Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток


 

A01N1/02 - Консервирование тел людей или животных, или растений или их частей; биоциды, например дезинфектанты, пестициды, гербициды (препараты для медицинских,стоматологических или гигиенических целей A61K; способы или устройства для дезинфекции или стерилизации вообще, или для дезодорации воздуха A61L); репелленты или аттрактанты (приманки A01M 31/06; лекарственные препараты A61K); регуляторы роста растений (соединения вообще C01,C07,C08; удобрения C05; вещества, улучшающие или стабилизирующие состояние почвы C09K 17/00)

Владельцы патента RU 2569834:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Вятский государственный гуманитарный университет" (RU)
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России" (RU)

Изобретение относится к медицине. Криоконсервирование гемопоэтических стволовых клеток крови проводят путем добавления ограждающего раствора криопротектора диметилсульфоксида во взвесь ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками при температуре +4,0°C, подготовки полученной взвеси к замораживанию путем холодовой адаптации при +4,0°C в течение 10 минут. Замораживание взвеси со стволовыми клетками осуществляют до температуры -196°C с последующим отогреванием. В качестве хладагента клеточной взвеси используют сухие обеззараженные термогранулы Lab Armor с заданной температурой +4±1°C. Изобретение обеспечивает высокий технологический уровень криоконсервирования, стерильность процедуры, а также высокую устойчивость к витальному красителю мембран большего количества ядерных клеток крови. 1 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к технологии криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) крови человека, и может быть использовано в гематологических, онкологических, хирургических и других центрах для лечения больных с депрессией кроветворения химиолучевого происхождения. Проводят добавление криопротектора диметилсульфоксид (ДМСО) в концентрат ядросодержащих клеток с ГСК и перемешивание сред при +4,0°C, осуществляют программное замораживание клеточной суспензии от +4,0°C до -196°C с последующим отогреванием. Смешивание сред проводят в окружении слоя толщиной 3 см из сухих обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой +4±0,1°C. После холодовой адаптации криопакет с суспензией клеток герметизируют, помещают в металлический пенал-холдер, подвергают программному замораживанию до -196°C с последующим отогреванием биообъекта.

Изобретение позволяет повысить технологичность замораживания ГСК и их сохранность за счет обеспечения стерильности и сохранности максимального количества полноценных криоконсервированных ядросодержащих клеток.

В технологии консервирования гемопоэтических стволовых клеток известны способы их криоконсервирования, например, см. пп. РФ №246197 «Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови» или №2233589, A01N 1/02, дата публикации патента 10.08.2004 г. «Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток человека», который взят за прототип, предусматривает добавление криопротектора - 10% раствора ДМСО в концентрат ядросодержащих клеток с ГСК и перемешивание сред при +4,0°C, осуществляют программное замораживание клеточной суспензии от +4,0°C до -196°C с последующим отогреванием. Смешивание сред проводят в криопакете, который установлен в кристаллы замороженной воды (тающий лед или снег).

Недостатками такого способа криоконсервирования ядросодержащих клеток являются: способ нетехнологичен, использование в ледяной бане в качестве хладагента кристаллов замороженной воды для охлаждения критичной для ГСК экзотермической реакции, развивающейся в процессе добавления криопротектора - 10% ДМСО во взвесь ядросодержащих клеток, не только неудобно и непрактично, но и опасно из-за риска микробной контаминации биообъекта при контакте с каплями воды растаявших кристаллов льда (снега); способ не способен поддерживать во взвеси ядросодержащих клеток с ГСК температуру в диапазоне 4,0°±1°C на протяжении всего этапа подготовки к замораживанию и холодовой адаптации и не обеспечивает сохранность максимального количества полноценных криоконсервированных ядросодержащих клеток.

Техническим результатом предложенного решения является: повышение технологичности криоконсервирования клеточной взвеси с использованием современного промышленного оборудования, снижение риска инфицирования взвеси ГСК при добавлении к ней криопротектора ДМСО, повышение количества криоконсервированных ядросодержащих клеток, устойчивых к витальному красителю клеточной мембраны.

Этот результат достигается за счет помещения криопакета со взвесью ядросодержащих клеток в хладагент из сухих обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой +4,0±1°C, после смешивания взвеси ядросодержащих клеток с криопротектором ДМСО и холодовой адаптации клеточной суспензии при +4,0°C в течение 10 мин осуществляют ее программное замораживание до -196°C с последующим отогреванием.

После отогрева в водяной бане все пробы ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками были стерильными, количество морфологически сохранных ядерных клеток составляло от 95,3% до 98,6%, устойчивостью к витальному красителю мембраны обладали от 73,3% до 94,5% ядерных клеток крови.

Сущность изобретения заключается в совокупности существенных признаков, достаточной для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.

Существенными признаками предложенного способа, совпадающего с известными признаками, являются: А - добавление ограждающего раствора криопротектора диметилсульфоксид в суспензию ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками при температуре +4,0°C; Б - подготовка полученной смеси к замораживанию, включающая холодовую адаптацию суспензии при +4,0°C в течение 10 мин; В - многоэтапное замораживание суспензии со стволовыми клетками до температуры -196°C с последующим отогреванием.

Существенными отличительными признаками способа криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток крови являются: Г - в качестве хладагента клеточной взвеси используют сухие обеззараженные термогранулы Lab Armor с заданной температурой +4±1°C; Д - подготовка термогранул к работе включает фасовку изделий в стеклянные 250-500 мл флаконы и термообработку в сушильном шкафу при температуре +180°C в течение 5 мин с последующим охлаждением до +4°C.

Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток крови заключается в следующем. Перед криоконсервированием ГСК проводят подготовку клеточной суспензии, являющейся концентратом ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками, к замораживанию. Концентрат ядросодержащих клеток получают методом сепарации на аппарате Amicus в объеме от 38,0 до 81,0 (56,3±7,3) мл в стандартные полимерные контейнеры, откуда закрытым способом переводят в пластиковые криопакеты, герметизируют, после чего переносят в емкость для охлаждения клеточной взвеси, помещают в хладагент из сухих обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой +4±1,0°C. Для этого термогранулы фасуют в стеклянные 250-500 мл флаконы, подвергают термообработке в сушильном шкафе при температуре +180°C в течение 5 мин с последующим охлаждением до +4C, достигают обеззараживания термогранул, после чего охлаждают до рабочей температуры +4°±1,0°C. Термогранулы, охлажденные до температуры +4±1,0°C, способны сохранить заданный температурный режим охлажденным клеткам в течение всего этапа подготовки к замораживанию. Далее суспензию ГСК замораживают поэтапно до - 196°C. После отогрева в водяной бане при +38°C все пробы суспензии ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками были стерильными, количество морфологически сохранных ядерных клеток составляло от 95,3% до 98,6%, а устойчивостью к витальному красителю мембраны обладали от 73,3% до 94,5% ядерных клеток крови.

Сравнительный анализ используемых критериев при оценке заявляемого и известного способов криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток крови представлен в таблице 1.

Предлагаемый «Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток» крови по сравнению с прототипом:

а) обладает повышенной технологичностью;

б) обеспечивает стерильность криоконсервированной клеточной суспензии;

в) обеспечивает морфологическую сохранность большего количества ядерных клеток;

г) обеспечивает высокую устойчивость к витальному красителю мембран большего количества криоконсервированных ядерных клеток.

При использовании фондов научно-технической литературы эквивалентных решений не обнаружено, что подтверждает новизну предлагаемого способа криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток крови.

Использование простых приемов и доступного оборудования подтверждает промышленную применимость.

Неочевидность и оригинальный подход к решению проблемы подтверждает изобретательский уровень.

Исследования выполнены на базе лаборатории консервирования крови и тканей, гематологической клиники ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России» и кафедры физики и методики обучения физике факультета информатики, математики и физики ФГБОУ ВПО «Вятский государственный гуманитарный университет Минобрнауки России».

Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток крови, заключающийся в добавлении ограждающего раствора криопротектора диметилсульфоксида во взвесь ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками при температуре +4,0°C, подготовке полученной взвеси к замораживанию, включающей холодовую адаптацию при +4,0°C в течение 10 минут, и замораживание взвеси со стволовыми клетками до температуры -196°C с последующим отогреванием, отличающийся тем, что в качестве хладагента клеточной взвеси используют сухие обеззараженные термогранулы Lab Armor с заданной температурой +4±1°C.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине. Для получения культуры клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ) взрослого донора-трупа производят удаление из глазного яблока донора-трупа роговично-склерального диска.
Изобретение относится к медицине, в частности к области нормальной анатомии, и может быть использовано для обучения школьников, студентов, аспирантов и врачей. Осуществляют предварительное санирование анатомического объекта и его инъекционное инфильтрирование бальзамирующим раствором.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для хранения препаратов ДНК в жидком виде. Получают композицию, содержащую буферный раствор, включающий 0,5-4% N-лаурилсаркозина, 5-20 мМ ЭДТА, 30-200 мМ Трис (гидроксиметил) аминометана и воду - остальное.

Изобретение относится к медицине. Способ изготовления и хранения анатомических музейных влажных макропрепаратов включает промывание препарата водой с последующей фиксацией препарата путем полного погружения в емкость с раствором химического реагента, с последующей заменой реагента на свежий, причем при приготовлении макропрепарата фиксацию осуществляют путем его погружения в 10% водный раствор глиоксаля по объему, превышающему объем макропрепарата не менее, чем в 10 раз, далее замену реагента производят трижды на 7, 14, 21 сутки, каждый раз промывая макропрепарат после удаления реагента проточной водой, для музейных экспонатов, фиксация которых осуществлялась 10% раствором формалина, формалин сливают, а перезаливку на 14, 28 и 42 сутки проводят 10% водным раствором глиоксаля.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к способу получения 5-(1,5,3-дитиазепан-3-ил)-хинолина (1), заключающемуся во взаимодействии 5-аминохинолина и 1-окса-3,6-дитиациклогептана в среде этанол-хлороформ (1:1, объемные) в присутствии катализатора Sm(NO3)3·6Н2O при мольном соотношении 5-аминохинолин : 1-окса-3,6-дитиациклогептан : Sm(NO3)3·6H2O = 1:1:(0.03-0.07) при комнатной температуре (~20°C) и атмосферном давлении в течение 2.5-3.5 ч.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения композиций, содержащих стволовые плацентарные клетки. Способ включает: (a) получение адгезивных плацентарных клеток в растворе, включающем от 2% до 10% декстрана, от 2,5% до 10% ДМСО и от 4% до 10% HSA, (b) фильтрацию полученного раствора через 70 мкм - 100 мкм фильтр; (c) разбавление указанных клеток до содержания не более 10±3·106 клеток на миллилитр раствором, включающим от 2% до 5% декстрана, от 2,5% до 10% ДМСО и от 4% до 10% HSA, и (d) криоконсервацию раствора, содержащего клетки.

Группа изобретений относится к медицине и касается способа криоконсервации стволовых клеток, включающего получение взвеси стволовых клеток и добавление к ней раствора криопротектора при постоянном перемешивании, с последующей криоконсервацией, где в качестве криопротектора во взвесь добавляют 50%-ный раствор ДМСО в реополиглюкине до конечной концентрации ДМСО 10% в получившейся суспензии.

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к овощеводству, и может найти применение при выращивании капусты. Способ предпосевной обработки семян капусты белокочанной включает использование черемшаного отвара, приготовленного кипячением растений 3-5 мин, растворение в нем при температуре 75-80°C парааминобензойной кислоты в концентрации 0,05%, а при остывании раствора до температуры 30-40°C замачивают в полученном растворе семена капусты на 5-10 мин.

Изобретение относится к области медицины и биологии, а именно к способу дополнительного электронноплотного контрастирования кислых групп биомолекул при гистохимическом выявлении катионов натрия в ультраструктурах клеток и тканей легких и трахеи.

Изобретение относится к области медицины, в частности гематологии. Криоконсервирование гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови проводят при добавлении ограждающего раствора криопротектора - диметилсульфоксида - во взвесь ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками.

Группа изобретений относится к области ветеринарии и предназначена для борьбы с эктопаразитами и эндопаразитами у животных. Заявлена ветеринарная композиция для наружного применения для лечения или предотвращения паразитарных инфекций или инвазий у животного, содержащая: (a) комбинацию четырех активных агентов, содержащую фипронил, регулятор роста насекомых, празиквантел и авермектиновый или милбемициновый активный агент; и (b) фармацевтически приемлемый носитель; где указанная композиция является жидкой композицией для наружного нанесения. Заявлен также способ лечения или предотвращения паразитарных инвазий или инфекций у животного, включающий стадию, на которой нуждающемуся в этом животному вводят эффективное количество указанной выше ветеринарной композиции для наружного применения. Заявленная группа изобретений высокоэффективная для борьбы с эктопаразитами и эндопаразитами у животных. 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 1 ил., 6 табл., 5 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно к посмертной патоморфологической диагностике бифуркационной недостаточности сосудов артериального круга большого мозга. Сущность способа состоит в том, что проводят микроскопическое, морфометрическое и гистохимическое исследование продольных гистологических срезов бифуркации артерии. При выявлении не менее трех признаков: увеличении длины сочленения артерий более 370 мкм, наличии метахромазии основного вещества в сочленении и адвентиции артерий, декомплексации и неравномерной толщины коллагеновых волокон, фрагментации и лизиса внутренней эластической мембраны и эластических волокон адвентиции, диагностируют бифуркационную недостаточность сосудов артериального круга большого мозга. Использование заявленного способа позволяет повысить точность диагностики бифуркационной недостаточности сосудов артериального круга большого мозга за счет комплексной оценки изменений гистологических признаков. 1 ил., 1 табл., 1 пр.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения нагруженных антигеном, активированных дендритных клеток (DC) для применения в иммунотерапии, включающий нагрузку по меньшей мере одним антигеном неактивированных DC; активацию неактивированных DC IFN-γ и липополисахаридом (LPS) для образования активированных DC; криосохранение активированных DC и размораживание активированных DC; где степень извлечения и жизнеспособность активированных DC после размораживания выше или равна приблизительно 70%, и где размороженные активированные DC продуцируют эффективное количество по меньшей мере одного цитокина для создания Т-клеточного ответа. Также рассмотрена криосохраненная композиция, содержащая DC, и способ вызова иммунного ответа у млекопитающего, включающий введение композиции по изобретению. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в производстве лекарственных средств на основе DC. 3 н. и 12 з.п. ф-лы, 8 ил., 4 пр.

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к искусственному осеменению крупного рогатого скота. Среда для консервирования семени быка составлена с использованием следующих компонентов (мас.%): трис-(гидроксиметил)-аминометан 1,9, фруктоза 0,9, лимонная кислота 0,7, сахароза 2, глицерин 4,5-6,5, фосфолипиды сои 0,04-2,00, высокомолекулярное поверхностно-активное вещество 0,01-1, вода бидистиллированная остальное. Способ приготовления среды для криоконсервации семени быка включает приготовление безлипидной основы среды для криоконсервации семени быка путем разведения в горячей бидистилированной воде с температурой 80-90°C трис-(гидроксиметил)-аминометана, лимонной кислоты, фруктозы, добавления глицерина и охлаждения до комнатной температуры, доведения pH раствора до 6,8. При этом отдельно готовят липосомальный концентрат посредством добавления в 10%-ный раствор сахарозы 0,2-20,0 мас.% фосфолипидов сои, вносят поверхностно-активное вещество, выдерживают при комнатной температуре, периодически помешивая 4-24 часа, затем обрабатывают суспензию на ультразвуковом дезинтеграторе в течение 5-30 минут и смешивают безлипидную основу среды для криоконсервации семени быка и липосомальный концентрат в соотношении 4:1, стерилизуют автоклавированием при температуре 115°C и давлении 1,4 атмосферы в течение 1 часа или стерилизуют фильтрацией через фильтр с порами 0,22 мкм. Предлагаемая среда для криоконсервирования имеет повышенную биологическую безопасность, обладает оптической прозрачностью и имеет длительный срок использования. 2 н.п. ф-лы, 3 табл., 2 ил., 4 пр.

Изобретение относится к области криобиологии. Предложен способ консервации биоматериала. Способ включает размещение биоматериала в стерильной емкости, удаление воздуха из емкости и ее герметизацию, обработку биоматериала в закрытой среде в емкости со смотровым окном ксеноном и охлаждение биоматериала при постоянном визуальном мониторинге. Обработку биоматериала производят ксеноном 90-99,999% степенью чистоты до величины давления в 7-9 атм., а последующее охлаждение биоматериала ведут до температуры не более +5°C, но не менее -10°C. Изобретение обеспечивает уменьшение вероятности разрушения биоматериала, в том числе в процессе хранения законсервированного биоматериала. 2 з.п. ф-лы, 5 ил., 8 табл., 2 пр.

Изобретение относится к медицине. После удаления из глазного яблока взрослого донора-трупа роговично-склерального диска глазное яблоко при отсутствии сквозных повреждений радужной оболочки, цилиарного тела и видимой части собственно сосудистой оболочки (ССО) и выхода стекловидного тела за пределы витреальной полости полностью погружают в стерильную емкость со стерильным фосфатно-солевым буфером с рН 7,4. Производят полное отделение склеры от ССО путем рассечения склеры меридиональными разрезами спереди назад на 2, 3 или 4 «лепестка». Со стороны супрахориоидального пространства пересекают вортикозные вены и внутрисклеральную часть зрительного нерва. Производят три разреза хороидально-пигментного комплекса (ХПК), состоящего из ССО и ретинального пигментного эпителия (РПЭ). Первый круговой разрез производят на расстоянии 1 мм от зубчатой линии, один меридиональный разрез - в любом меридиане в направлении от первого разреза спереди назад к культе диска зрительного нерва и второй круговой разрез - на расстоянии 1 мм от культи зрительного нерва. Далее ХПК аккуратно отделяют от нейральной сетчатки пинцетом и укладывают на дно стерильной чашки Петри в положении клетками РПЭ вверх. Добавляют питательную среду следующего состава: среда Игла в модификации Дульбекко со средой Хэма F12 (DMEM/F12) - 89%, эмбриональная телячья сыворотка - 10%, смесь антибиотиков, включающая пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл - 1%. При этом культуру инкубируют при 37°C и при 5% концентрации СО2, питательную среду заменяют 2 раза в день. Изобретение позволяет снизить степень загрязнения продукта. 2 ил., 1 пр.
Изобретение относится к способам пластинации анатомических препаратов для изготовления как фиксированных, так и подвижных пластинатов для получения демонстрационных учебных медицинских экспонатов. Производят обезвоживание препарата в ацетоне, в присутствии гранулированного хлорида кальция, взятого в количестве 10-12% от массы препарата и пропитку препарата в вакууме при давлении 20 мм рт.ст. Для изготовления фиксированных пластинатов пропитку проводят полимерной композицией, состоящей из триглицидилового эфира полиоксипропилентриола, полиэтиленполиамина, ацетона при следующем соотношении компонентов, мас.ч.: 100:10:7,5 соответственно. При этом объемное соотношение компонентов к объему анатомического препарата составляет 3:1, после чего препарат высушивают. Для изготовления подвижных пластинатов пропитку проводят путем погружения препарата первоначально в полиэтиленполиамин, а после извлечения и осушки в триглицидиловый эфир полиоксипропилентриола, при этом объемное соотношение компонентов к объему анатомического препарата составляет 3:1, после чего препарат высушивают. Изобретения позволяют ускорить способ получения пластинатов с повышенной степенью демонстративности. 2 н.п. ф-лы. 2 пр.

Изобретение относится к медицине. Осуществляют консервацию кадаверных свиных глаз для офтальмохирургического тренажера путем очистки глаз от придатков и последующей заморозки при температуре -20°C в среде сбалансированного физиологического раствора или стандартного физиологического раствора хлорида натрия на срок до 15 суток. Изобретение позволяет сохранить прозрачность роговицы после разморозки, что обеспечивает возможность визуализировать внутриглазные структуры и обучать врачей различным офтальмохирургическим манипуляциям, а также сохранять и транспортировать большое количество глаз в течение длительного времени. 1 ил.

Изобретение относится к ветеринарии и биологии. Состав жидкости для изучения и демонстрации артериального русла животных включает смесь желатина пищевого, зубного порошка, акриловой краски для окрашивания массы до желаемого оттенка, сернокислого бария и воды дистиллированной (t 80°С). Изобретение позволяет четко видеть инъецируемые сосуды на контрастируемых рентгеновских снимках, которые длительно сохраняются для макроскопического изучения и демонстрации артерий и вен. Сосуды, пропитанные желатином и акрилом, приобретают эластичность, а при их повреждении во время препарирования инъецируемая масса не диффундирует, и при фиксации препарата данный состав сохраняется в просвете сосуда. 3 ил.

Изобретение относится к консервации клеток, образующих ядро, а именно к способу снижения апоптоза хранящихся клеток и к охлажденной композиции, содержащей клетки, образующие ядро, где клетки находятся в контейнере и хранятся с помощью указанного выше способа. Способ включает: 1) хранение клеток, образующих ядро, в контейнере; 2) добавление газа в указанный контейнер таким образом, чтобы давление внутри контейнера достигало 0,5 атм - 4 атм выше давления окружающей среды, где указанный газ представляет собой или включает газ ксенона; 3) сохранение указанного давления в указанном контейнере в продолжение первого периода времени, в течение которого температура в указанном контейнере равна 22°C-37°C; 4) после указанного первого периода времени снижение указанной температуры в контейнере до 0,1°C-10°C с одновременным сохранением указанного давления на 0,5 атм - 4 атм выше давления окружающей среды; 5) сохранение указанного контейнера при указанной более низкой температуре и при давлении на 0,5 атм - 4 атм выше давления окружающей среды в течение второго периода времени, где указанный второй период времени больше чем указанный первый период времени; и 6) после указанного второго периода времени, снижение давления в указанном контейнере до давления окружающей среды и повышение температуры в указанном контейнере до 22°C-37°C. Осуществление способа позволяет снизить апоптоз клеток. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 6 ил.
Наверх