Способ получения органной культуры хороидально-пигментного комплекса из глаза взрослого донора-трупа



Способ получения органной культуры хороидально-пигментного комплекса из глаза взрослого донора-трупа
Способ получения органной культуры хороидально-пигментного комплекса из глаза взрослого донора-трупа

 

A01N1/00 - Консервирование тел людей или животных, или растений или их частей; биоциды, например дезинфектанты, пестициды, гербициды (препараты для медицинских,стоматологических или гигиенических целей A61K; способы или устройства для дезинфекции или стерилизации вообще, или для дезодорации воздуха A61L); репелленты или аттрактанты (приманки A01M 31/06; лекарственные препараты A61K); регуляторы роста растений (соединения вообще C01,C07,C08; удобрения C05; вещества, улучшающие или стабилизирующие состояние почвы C09K 17/00)

Владельцы патента RU 2578526:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)

Изобретение относится к медицине. После удаления из глазного яблока взрослого донора-трупа роговично-склерального диска глазное яблоко при отсутствии сквозных повреждений радужной оболочки, цилиарного тела и видимой части собственно сосудистой оболочки (ССО) и выхода стекловидного тела за пределы витреальной полости полностью погружают в стерильную емкость со стерильным фосфатно-солевым буфером с рН 7,4. Производят полное отделение склеры от ССО путем рассечения склеры меридиональными разрезами спереди назад на 2, 3 или 4 «лепестка». Со стороны супрахориоидального пространства пересекают вортикозные вены и внутрисклеральную часть зрительного нерва. Производят три разреза хороидально-пигментного комплекса (ХПК), состоящего из ССО и ретинального пигментного эпителия (РПЭ). Первый круговой разрез производят на расстоянии 1 мм от зубчатой линии, один меридиональный разрез - в любом меридиане в направлении от первого разреза спереди назад к культе диска зрительного нерва и второй круговой разрез - на расстоянии 1 мм от культи зрительного нерва. Далее ХПК аккуратно отделяют от нейральной сетчатки пинцетом и укладывают на дно стерильной чашки Петри в положении клетками РПЭ вверх. Добавляют питательную среду следующего состава: среда Игла в модификации Дульбекко со средой Хэма F12 (DMEM/F12) - 89%, эмбриональная телячья сыворотка - 10%, смесь антибиотиков, включающая пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл - 1%. При этом культуру инкубируют при 37°C и при 5% концентрации СО2, питательную среду заменяют 2 раза в день. Изобретение позволяет снизить степень загрязнения продукта. 2 ил., 1 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, патофизиологии и экспериментальной трансплантологии, и может быть использовано для получения ткани хороидально-пигментного комплекса (ХПК) донора-трупа при снижении уровня загрязнения получаемой органной культуры ХПК фрагментами сетчатки и содержимым витреальной полости. Собственно сосудистая оболочка (ССО) глаза и располагающийся с ее внутренней стороны слой ретинального пигментного эпителия (РПЭ) вместе составляют ХПК и выполняют функцию двусторонней доставки многочисленных метаболитов из кровотока к слою фоторецепторов сетчатки и обратно, обеспечивая нормальную фототрансдуктивную функцию сетчатки. Патология РПЭ считается патогенетическим звеном дистрофических заболеваний сетчатки - возрастной макулярной дегенерации, пигментного ретинита, наследственных дистрофий сетчатки. При экспериментальной разработке способов лазерного и хирургического лечения указанных состояний традиционно используют модели экспериментальных животных, чаще всего кроликов. Данный подход имеет недостатки - по многим параметрам глаз животного отличается от глаза человека, эксперименты на животных относительно дороги и трудозатратны, требуют специально оборудованного вивария. В качестве альтернативы может быть использован метод органных культур, который позволяет получить небольшой жизнеспособный фрагмент интересующей ткани от трупного донора и поддерживать его жизнеспособность в течение некоторого срока. В частности, для изучения вариантов лазерного и хирургического воздействия на нативный слой РПЭ в ряде случаев можно использовать органную культуру ХПК.

Ближайшим аналогом является способ получения органной культуры ХПК глаза взрослого человека, описанный в научной статье: Sun K, Cai Н, Tezel ТН, Paik D, Gaillard ER, Del Priore LV. Bruch′s membrane aging decreases phagocytosis of outer segments by retinal pigment epithelium. Mol Vis. 2007 Dec 21; 13: 2310-9. Согласно статье выделение ХПК является промежуточным звеном в процессе выделения мембраны Бруха (часть ССО, располагающаяся у основания клеток РПЭ) и осуществляется следующим образом. Производят один круговой (параллельно лимбу в 3 мм от него) и 4 меридиональных (вдоль переднезадней оси глаза) разреза склеры, пересекают зрительный нерв, полностью отделяют склеру от ССО. Последовательно удаляют передний сегмент глаза вместе со стекловидным телом и сетчатую оболочку, получая таким образом хороидально-пигментный комплекс (ХПК).

Способ имеет недостаток: при обработке глазного яблока таким способом неизбежно повреждается сетчатая оболочка глаза и стекловидное тело, что может приводить к попаданию на поверхность ХПК способных к пролиферации клеток сетчатки (глиальных клеток Мюллера) и стекловидного тела (гиалоцитов), что может осложнять выполнение ряда экспериментальных задач.

Задачей изобретения является получение органной культуры ХПК глаза взрослого донора-трупа in vitro при снижении уровня загрязнения выделяемой ткани фрагментами сетчатки и содержимым витреальной полости.

Техническим результатом является снижение степени загрязнения посторонними клеточными элементами получаемой органной культуры ХПК.

Технический результат достигается тем, что в способе получения органной культуры ХПК из глаза взрослого донора-трупа, включающем удаление из глазного яблока донора-трупа роговично-склерального диска, согласно изобретению при отсутствии сквозных повреждений радужной оболочки, цилиарного тела и видимой части ССО и выхода стекловидного тела за пределы витреальной полости глазное яблоко без роговично-склерального диска полностью погружают в емкость с фосфатно-солевым буфером с рН 7,4, производят полное отделение склеры от ССО путем рассечения склеры меридиональными разрезами спереди назад на 2, 3 или 4 «лепестка» и пересечения со стороны супрахориоидального пространства вортикозных вен и внутрисклеральной части зрительного нерва; производят три разреза ХПК, состоящего из ССО и РПЭ, - первый круговой разрез - на расстоянии 1 мм от зубчатой линии, один меридиональный - в любом меридиане в направлении от первого разреза спереди назад к культе диска зрительного нерва и второй круговой разрез на расстоянии 1 мм от культи зрительного нерва; далее ХПК аккуратно отделяют от нейральной сетчатки пинцетом, укладывают на дно стерильной чашки Петри в положении клетками РПЭ вверх и в нее добавляют питательную среду следующего состава: среда Игла в модификации Дульбекко со средой Хэма F12 - 89%, эмбриональная телячья сыворотка - 10%, смесь антибиотиков, включающая пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл - 1%, при этом культуру инкубируют при 37°C и при 5% концентрации CO2, питательную среду заменяют 2 раза в день.

При данном способе обработки глазного яблока сетчатка не повреждается, витреальная полость остается невскрытой, радужная оболочка, цилиарное тело, хрусталик, сетчатка и стекловидное тело отделяются единым неповрежденным замкнутым блоком, таким образом исключаются возможные источники клеточного загрязнения органной культуры ХПК.

Изобретение поясняется рисунками 1 и 2.

На рис. 1 изображена схема пересечения тканей заднего отрезка глаза при выделении ХПК согласно ближайшему аналогу. На рис. 2 изображена схема пересечения тканей заднего отрезка глаза при выделении ХПК согласно предложенному изобретению. На обоих рисунках позицией 1 обозначена сетчатая оболочка, позицией 2 - ХПК, позицией 3 - склера, позицией 4 - зрительный нерв. На рис. 1 позицией 5 обозначены места рассечения сетчатой оболочки по ближайшему аналогу - вокруг зрительного нерва и возле зубчатой линии, при этом полость стекловидного тела неизбежно вскрывают, сетчатка повреждена. На рис. 2 позицией 6 обозначена линия рассечения зрительного нерва на уровне его внутрисклеральной части, согласно настоящему изобретению полость стекловидного тела не вскрыта, сетчатка не повреждена.

Способ осуществляется следующим образом: глазное яблоко донора-трупа после удаления роговично-склерального диска при отсутствии сквозных повреждений радужной оболочки, цилиарного тела и видимой части ССО и выхода стекловидного тела за пределы витреальной полости и при отсутствии перечисленных признаков погружают в стерильную емкость со стерильным фосфатно-солевым буфером с рН=7,4. Склеру рассекают спереди назад двумя, тремя или четырьмя меридиональными разрезами длиной 2/3 длины глазного яблока, параллельными переднезадней оси глаза через равные промежутки с получением двух, трех или четырех «лепестков» склеры. «Лепестки» склеры поочередно отгибают и со стороны супрахориоидального пространства пересекают вортикозные вены и внутрисклеральную часть зрительного нерва, после чего склеру удаляют из операционного поля. Далее производят три разреза ХПК - первый круговой разрез - на расстоянии 1 мм от зубчатой линии, один меридиональный разрез - в любом меридиане в направлении от первого разреза спереди назад к культе диска зрительного нерва и второй круговой разрез на расстоянии 1 мм от культи зрительного нерва; далее ХПК аккуратно отделяют от нейральной сетчатки пинцетом и укладывают на дно стерильной чашки Петри в положении «клетками РПЭ вверх» и добавляют в нее питательную среду следующего состава: DMEM/F12 - 89%, эмбриональная телячья сыворотка - 10%, смесь антибиотиков, включающая пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл - 1%; при этом органную культуру ХПК инкубируют при 37°C и при 5% концентрации СО2, питательную среду заменяют 2 раза в день.

Способ поясняется примером.

Пример. Глазное яблоко донора-трупа, мужчины 56 лет, после удаления роговично-склерального диска (Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2010/243 от 24 июня 2010 года «Алгоритм заготовки трупных роговиц человека для трансплантации») осматривают на предмет выявления сквозных повреждений радужной оболочки, цилиарного тела и видимой части ССО. Убедившись в целостности указанных структур и отсутствии выхода стекловидного тела за пределы витреальной полости, глазное яблоко полностью погружают в стерильную емкость со стерильным фосфатно-солевым буфером с рН=7,4 (ПанЭко, Россия), склеру рассекают спереди назад тремя меридиональными разрезами длиной 2/3 от длины глазного яблока, параллельными переднезадней оси глаза через равные промежутки с получением трех «лепестков» склеры. «Лепестки» склеры поочередно отгибают и со стороны супрахориоидального пространства пересекают вортикозные вены и внутрисклеральную часть зрительного нерва, после чего склера удаляется из операционного поля. Далее производится три разреза ХПК - первый круговой разрез - на расстоянии 1 мм от зубчатой линии, один меридиональный разрез в направлении от первого разреза спереди назад к культе диска зрительного нерва и второй круговой разрез на расстоянии 1 мм от культи зрительного нерва; далее ХПК аккуратно отделяют от нейральной сетчатки пинцетом и укладывают на дно стерильной чашки Петри (60*15 мм, SPL Life Sciences, Co., Ltd, Корея) в положении «клетками РПЭ вверх». В чашку Петри добавляют питательную среду следующего состава: DMEM/F12 (БиолоТ, Россия) - 89%, эмбриональная телячья сыворотка (HyClone, США) - 10%, смесь антибиотиков, включающая пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл (MP Biomedicals, LLC, США) - 1%, получая таким образом органную культуру ХПК; при этом культуру инкубируют при 37°C и 5% концентрации CO2 (инкубатор NU-5510, NuAire, США), питательную среду заменяют 2 раза в день.

Способ получения органной культуры хороидально-пигментного комплекса (ХПК) из глаза взрослого донора-трупа, включающий удаление из глазного яблока донора-трупа роговично-склерального диска, отличающийся тем, что при отсутствии сквозных повреждений радужной оболочки, цилиарного тела и видимой части собственно сосудистой оболочки (ССО) и выхода стекловидного тела за пределы витреальной полости глазное яблоко без роговично-склерального диска полностью погружают в емкость с фосфатно-солевым буфером с pH 7,4, производят полное отделение склеры от ССО путем рассечения склеры меридиональными разрезами спереди назад на 2, 3 или 4 «лепестка» и пересечения со стороны супрахориоидального пространства вортикозных вен и внутрисклеральной части зрительного нерва; производят три разреза ХПК, состоящего из ССО и ретинального пигментного эпителия (РПЭ), - первый круговой разрез - на расстоянии 1 мм от зубчатой линии, один меридиональный - в любом меридиане в направлении от первого разреза спереди назад к культе диска зрительного нерва и второй круговой разрез на расстоянии 1 мм от культи зрительного нерва; далее ХПК аккуратно отделяют от нейральной сетчатки пинцетом, укладывают на дно стерильной чашки Петри в положении клетками РПЭ вверх и в нее добавляют питательную среду следующего состава: среда Игла в модификации Дульбекко со средой Хэма F12 - 89%, эмбриональная телячья сыворотка - 10%, смесь антибиотиков, включающая пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл - 1%, при этом культуру инкубируют при 37°C и при 5% концентрации СO2, питательную среду заменяют 2 раза в день.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии. Выполняют забор мезенхимальных стволовых клеток пациента, выращивание из них аутологичных хондроцитов.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для индукции противоопухолевого иммунного ответа in vitro. Способ включает получение прилипающей и неприлипающей фракций мононуклеарных клеток (МНК), выделенных из периферической крови больного, совместное культивирование выделенных из периферической крови больного аутологичных МНК неприлипающей фракции со зрелыми дендритными клетками (ДК), полученными из прилипающей фракции МНК, трансфицированными РНК опухолевых клеток.

Изобретение относится к области криобиологии. Предложен способ консервации биоматериала.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммунологии, и может быть использовано для генерации цитотоксических клеток с активностью против клеток немелкоклеточного рака легкого.

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии. Описана мышь, имеющая неполный N-концевой домен в гене IL-33.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ имплантации биологического материала в организм с использованием композиции, содержащей коллаген.

Предложен способ получения рекомбинантного полипептида. Способ включает культивирование клеток CHO в среде с общим содержанием аминокислот от около 40 до примерно 100 мМ при условиях, включающих в себя, по крайней мере, один температурный сдвиг и, по крайней мере, один сдвиг pH, и экспрессирование рекомбинантного полипептида.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ идентификации антитела, которое специфически связывается с интересующим антигеном на клеточной поверхности, предусматривающий иммунизацию животного вектором экспрессии, кодирующим антиген клеточной поверхности; приведение в контакт клеток, содержащих на своей поверхности антитела и выделенных из животного, подвергнутого иммунизации, причем антитела связаны с первой сортируемой меткой, с клетками, экспрессирующими антиген, связанный со второй сортируемой меткой; определение специфического связывания с использованием клеточного сортера по наличию первой и второй сортируемой метки в клеточном комплексе; а также идентификацию участков, определяющих комплементарность с антигеном (CDR), у идентифицированного антитела и прививку CDR на каркасную область акцепторного антитела.

Изобретение относится к медицине, а именно к биотехнологии, и может быть использовано для получения миобластов из слизистой оболочки полости рта человека. Для этого проводят биопсию слизистой оболочки полости рта человека и обработку биоптата, предусматривающую отмывку, измельчение, ферментативное расщепление ткани десны протеолитическими ферментами.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к терапии, и может быть использована для повышения реперфузии у пациента, имеющего заболевание периферических сосудов.

Изобретение относится к области криобиологии. Предложен способ консервации биоматериала.

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к искусственному осеменению крупного рогатого скота. Среда для консервирования семени быка составлена с использованием следующих компонентов (мас.%): трис-(гидроксиметил)-аминометан 1,9, фруктоза 0,9, лимонная кислота 0,7, сахароза 2, глицерин 4,5-6,5, фосфолипиды сои 0,04-2,00, высокомолекулярное поверхностно-активное вещество 0,01-1, вода бидистиллированная остальное.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения нагруженных антигеном, активированных дендритных клеток (DC) для применения в иммунотерапии, включающий нагрузку по меньшей мере одним антигеном неактивированных DC; активацию неактивированных DC IFN-γ и липополисахаридом (LPS) для образования активированных DC; криосохранение активированных DC и размораживание активированных DC; где степень извлечения и жизнеспособность активированных DC после размораживания выше или равна приблизительно 70%, и где размороженные активированные DC продуцируют эффективное количество по меньшей мере одного цитокина для создания Т-клеточного ответа.

Изобретение относится к области медицины, а именно к посмертной патоморфологической диагностике бифуркационной недостаточности сосудов артериального круга большого мозга.

Группа изобретений относится к области ветеринарии и предназначена для борьбы с эктопаразитами и эндопаразитами у животных. Заявлена ветеринарная композиция для наружного применения для лечения или предотвращения паразитарных инфекций или инвазий у животного, содержащая: (a) комбинацию четырех активных агентов, содержащую фипронил, регулятор роста насекомых, празиквантел и авермектиновый или милбемициновый активный агент; и (b) фармацевтически приемлемый носитель; где указанная композиция является жидкой композицией для наружного нанесения.

Изобретение относится к медицине. Криоконсервирование гемопоэтических стволовых клеток крови проводят путем добавления ограждающего раствора криопротектора диметилсульфоксида во взвесь ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками при температуре +4,0°C, подготовки полученной взвеси к замораживанию путем холодовой адаптации при +4,0°C в течение 10 минут.

Изобретение относится к медицине. Для получения культуры клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ) взрослого донора-трупа производят удаление из глазного яблока донора-трупа роговично-склерального диска.
Изобретение относится к медицине, в частности к области нормальной анатомии, и может быть использовано для обучения школьников, студентов, аспирантов и врачей. Осуществляют предварительное санирование анатомического объекта и его инъекционное инфильтрирование бальзамирующим раствором.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для хранения препаратов ДНК в жидком виде. Получают композицию, содержащую буферный раствор, включающий 0,5-4% N-лаурилсаркозина, 5-20 мМ ЭДТА, 30-200 мМ Трис (гидроксиметил) аминометана и воду - остальное.

Изобретение относится к медицине. Способ изготовления и хранения анатомических музейных влажных макропрепаратов включает промывание препарата водой с последующей фиксацией препарата путем полного погружения в емкость с раствором химического реагента, с последующей заменой реагента на свежий, причем при приготовлении макропрепарата фиксацию осуществляют путем его погружения в 10% водный раствор глиоксаля по объему, превышающему объем макропрепарата не менее, чем в 10 раз, далее замену реагента производят трижды на 7, 14, 21 сутки, каждый раз промывая макропрепарат после удаления реагента проточной водой, для музейных экспонатов, фиксация которых осуществлялась 10% раствором формалина, формалин сливают, а перезаливку на 14, 28 и 42 сутки проводят 10% водным раствором глиоксаля.
Изобретение относится к способам пластинации анатомических препаратов для изготовления как фиксированных, так и подвижных пластинатов для получения демонстрационных учебных медицинских экспонатов. Производят обезвоживание препарата в ацетоне, в присутствии гранулированного хлорида кальция, взятого в количестве 10-12% от массы препарата и пропитку препарата в вакууме при давлении 20 мм рт.ст. Для изготовления фиксированных пластинатов пропитку проводят полимерной композицией, состоящей из триглицидилового эфира полиоксипропилентриола, полиэтиленполиамина, ацетона при следующем соотношении компонентов, мас.ч.: 100:10:7,5 соответственно. При этом объемное соотношение компонентов к объему анатомического препарата составляет 3:1, после чего препарат высушивают. Для изготовления подвижных пластинатов пропитку проводят путем погружения препарата первоначально в полиэтиленполиамин, а после извлечения и осушки в триглицидиловый эфир полиоксипропилентриола, при этом объемное соотношение компонентов к объему анатомического препарата составляет 3:1, после чего препарат высушивают. Изобретения позволяют ускорить способ получения пластинатов с повышенной степенью демонстративности. 2 н.п. ф-лы. 2 пр.
Наверх