Штамм o №2108/забайкальский/2010 вируса ящура aphtae epizooticae типа о для изготовления биопрепаратов для диагностики ящура типа о



Штамм o №2108/забайкальский/2010 вируса ящура aphtae epizooticae типа о для изготовления биопрепаратов для диагностики ящура типа о
Штамм o №2108/забайкальский/2010 вируса ящура aphtae epizooticae типа о для изготовления биопрепаратов для диагностики ящура типа о
Штамм o №2108/забайкальский/2010 вируса ящура aphtae epizooticae типа о для изготовления биопрепаратов для диагностики ящура типа о
Штамм o №2108/забайкальский/2010 вируса ящура aphtae epizooticae типа о для изготовления биопрепаратов для диагностики ящура типа о
Штамм o №2108/забайкальский/2010 вируса ящура aphtae epizooticae типа о для изготовления биопрепаратов для диагностики ящура типа о
Штамм o №2108/забайкальский/2010 вируса ящура aphtae epizooticae типа о для изготовления биопрепаратов для диагностики ящура типа о
Штамм o №2108/забайкальский/2010 вируса ящура aphtae epizooticae типа о для изготовления биопрепаратов для диагностики ящура типа о
Штамм o №2108/забайкальский/2010 вируса ящура aphtae epizooticae типа о для изготовления биопрепаратов для диагностики ящура типа о
Штамм o №2108/забайкальский/2010 вируса ящура aphtae epizooticae типа о для изготовления биопрепаратов для диагностики ящура типа о
Штамм o №2108/забайкальский/2010 вируса ящура aphtae epizooticae типа о для изготовления биопрепаратов для диагностики ящура типа о

 


Владельцы патента RU 2575801:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") (RU)

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается нового штамма вируса ящура Aphtae epizooticae типа О сем. Picornaviridae, рода Aphtovirus, депонированного в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером вирус ящура штамм О №2108/Забайкальский/2010. Представленный штамм репродуцируется в первично трипсинизированной монослойной культуре клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30) и почки свиньи (IB-RS-2). В течение 18-24 часов инкубирования урожай вируса в указанных культурах клеток достигает значений 6,25-6,75 lg ТЦД50/см3. При высокой множественности заражения (1-10 ТЦД/клетка) вызывает ЦПД через 5 часов, сохраняя исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 10 пассажей. Представленный штамм может быть использован для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики ящура типа О. 4 з.п. ф-лы, 1 ил., 7 табл., 4 пр.

 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к новому штамму вируса ящура Aphtae epizooticae, и может быть использовано при разработке и изготовлении средств диагностики ящура типа О, а также для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин.

Ящур является одним из самых опасных в эпизоотическом и экономическом отношении вирусных заболеваний сельскохозяйственных и диких парнокопытных животных. Его опасность обусловлена высокой контагиозностью, изменчивостью и генетическим разнообразием возбудителя, множественностью путей передачи инфекции, узкой специфичностью приобретенного иммунитета, ограничивающегося рамками определенного серотипа, и способностью вируса поражать различные виды животных [1, 2].

Экономический ущерб при ящуре складывается из потерь от гибели и вынужденного убоя больных животных, уничтожения контаминированной продукции, снижения продуктивности зараженных животных, затрат на вакцинопрофилактику, карантинирование, ветеринарно-санитарные меры, направленные на ликвидацию вспышек заболевания.

Ситуацию осложняют бессимптомные формы течения болезни, длительное вирусоносительство даже среди высокоиммунных животных, а также целый ряд встречающихся клинически сходных болезней вирусной этиологии [3].

Устойчивое благополучие, достигнутое в стране, не гарантирует от спорадических вспышек заболеваний, связанных с заносом возбудителя на животноводческие фермы из сопредельных государств, энзоотичных по ящуру [4]·

Возбудителем заболевания является вирус ящура, который относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtoviras, имеет 7 серотипов: А, О, С, Азия, Sat1, Sat-2, Sat-3 и множество антигенных вариантов [2].

Возбудитель ящура обладает значительной антигенной вариабельностью штаммов в пределах одного серотипа, которая выявляется в различные временные промежутки и на разных территориях и зависит от видового состава восприимчивого поголовья, его иммунного статуса и множества других различных факторов. Антигенная изменчивость вируса ящура обусловлена заменами аминокислот в полипептидных фрагментах (антигенных эпитопах), экспонированных на поверхности капсидных белков [2, 5].

Сдвиги антигенного спектра, соответствующие обновлению структуры нового полевого штамма, могут варьировать от незначительных, улавливаемых молекулярно-биологическими исследованиями, до существенных, регистрируемых серологическими методами с помощью традиционных поликлональных иммуноглобулинов. Существенные изменения антигенных характеристик природного штамма с большой вероятностью вызывают ослабление специфического иммунитета, индуцированного негомологичным антигеном. Они вызывают также затруднения штаммоспецифической диагностики.

В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики.

Во второй половине 20 века в качестве производственных штаммов вируса ящура типа О на территории России использовали: штамм О1 №1618 Чечено-Ингушский, выделенный в 1966 году; Ο1 №194, выделенный в 1957 году в Волгоградской области. Указанные штаммы использовали для получения диагностикумов и противоящурных вакцин, применявшихся около полувека, в настоящее время поддерживаются в коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ».

В начале 21 века были получены штамм типа О №1736/Абхазия/2000, выделенный от КРС в Гальском районе Абхазии, О №1964/Монголия/2004, выделенный от КРС в феврале 2004 г. в Восточно-гобийском аймаке Монголии, для изготовления диагностических и вакцинных препаратов [6].

В апреле 2000 г. на территории РФ в Приморском крае в ОПХ «Степное» с. Элитное Уссурийского района от свиней был выделен изолят, из которого получен штамм типа О №1734 «Приморский-2000» [7, 8].

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм типа О №1734 «Приморский-2000» принадлежит к Паназиатской генетической линии вируса ящура типа О. Паназиатский вирус вызвал пандемию ящура в 1999-2000 годах в большинстве стран Азии, в том числе во Вьетнаме, Японии, Корее, Монголии, а также Армении и Грузии. Опустошительная эпизоотия ящура в Великобритании в 2001 г. также была вызвана паназиатским вирусом. Исследуемый вирус имеет наиболее высокий уровень гомологии (98,74%) с изолятами О Вьетнам/99 и О Тайвань/99. Установлено, что изолят О №1734 «Приморский-2000» отличается от всех выделенных ранее изолятов, в том числе и от штаммов Ο1 №194 и Ο1 №1618, используемых для изготовления средств диагностики и специфической профилактики.

Производственный штамм №1734 «Приморский-2000» использовался в Российской Федерации в качестве производственного при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики, применяемых на всей территории России и в странах-членах СНГ.

В 2010 г. в Японии, Южной Корее, Гонконге и континентальном Китае вспышки ящура типа О были вызваны вирусом топотипа Юго-Восточная Азия, относящимся к генетической линии Муа-98 [9].

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм №1734 "Приморский-2000" вируса ящура типа О для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

Недостатки известных штаммов, в том числе и штамма-прототипа, состоят в антигенных отличиях от изолятов вируса ящура типа О, выделенных в различные временные промежутки, а приготовленные на их основе вакцины обеспечивают эффективную защиту животных только против заражения гомологичным вирусом.

Вспышка ящура на территории РФ была отмечена в августе 2010 г. в селе Макарово Шилкинского района в 300 км от границы с Китаем, где не проводилась профилактическая вакцинация животных против ящура типов А, О, Азия-1. Из 95 голов КРС разного возраста, имевшихся у жителей, переболело 100%, из 182 свиней - 52 головы.

В связи с этим возникла необходимость получить новый производственный штамм из эпизоотического вируса ящура серотипа О для обеспечения безопасности территории России и сопредельных государств от этого возбудителя.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в расширении арсенала производственных штаммов вируса ящура серотипа О, обладающих высокой инфекционной и антигенной активностью в нативном виде и сохраняющих антигенную активность после инактивации, пригодных для изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностических препаратов, гомологичных эпизоотическому вирусу, появившемуся на территории России.

Указанная задача решена получением штамма О №2108/Забайкальский/2010 (авторское наименование) вируса ящура для изготовления биопрепаратов для диагностики ящура типа О.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма О №2108/Забайкальский/2010, был выделен в августе 2010 года от больного крупного рогатого скота в с. Макарово Шилкинского района Забайкальского края (экспертиза №2108). Производственный штамм О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О получен путем последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток.

Штамм О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О депонирован 27 февраля 2012 года в Коллекцию штаммов микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») под регистрационным номером (ссылкой): вирус ящура штамм О №2108/Забайкальский/2010 (производственный).

По сравнению со штаммом-прототипом штамм О №2108/Забайкальский/2010 обладает более высокой инфекционной и антигенной активностью в нативном виде и после инактивации.

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа О.

Сущность изобретения пояснена на графическом изображении. Представлена дендрограмма, отражающая филогенетические взаимоотношения штамма О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура серологического типа О. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP 1.

Сущность изобретения пояснена следующим перечнем последовательностей:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP1 штамма О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот гена белка VP1 штамма О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О.

Штамм О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу О и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура относится к серотипу О. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН). При иммунизации КРС вакциной из инактивированного вируса индуцируется образование специфических антител, выявляемых в ИФА и РМН.

При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного штамма типа О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:30 и в ИФА в разведении 1:10000.

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP1 штамма О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура и выведена первичная структура белка VP1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О имеет близкое филогенетическое родство с изолятами, выделенными в Монголии в 2010 г., и значительно отличается от штаммов Ο1 Manisa, О №1734 «Приморский-2000» сублинии PanAsia, а также от вируса топотипа Средний Восток - Южная Азия (ME-SA) сублинии О PanAsia2. Гомология изолятов О №2108/Забайкальский/2010 и О/Монголия/С03/2010 составляет 99,69%.

Таким образом, филогенетический анализ показал, что штамм О №2108/Забайкальский/2010 принадлежит к топотипу Юго-Восточная Азия (SEA) генетической линии Муа-98 вируса ящура серологического типа О, но к другой генетической линии, нежели изоляты из Южной Кореи, Японии, континентального Китая и из поселка Абагайтуй Забайкальского края (июль 2010 г.).

Антигенное родство штамма О №2108/Забайкальский/2010 с производственными штаммами вируса ящура O1 Manisa, Ο1 №1618, О №1734/Приморский/2000 и О PanAsia2 изучено в ИФА и РМН.

Результаты исследований в РМН представлены в таблице 1. Антигенное соответствие (r1) составило для О1 Manisa - 0,33, О №1734 «Приморский-2000» - 0,62, О PanAsia2 - 0,42. При значении r1≥0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического вируса, при значении r2≤0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического вируса [10].

Результаты исследований в ИФА представлены в таблице 2. Антигенное соответствие (r1) составило для Ο1 №1618 - 0,25, О №1734/Приморский/2000 - 0,35, О PanAsia2 - 0,47. При значении r1 - 0,4-1,0 производственный штамм находится в близком антигенном родстве; при значении r1 - 0,2-0,39 - полевой изолят антигенно родственен производственному штамму, вакцина из производственного штамма может быть использована, если не будет найдено более родственного штамма и при условии, что животные будут иммунизированы более 1 раза; при значении r1<0,2 - полевой изолят отличается от производственного штамма, вакцина из которого не приемлема для защиты от заражения полевым вирусом.

Биотехнологические характеристики

Штамм О №2108/Забайкальский/2010 репродуцируется в монослойных культурах клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30) и IB-RS-2. В течение 18-24 часов инкубирования урожай вируса в указанных культурах клеток достигает значений от 6,25 до 6,75 lg ТЦД50/см3. При высокой множественности заражения (1-10 ТЦД/клетка) вызывает ЦПД через 5 часов. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 10 пассажей (срок наблюдения).

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×106Д.

Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×106Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10-18 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/см3.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм О №2108/Забайкальский/2010 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при pH 7,2-7,6. Сдвиги pH как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.

Дополнительные признаки и свойства

Антигенная активность - введение инактивированного антигена морским свинкам индуцирует образование вирусоспецифических антител.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей (срок наблюдения).

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма О №2108/Забайкальский/2010, был выделен в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из проб афтозного материала, полученных в августе 2010 года от подозреваемого в заболевании ящуром крупного рогатого скота из села Макарово Шилкинского района Забайкальского края (экспертиза №2108/2010). Пробы афтозного материала поступили в ФГБУ «ВНИИЗЖ» 3 сентября 2010 года.

При выделении вируса с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [11].

Биологические и вирусологические методы включали в себя выделение вируса и его адаптацию.

Выделение вируса на культуре первично трипсинизированных клеток СП, перевиваемых линиях клеток ПСГК-30, IB-RS-2, ВНК-21 и крупном рогатом скоте с последующей адаптацией (3 пассажа). Для постановки биопроб на первичных и перевиваемых культурах клеток их выращивали на соответствующих питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 25 см2, отмывали от ростовой среды и заражали 10% суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД50 на клетку), приготовленной в растворе Хенкса с 0,5% гидролизата лактальбумина (ГЛА) и антибиотиками по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов суспензию обрабатывали 10% хлороформа. После 30-минутного контакта при 37°C во флаконы вносили по 5 см3 поддерживающей среды и инкубировали при 37°C до появления ЦПД вируса. При наличии ЦПД (округление клеток, повышение их оптической плотности, дегенерация и отделение клеток от стекла) флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей и исследования в РСК и ИФА на наличие вирусного антигена, при этом использовали коммерческие типоспецифические сыворотки, хранящиеся в музее штаммов ФГБУ «ВНИИЗЖ», и «Набор для выявления антигена вируса ящура в ИФА», изготовленный ФГБУ «ВНИИЗЖ». Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение 18-24 часов проявлялось (%) 90-100 ЦПД в монослое.

Адаптация эпизоотического изолята О №2108/Забайкальский/2010 к различным клеточным линиям наступала на уровне 3 пассажей. Вирус, адаптированный к культуре клеток ПСГК-30, был использован для гипериммунизации морских свинок.

Вирус, адаптированный к культурам клеток IB-RS-2, использовали для получения антигена для РСК и ИФА.

Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 3.

Данные, приведенные в таблице 3, свидетельствуют о высокой адаптационной способности штамма О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О к использованным клеточным культурам.

Изолированный с помощью перечисленных методов вирусный препарат был исследован в реакциях: РСК и ИФА с целью идентификации его типовой принадлежности (таблицы 4 и 5). Проведена проверка штамма на стерильность, отсутствие контаминации бактериальной и грибной микрофлорой и микоплазмами, а также посторонними вирусами в ПЦР и ОТ-ПЦР.

Приведенные в таблицах 4 и 5 результаты свидетельствуют о том, что в афтозном материале экспертизы №2108/Забайкальский/2010 выявлен антиген вируса ящура типа О в разведении 1:4 в РСК и 1:64 в ИФА.

Контаминации бактериальной и грибной микрофлорой, микоплазмами и посторонними вирусами не обнаружено.

Пример 2

Для гипериммунизации морских свинок используют антиген из штамма О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О, репродуцированный в монослойной культуре клеток ПСГК-30. Вируссодержащую суспензию концентрируют в 100 раз добавлением 8-10% полиэтиленгликоля (ПЭГ) м.м. 6000, очищают от балластных примесей добавлением 10% хлороформа. Очищенный вирус и инактивируют аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) в концентрации 0,025-0,05% при значении pH 8,0-8,3.

Инактивированный концентрат антигена в смеси с равным объемом масляного адъюванта типа неполного адъюванта Фрейнда вводят морским свинкам в объеме 1,0 см3 внутримышечно. Через 21 и 7 дней иммунизацию повторяют и через 10 дней после последнего введения антигена животных обескровливают. Индивидуальные пробы сыворотки крови проверяют на типовую специфичность и активность в РСК в соответствии с методическими рекомендациями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [9].

После этого готовят серию путем смешивания типоспецифичных индивидуальных проб сыворотки одинаковой активности. Штаммовую специфичность серийного препарата определяют в одно- и двусторонних реакциях с гомо- и гетерологичными антигенами.

После консервирования азидом натрия (1:5000) и выдерживания при температуре 4°C в течение 30 дней полученную сыворотку фасуют во флаконы по 0,5-1,0 см3 и высушивают методом сублимации под вакуумом.

Способом, описанным в примере 2, была приготовлена 1 серия гипериммунной сыворотки, характеристика которой представлена в таблице 6.

Данные, приведенные в таблице 6, свидетельствуют о том, что получена диагностическая сыворотка, по специфической активности отвечающая требованиям ГОСТа 25384-82.

Пример 3

Для получения антигена для серологических и иммунохимических реакций используют штамм О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура Aphtae epizooticae, адаптированный к культуре клеток перевиваемых линий ПСГК-30 и IB-RS-2. Для адаптации используют вируссодержащий материал в виде 10% афтозной суспензии. Пассирование проводят в течение 3-5 последовательных пассажей. Полученный вирус используют для наработки вирусного сырья. Заражение клеточных культур и сбор вирусного материала проводят по общепринятой методике.

Полученную вируссодержащую суспензию концентрируют в 100 раз добавлением (%) 8-10 ПЭГ. Полученный концентрат инактивируют АЭЭИ, фасуют во флаконы и высушивают методом сублимации под вакуумом.

Указанным способом была приготовлена 1 серия диагностического антигена, характеристики которой приведены в таблице 7.

Результаты исследований, приведенные в таблице 7, свидетельствуют, что получены диагностические антигены, специфическая активность которых соответствует требованиям ГОСТа 25384-82.

Пример 4

Штамм О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура Aphtae epizooticae типа О, предназначенный для контроля иммуногенной активности противоящурных вакцин на КРС, готовят следующим образом. Полученный вирус предварительно освежают на КРС, заражая 1-2 животных массой 250-300 кг, доставленных из благополучных по ящуру зон страны, где в течение последних 2-х лет не проводили вакцинацию животных против ящура. Количество пассажей вируса не должно превышать 20, начиная от исходного вируса. Суспензию вируса, содержащую 10000-10000000 ИД50/1 см3 с антибиотиками, вводят по 0,2-0,3 см в 20-40 каналов интрадермалингвально по всей поверхности языка. Зараженных животных не кормят до снятия вируса. Через 20-30 часов после заражения афты снимают по мере их созревания. Лимфу собирают шприцом. На основе собранного афтозного материала готовят 20%-ную суспензию вируса, которую очищают от балластных примесей с последующим добавлением в нее антибиотиков и равного объема глицерина. Полученную 10% суспензию вируса оценивают в ИФА на типоспецифичность и методом ОТ-ПЦР с последующим проведением нуклеотидного секвенирования на соответствие исходному вирусу по первичной структуре гена VP1. Активность вируса в РСК должна быть не ниже 1:4.

Инфекционную активность вируса определяют на КРС и в первичной культуре клеток СП. Контрольный вирус должен иметь титр инфекционной активности не менее 104,0 ИД50/0,1 см. Флаконы с суспензией вируса в присутствии глицерина хранят в холодильнике при температуре минус (70°C - 40°C).

Источники информации

1. Ререр X. Ящур. Пер. с нем. Г.А. Сурковой. / Под ред. и с предисл. канд. вет.наук. П.В. Малярца. - М.: Колос, 1971, 432 с.

2. Ящур / А.Н. Бурдов, А.И. Дудников, П.В. Малярец [и др.] - М., Агропромиздат, 1990, 320 с.

3. Шажко, Ж.А. Обоснование методических основ современных схем лабораторной диагностики ящура и других везикулярных болезней / Ж.А. Шажко // Совр. аспекты вет. патол. ж-ных: матер, конф., посвящ. 40-лет. ВНИИЗЖ. - Владимир, 1998. - С. 23-31.

4. Сухарев, О.И. От эпизоотии к устойчивому благополучию по ящуру (к 100-летию открытия) / О.И. Сухарев, Б.А. Кругликов, Н.И. Черныш // Ветеринария. - 1997. - №6. - С. 8-13.

5. Вирусные болезни животных / Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В. [и др.] - М., ВНИИТИБП, 1998, С. 532-548.

6. Иммунобиологические свойства эпизоотического штамма вируса ящура типа О №1964/Монголия/2004/ Т.А. Фомина, В.К. Спирин, А.И. Егорова [и др.] // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2005. - Т. 3. - С. 94-104.

7. Иммунобиологические свойства эпизоотического штамма вируса ящура типа О №1734 «Приморский-2000» / В.К. Спирин, А.И. Егорова, С.Р. Кременчугская [и др.] // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2007. - Т. 5. - С. 52-57.

8. Пат. РФ №2204599, C12N 7/00, А61K 39/135, 20.05.2003 г.

9. Southeast Asian Foot-and-Mouth Disease Viruses in Eastern Asia / N.J. Knowles, J.J. He, Y. Shang [et al.] // Emerg Infect Dis. - 2012. - V. 18(3): P. 499-501.

10. ΟΙΕ. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals (mammals, birds and beers). - 7th Edition, Paris, 2008. -Vol. 1. - P. 203-207.

11. Методические указания по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура / Гусев А.А., Захаров В.М., Шажко Ж.А. [и др.]. Владимир, 2002, 31 с.

1. Штамм вируса ящура Aphtae epizooticae типа O, сем. Picornaviridae, род Aphtovirus, депонированный в коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером вирус ящура штамм О №2108/3абайкальский/2010 (производственный), для изготовления биопрепаратов для диагностики ящура типа О, характеризующийся тем, что он получен в течение последовательного пассирования в культурах клеток гомологичного и гетерологичного происхождения, обладает высокой биологической активностью в нативном виде и сохраняет высокую антигенную активность после инактивации.

2. Штамм по п. 1, характеризующийся тем, что он получен в течение 3 последовательных пассажей в первично трипсинизированной культуре клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30) с титром инфекционной активности 6,5 lg ТЦД50/см3 и антигенной активностью в реакции связывания комплемента (РСК) 1:4.

3. Штамм по п. 1, характеризующийся тем, что он получен в течение 3 последовательных пассажей в перевиваемой культуре клеток свиной почки (СП) с титром инфекционной активности 6,25 lg ТЦД50/см3 и антигенной активностью в реакции связывания комплемента (РСК) 1:4, в иммуноферментном анализе (ИФА) - 1:64.

4. Штамм по п. 1, характеризующийся тем, что он получен в течение 3 последовательных пассажей в перевиваемой культуре клеток почки свиньи (IB-RS-2) с титром инфекционной активности 6,75 lg ТЦД50/см3 и антигенной активностью в реакции связывания комплемента (РСК) 1:6, в ИФА - 1:64.

5. Штамм по любому из пп. 1-4, характеризующийся тем, что после инактивации он индуцирует в организме морских свинок образование вирусоспецифических антител, выявляемых в РСК в разведениях 1:30 и в ИФА в разведении 1:10000.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в практической работе бактериологических лабораторий для дифференциации энтерококков кишечной микрофлоры человека на нормальную и патогенную микрофлору.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ связывания Mycobacteria и/или фрагментов Mycobacteria, присутствующих в водной жидкости, с твердой поверхностью.

Изобретение относится к микробиологии, а именно к санитарно-гигиеническому контролю за инфицированностью Listeria monocytogenes морской воды и морепродуктов. Способ определения сапрофитных бактерий, стимулирующих рост Listeria monocytogenes в морских микробных сообществах, предусматривает засев «газоном» одной половины чашки Петри с агаризованной средой СММ испытуемыми культурами, а другой половины чашки с ГРМ-агаром - тест-культурами листерий.

Изобретение касается способа выявления серологического родства микробов, имеющих общие детерминанты в составе липополисахаридов. Способ включает получение специфических антител на липополисахариды.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ определения наличия в биологических жидкостях, окружающей среде и продуктах питания бактерий Escherichia coli штамма O157:Н7, включающий дезинтеграцию бактерий ферментативной обработкой и лизис неионным детергентом, адсорбцию на парамагнитных частицах при помощи специфического моноклонального антитела, детекцию антигена бактерий Е.coli O157:Н7 при помощи специфического биотинилированного моноклонального антитела, связывание полученного комплекса с нековалентным коньюгатом ДНК-матрицы с нейтравидином, диссоциацию твердофазного комплекса "антитело-антиген Е.coli O157:Н7 - биотинилированное антитело-коньюгат" добавлением раствора глицин - HCl рН 2.6, ПЦР-амплификацию ДНК-матрицы и выявление наличия бактерий Е.coli O157:Н7 по скорости нарастания флуоресцентного сигнала.

Изобретение относится к области медицинской микробиологии. Изобретение представляет собой питательную среду для визуального выявления Ureaplasma urealyticum, содержащую питательную основу, стимуляторы роста, мочевину, селективные компоненты, лошадиную сыворотку, pH индикатор и дистиллированную воду.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для определения микроорганизмов, вырабатывающих липазы в кондитерских изделиях. Способ определения в кондитерских изделиях микроорганизмов, вырабатывающих липазы, предусматривает отбор пробы, приготовление из пробы исходного разведения пробы и ряда десятикратных разведений с последующим высевом в две параллельные чашки Петри.

Способ дифференциации возбудителей чумы и псевдотуберкулеза по N-ацетил-β-D-глюкозаминидазной активности предусматривает получение суспензии агаровой культуры исследуемых бактерий в концентрации (1-5)×109 м.к., подготовку синтетического субстрата, в качестве которого используют 4-метилумбеллиферил-N-ацетил-β-D-глюкозаминид в количестве 50 мкМ.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается применения штамма Rickettsia sibirca subsp. sibirica.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается применения штамма Rickettsia slovaca. Представлено применение штамма Rickettsia slovaca "Карпунино-19/69", депонированного во Всероссийском музее риккетсиозных культур ФГБУ НИИЭМ им.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложена биодобавка в питательную среду для культивирования клеток животных и репродукции на них вирусов, представляющая собой экстракт из кабачков и мышц щуки.

Изобретение относится к области вирусологии и касается штамма вируса африканской чумы свиней. Представленный штамм вируса африканской чумы свиней 8-го серотипа, семейства Asfarviridae, род Asfivirus, адаптирован к перевиваемой культуре клеток COS-1 и депонирован в Коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии под №.3096.

Изобретение относится к медицине, ветеринарии, санитарии и предназначено для дезодорации помещений. Дезодорирующее средство для помещений содержит концентрат селекционированных высокоспецифичных бактериофагов видов Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterocolitica, Pseudomonas aeruginosa.

Группа изобретений относится к способу определения штамма бактериофага, вариантам штамма бактериофага и их применению. Способ предусматривает получение коллекции штаммов бактериофагов, культивирование штамма Salmonella spp на стерильной культуральной среде, нанесение образцов культур на планшет, добавление суспензии испытываемого штамма бактериофага в концентрации 6,5 х 109 БОЕ при соотношении бактериальной суспензии к суспензии с фагом 1:1, 1:1,5 или 1:3 и инкубирование при 37°C в течение 4 ч.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложены применение живого метапневмовируса птиц (AMPV) и фармацевтической композиции, содержащей цитотоксическое количество такого вируса, в терапии злокачественных опухолей, а также способ терапии злокачественных опухолей с использованием указанной фармацевтической композиции.

Изобретение относится к области биотехнологии, генной инженерии и вирусологии. Предложен способ получения в растении или в его части химерных вирусоподобных частиц (VLP).

Настоящее изобретение относится к фармацевтической промышленности. Предложены способ получения вирусного антигена из оболочечного вируса и применение этого способа в производстве вакцинного препарата, содержащего указанный вирусный антиген.

Изобретение относится к микробиологии и касается штамма бактериофага Staphylococcus aureus. Предложенный штамм обеспечивает разрушение биопленок, образуемых бактериями рода Staphylococcus, и содержит ген, кодирующий альфа-субъединицу рибонуклеотидредуктазы 1b.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу оценки активности лечебно-профилактических препаратов против вируса натуральной оспы. Способ включает введение в организм инбредных разнополых 18-21-суточных мышей иммунодефицитной линии SCID массой 12-14 г контрольной и испытуемой группы по заданной схеме суспензии исследуемого противовирусного препарата.

Предложен штамм энтеровируса человека А71 типа субгенотипа С4. Штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под регистрационным номером V-670.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается вакцины против ящура типа А. Охарактеризованная вакцина является инактивированной сорбированной и содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма вируса ящура, депонированного в коллекции ФГБУ “ВНИИЗЖ” под регистрационным номером ВЯ А №2187/Кути/2013 (производственный), адъюванты гидроокись алюминия с сапонином и поддерживающую среду в эффективных соотношениях.
Наверх