из организма человека, уменьшает неприятные ощущения у пациентов, имеющих воспаленные ткани. 3 пр.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к средству в форме суппозитория, которое применяется для лечения геморрагической анемии, которое содержит в качестве действующих веществ альбумин и экстракт прополиса 10%-ный спиртовой, в качестве основы твердый жир типа А, лутрол F68, при определенном соотношении компонентов. Вышеописанное средство обеспечивает восстановление онкотического, коллоидного давления крови при лечении геморрагической анемии, обладает репаративным, противовоспалительным, спазмолитическим, антибактериальным действием с равномерным высвобождением действующих веществ, удобно для применения больными самостоятельно. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл., 6 пр.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к средству для эндоэкологической реабилитации, включающему листья смородины черной, листья или плоды расторопши и прополис в цельном или нативном виде при определенном соотношении компонентов. Вышеописанное средство характеризуется повышенным иммуномодулирующим и противовирусным эффектом. 1 пр.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Enterococcus faecium Ef79OSAU, обладающий антагонистической активностью в отношении бактерий рода Listeria и вида Enterococcus faecalis, депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры человека (ГКНМ) ФБУН «МНИИЭМ им Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» под регистрационным номером-1251 и может быть использован для приготовления пробиотических препаратов. Изобретение позволяет повысить антагонистическую активность в отношении бактерий рода Listeria и вида Enterococcus faecalis. 3 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для повышения активности обменных процессов и иммунитета у животных. Средство содержит мед натуральный, гидролизат пчелиной пыльцы, гидролизат мышечной ткани норок, теотропин, воду дистиллированную при следующем соотношении компонентов, г/100 мл: мед натуральный 25,0±2,5; гидролизат пчелиной пыльцы 2,5±0,25; гидролизат мышечной ткани норок 12,5±1,25; теотропин 0,1±0,0; вода дистиллированная - остальное. Заявленное средство высокоэффективно для повышения активности обменных процессов и иммунитета у животных. 4 табл., 3 пр.
Изобретение относится к биохимии. Раскрыт способ культивирования опухолевых стволовых клеток глиобластомы. Способ включает отбор таких клеток, высевание и инкубирование в культуральном сосуде. Отбирают не менее 0,5 г материала глиобластомы, который измельчают до кусочков размером не более 5×5×5 мм, которым не дают подсыхать. Далее выделяют из отобранного материала опухолевые стволовые клетки и их осаждают. Затем смешивают со средой для культивирования клеток млекопитающих, ресуспендируют клетки и высаживают в культуральные флаконы. Осуществляют культивирование до образования монослоя. Затем осуществляют ферментативную диссоциацию в течение 10 мин при 37°C посредством 0,05% трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты, добавляемой в соотношении 1:4, центрифугирование в течение 3 мин при 1200 об/мин. После этого добавляют свежую среду, ресуспендируют, повторно культивируют с использованием клеточных суспензий, содержащих не менее чем 85-95% жизнеспособных клеток, и обрабатывают флуоресцентным маркером, флуоресцирующим при ультрафиолетовом излучении. Изобретение может быть использовано при лабораторной доклинической молекулярно-биологической оценке терапевтической эффективности противоопухолевого препарата, полученного путем целенаправленной модификации транскриптомного профиля гемопоэтических стволовых и прогенеторных клеток (СК и ПК), используемых для проведения высокотехнологичного комплексного лечения предпочтительно злокачественных глиальных опухолей головного мозга. 3 з.п. ф-лы, 2 пр.

Предложены рекомбинантный аденовирус, фармацевтическая композиция, содержащая такой вирус, и способ лечения рака с использованием такого вируса или композиции. Охарактеризованный рекомбинантный аденовирус содержит полинуклеотид, кодирующий комплекс рибозима, опосредующего транс-сплайсинг, и HSVtk (тимидинкиназы вируса простого герпеса человека), где рибозим, опосредующий транс-сплайсинг, представляет собой рибозим Rib67, и где мишенью рибозима, опосредующего транс-сплайсинг, является мРНК гена рак-специфичной TERT (обратной транскриптазы теломеразы) и противораковый терапевтический ген, кодирующий sPD-1 (растворимый белок программируемой гибели 1). Рекомбинантный аденовирус обладает селективностью в отношении раковых клеток, обусловленной рибозимом, опосредующим транс-сплайсинг, и повышенной противораковой активностью, обусловленной противораковым терапевтическим геном. Представленные изобретения могут быть использованы для эффективных профилактики и лечения рака. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 23 ил., 13 пр.

Изобретение относится к конъюгатам аматоксина и мишень-связывающего фрагмента, например антитела, соединенных связями определенного типа, которые применимы в лечении рака, и к фармацевтическим композициям, включающим такие конъюгаты. 5 н. и 20 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 пр.

Группа изобретений относится к медицинской иммунологии, а именно к способу определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах, а также набору для определения функциональной активности фактора Н комплемента человека. Сущность изобретения состоит в том, что в лунках микропанели сорбируют IgG антитела к фактору Н, затем вносят в лунки микропанели пробу, содержащую определяемый функционально активный фактор H, проводят инкубацию, во время которой происходит иммунохимическое связывание фактора Н с антителами на поверхности лунок, затем после промывки лунок вносят в лунки микропанели препарат компонента С3 и после очередной инкубации и промывки лунок определяют количество связавшегося компонента С3 с активными молекулами фактора Н с помощью конъюгата антител против С3 с ферментом и хромогенного субстрата для этого фермента. Расчет активности фактора Н проводят по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции. Группа изобретений позволяет определять функциональную активность фактора Н комплемента человека и обладает хорошей воспроизводимостью результатов. 1 ил., 1 табл., 2 пр.

Наверх