Способ сохранения качественных характеристик культуры in vitro некоторых древесных видов растений (лимонник китайский, рододендрон, сирень, береза повислая)



Способ сохранения качественных характеристик культуры in vitro некоторых древесных видов растений (лимонник китайский, рододендрон, сирень, береза повислая)
Способ сохранения качественных характеристик культуры in vitro некоторых древесных видов растений (лимонник китайский, рододендрон, сирень, береза повислая)
Способ сохранения качественных характеристик культуры in vitro некоторых древесных видов растений (лимонник китайский, рододендрон, сирень, береза повислая)

 


Владельцы патента RU 2590703:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ сохранения качественных характеристик культуры in vitro некоторых древесных видов растений (лимонник китайский, рододендрон, сирень, береза повислая), включающий размножение микропобегов на искусственных питательных средах, где через 7-10 дней после культивирования в стандартных условиях побеги помещают в условия с температурой 4-8°С и уровнем освещенности 500-1000 люкс на срок до 8 (лимонник китайский, береза повислая) или до 12 месяцев (рододендрон, сирень). Изобретение позволяет повысить сохранность качественных характеристик культуры in vitro Лимонника китайского и Березы повислой. 3 табл.

 

Изобретение относится к области биотехнологии растений и может быть использовано для сохранения качественных характеристик различных древесных культур на таких стадиях культивирования, как мультипликация и укоренение.

Важной составляющей клонального микроразмножения древесных растений является степень омоложения культуры in vitro. Степень омоложения микрорастений способна значительно влиять на коэффициент мультипликации, частоту укоренения микропобегов в условиях in vitro/ex vitro и в случае некоторых древесных культур на эффективность адаптации и скорость первоначального роста побегов на первых этапах адаптации. Согласно данным качественное омоложение культуры in vitro некоторых древесных видов (рододендроны) позволяет на стадии адаптации решить такую проблему, как массовый переход адаптируемых микрорастений в состояние покоя.

Высокая степень омоложения достигается за счет сокращения длины пассажа на стадии мультипликации в сочетании с активным черенкованием микропобегов. В зависимости от вида растений и их исходного физиологического состояния достаточная степень омоложения может достигаться за 4-8 пассажей, что составляет 2,5-5,5 месяцев активной работы с культурой. Однако основным недостатком такого способа размножения является быстрый возврат культуры к исходному, менее ювенильному состоянию в случае удлинения пассажа до 6 и более недель. В случае некоторых древесных видов (береза повислая, рододендроны) возврат к исходному физиологическому состоянию может произойти в случае однократного несвоевременного пересаживания растений на стадии мультипликации. Данная особенность представляет собой проблему в случае необходимости временного депонирования культуры in vitro. Поддержание культуры за счет частого пассирования увеличивает риск инфицирования и потери культуры и приводит к заметному увеличению затрат на производство микрорастений. Помимо стадии мультипликации проблемы могут возникать и на стадии укоренения. Укоренение микрорастений, как правило, производится на питательной среде с редуцированным минеральным составом, что благоприятно сказывается как на частоте укоренения, так и на эффективности роста микропобегов на этой стадии. Однако в случае временного депонирования укорененных растений они начинают голодать на обедненной питательной среде, что приводит либо к частичному отмиранию, либо к уходу растений в состояние покоя, что отрицательно сказывается на эффективности последующей адаптации микрорастений.

Целью предлагаемого изобретения является решение всех вышеуказанных проблем на стадии мультипликации и укоренения.

Поставленная цель достигается за счет того, что контейнеры с эксплантами/микрорастениями на начальных стадиях (до 10 дней) мультипликации/укоренения помещаются в холодильники с температурой 4-8°C и низким уровнем освещения (500-1000 люкс).

Суть изобретения состоит в том, что растения, выращиваемые на питательных средах для мультипликации, а именно лимонник китайский - на питательной среде QL (Quorin M. & Lepoivre P. Elude de milieux adaptes aux cultures in vitro de Prunus // Acta Hort. 1977. V.78. P. 437-442) с добавлением сахарозы 30 г/л, инозитола 100 мг/л, пиридоксина 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л, никотиновой кислоты 0,5 мг/л, 6-бензиламинопурина (6-БАП) 0,5 мг/л; рододендрон - на половинной по минеральным солям питательной среде WPM (Lloyd, G. and В.H. McCown. 1980 // Commercially feasible micropropagation of mountain laurel (Kalmia latifolia) by use of shoot tip culture. Int. Plant Prop. Soc, Comb. Proc, 30: 421-427) с добавлением сахарозы 30 г/л, инозитола 100 мг/л, пиридоксина 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л, никотиновой кислоты 0,5 мг/л, N6-(2-Изопентил)аденина (2-iP) 2,0 мг/л и индолилуксусной кислоты (ИУК) 0,5 мг/л; сирень - на питательной среде MS (Murashige T. & Skoog F., A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. Plant, 15 (1962) 473-497) с добавлением сахарозы 30 г/л, инозитола 100 мг/л, пиридоксина 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л, никотиновой кислоты 0,5 мг/л, 6-БАЛ 1,0 мг/л; береза - на питательной среде WPM с добавлением сахарозы 30 г/л, инозитола 100 мг/л, пиридоксина 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л, никотиновой кислоты, 6-БАП 0,2 мг/л, переносятся на свежую питательную среду, либо на средах для укоренения, а именно лимонник и сирень - ½ QL с добавлением сахарозы 20 г/л, инозитола 100 мг/л, пиридоксина 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л, никотиновой кислоты 0,5 мг/л, индолилмасляной кислоты (ИМК) 0,1 мг/л; ИУК 0,1 мг/л; рододендрон - ¼ WPM с добавлением сахарозы 10 г/л, инозитола 100 мг/л, пиридоксина 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л, никотиновой кислоты 0,5 мг/л, ИМК 0,5 мг/л; береза - ½ WPM с добавлением сахарозы 10 г/л, инозитола 100 мг/л, пиридоксина 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л, никотиновой кислоты 0,5 мг/л. Через 7-10 дней культивирования в стандартных условиях контейнеры с растениями помещают в холодильники с температурой 4-8°C и уровнем освещения 500-1000 люкс.

Анализ известных способов длительного поддержания качественных характеристик культуры in vitro растений, проведенный по научно-технической и патентной документации, показал, что совокупность существенных признаков заявляемого способа неизвестна из уровня техники, следовательно, он соответствует условию патентоспособности изобретения - «новизна»

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

1. В нестерильных условиях готовится питательная среда. В нее добавляются необходимые количества макро-, микроэлементов, хелата железа, инозитола, объем доводится дистиллированной водой, рН 5,6-5,8 (в среде ½ WPM / ¼ WPM для мультипликации/укоренения рододендронов рН составляет 4,2-4,5). В колбы добавляются навески агара. Среда разливается по колбам, укупоривается фольгой и бумагой, завязывается банковской резинкой. Автоклавирование проводится при 1 атм. (= 1 изб. атм.) в течение 20 минут. В остывшую до 55°C среду в ламинар-боксе добавляются стерильные растворы витаминов, регуляторов роста. Полученный раствор разливается по стерильным культуральным сосудам. Все манипуляции с растительным материалом производятся в стерильных условиях ламинар-бокса. На этапе мультипликации число эксплантов в контейнерах составляет 10-12 шт., а на стадии укоренения 15-21 шт.

2. Через 7-10 дней культивирования на светокультуральных стеллажах при температуре 22-25°C и освещенности 2500-3500 люкс, контейнеры с растениями проверяют на наличие возможной контаминации, выбраковываются контейнеры с контаминацией или подозрением на нее, а остальные помещают в холодильники с температурой 4-8°C и уровнем освещения 500-1000 люкс.

В таблицах 1-3 представлены результаты исследований по оценке условий и продолжительности депонирования растений на стадиях мультипликации и укоренения, обеспечивающих полное сохранение качественных характеристик культуры in vitro.

Продолжительность этапа мультипликации определяется периодом, за который растения в контейнере поглощают большую часть питательных веществ (органических и минеральных), а также регуляторов роста, некоторые из которых склоны к распаду под воздействием физических факторов внешней среды. Сокращения количества доступных питательных веществ одновременно с накоплением в питательной среде продуктов жизнедеятельности растений, приводит к замедлению роста, а в случае большинства древесных культур это может инициировать состояние покоя, сопровождающееся изменениями на биохимическом и физиологическом уровнях. Для предотвращения подобных изменений производится регулярная пересадка растений на свежую питательную среду. Однако при возникновении временной невостребованности продукции (укорененных микрорастений) необходимость частых пересадок растений для сохранения ими требуемых характеристик становится проблемой, поскольку возрастает риск инфицирования и потери культуры (поскольку число культивируемых контейнеров сокращается до разумного минимума) и приводит к заметному увеличению затрат на производство микрорастений.

Известно, что при воздействии низких температур происходит резкое сокращение активности большинства ферментов в растениях (Holaday A.S. et al. Changes in activities of enzymes of carbon metabolism in leaves during exposure of plants to low temperature // Plant Physiol. 1992. V.98. P. 1105-1114) и, как следствие, резкое сокращение физиологической активности. Воздействие низких температур на микрорастения на стадии мультипликации позволяет сохранять основные качественные характеристики до 6 месяцев в случае лимонника китайского и березы повислой и до 12 месяцев в случае рододендронов и сирени (таблица 1). При увеличении длительности воздействия низких температур у некоторых растений появлялись признаки перехода в состояние покоя (возникновение/изменение антоциановой окраски, сбрасывание листьев начиная с нижних ярусов и др.).

Интенсивность освещения в процессе холодового депонирования микрорастений на стадии мультипликации оказывает влияние на качественные характеристики некоторых древесных видов растений. Так, при отсутствии освещения у большинства культур, за исключением сирени, наблюдался некроз апикальной части побега, хотя это не оказывало влияния на эффективность мультипликации. Избыточный уровень освещения (2,5-3,5 тыс. люкс) ускорял процесс возникновения некроза у таких видов, как лимонник китайский и береза повислая. Несмотря на то, что сирень одинаково хорошо сохраняет свои качественные характеристики при любом уровне освещения, в целях универсализации метода предлагается депонировать микрорастения на стадии мультипликации при температуре 4-8°C и уровне освещенности 500-1000 люкс.

Воздействие низких температур на микрорастения на стадии укоренения также обеспечивает сохранение основных качественных характеристик/товарного вида. Этиоляция побегов в процессе хранения и некроз апикальной части серьезное ухудшают товарный вид продукции и влияют на внешний вид/качество адаптированных растений. Для сохранения товарного вида частично укоренившихся микрорастений необходимо обеспечение хотя бы минимального уровня освещенности, поскольку при хранении в холодильнике в темноте побеги лимонника китайского и березы повислой начинали этиолироваться уже через 4 месяца, а побеги рододендрона и сирени - через 6-8 месяцев. Микрорастения, подвергшиеся воздействию низких температур в течение 4 месяцев, независимо от уровня освещенности лучше адаптировались к условиям окружающей среды, чем контрольные растения, что является дополнительным положительным эффектом низких температур. Более длительное хранение сказывается на эффективности адаптации, но различия с контролем были незначительные, при этом предельная продолжительность хранения частично укоренившихся растений лимонника китайского и березы повислой составляет 8 месяцев, а продолжительность хранения растений рододендронов и сирени без потери качественных характеристик может достигать 12 месяцев.

Список таблиц:

Таблица 1. Влияние продолжительности периода воздействия низких температур (4-8°С) на эффективность последующей мультипликации древесных культур.

Таблица 2. Влияние интенсивности освещения в сочетании с длительным воздействием низких температур (4-8°C) на эффективность последующей мультипликации древесных культур.

Таблица 3. Влияние интенсивности освещения в сочетании с длительным воздействием низких температур (4-8°C) на приживаемость (%) при последующей адаптации древесных культур.

Способ сохранения качественных характеристик культуры in vitro некоторых древесных видов растений (лимонник китайский, рододендрон, сирень, береза повислая), включающий размножение микропобегов на искусственных питательных средах, отличающийся тем, что через 7-10 дней после культивирования в стандартных условиях побеги помещают в условия с температурой 4-8°С и уровнем освещенности 500-1000 люкс на срок до 8 (лимонник китайский, береза повислая) или до 12 месяцев (рододендрон, сирень).



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенному растению, устойчивому к кукурузной листовой совке, содержащему ДНК, кодирующую белок Cry1Da, и ДНК, кодирующую белок Cry1Be, его семени, а также к способу снижения развития устойчивости к белкам Cry1Da и Cry1Be у кукурузной листовой совки с его использованием.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу борьбы с однодольными самосевными растениями, содержащими AAD-1 (арилоксиалканоат диоксигеназы), на поле, содержащем двудольные растения, где указанные самосевные растения содержат ген AAD-1.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенному растению березы вида Betula pendula, обладающему устойчивостью к действию гербицидов на основе фосфинотрицина по сравнению с аналогом дикого типа, а также к способу его получения.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу борьбы с самосевными растениями сои, содержащими арилоксиалканоат диоксигеназу (AAD-12) на поле, включающем однодольные растения.

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии и представляет собой способ получения генетически модифицированных древесных растений, включающий: а) получение и подготовку к инокуляции растительных эксплантов штамма А.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенному растению, которое имеет устойчивость к кукурузному корневому жуку (Diabrotica spp.), содержащему ДНК, кодирующую белок Cry34Ab, ДНК, кодирующую белок Cry35Ab, и ДНК, кодирующую белок Cry6Aa, его семени и клетке, а также к способу замедления развития устойчивости к белкам Cry34Ab, Cry35Ab и Cry6Aa у кукурузного корневого жука с его использованием.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенному растению, которое демонстрирует увеличенную биомассу по сравнению с аналогом дикого типа или нетрансформированным растением, содержащему трансген глутамин-фенилпируват-трансаминазы и трансген глутаминсинтетазы, где каждый GPT трансген и GS трансген операбельно связан с растительным промотором, а также к семени для его получения.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенному растению, которое имеет устойчивость к кукурузному корневому жуку (Diabrotica spp.), содержащему ДНК, кодирующую белок Cry34Ab1, ДНК, кодирующую белок Cry35Ab1, и ДНК, кодирующую белок Cry3Аа, его семени и клетке, а также к способу замедления развития устойчивости к белкам Cry34Ab1, Cry35Ab1 и Cry3Aa у кукурузного корневого жука с его использованием.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенному растению, которое обладает устойчивостью к насекомым-вредителям кукурузным мотылькам, содержащее ДНК, кодирующую белок Cry1Fa, ДНК, кодирующую второй белок, выбираемый из группы, состоящей из Cry2Aa и Cry1I, а также к его семени.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенному растению, которое имеет устойчивость к кукурузному корневому жуку (Diabrotica spp.), содержащему ДНК, кодирующую белок Cry3Aa, и ДНК, кодирующую белок Cry6Aa, его семени и клетке, а также к способу замедления развития устойчивости к белкам Cry3Aa и Cry6Aa у кукурузного корневого жука с его использованием.
Изобретение относится к области декоративного садоводства. Изобретение представляет собой способ размножения растений фритиллярий методом in vitro, включающий стерилизацию эксплантов, разделение их на части, посадку на питательную среду Данстена и Шорта, отделение микролуковиц от эксплантов, их укоренение и адаптацию, отличающийся тем, что после разделения эксплантов их помещают на питательную среду Данстена и Шорта, содержащую 6 г/л агара с добавлением - 5 мкМ 6-бензиламинопурина и 2 мкМ α-нафтилуксусной кислоты, после культивирования на данной среде микролуковицы размножают на безгормональной среде Данстена и Шорта в течение 4 недель при освещении 3 клк 16 ч свет/ 8 ч темнота при температуре 24°C, укореняют и адаптируют в контейнерах со сфагновым мхом, в темноте, при температуре 7°C, в течение 2 месяцев.

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ культивирования лимона in vitro, заключающийся в том, что стерильные пазушные почки предварительно культивируют до появления микропобегов на питательной среде МС с добавлением БАП 0,1 мг/л, НУК 0,5 мг/л, агар 0,7%, затем вычленяют из них меристемы размером 0,4-0,6 мм с 2-3 примордиями и прививают их на подвой, выращенный in vitro на среде WPM, дополненной БАП 1 мг/л, ГК 2 мг/л, агар 0,7%, микропривитые растения культивируют на среде WPM с добавлением БАП 1 мг/л, ГК 2 мг/л, агар 7 г/л, сахарозы 20 г/л.

Изобретение относится к биотехнологии. Представлен способ получения моноклональной линии растительных клеток от гетерологичной популяции растительных клеток, включающий следующие стадии.

Изобретение относится к области биохимии. Предложена система контроля фотосинтетического и дыхательного СО2-газообмена в культуре in vitro.

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения растений-регенерантов лапчатки белой (Potentilla alba L.) в условиях гидропоники, включающий использование черенков материнских растений, размножение и выращивание, где в качестве эксплантов используются черенки материнских растений, которые высаживают на питательную среду по прописи Мурасиге-Скуга (MS), содержащую 0,5 мкМ БАП для введения в культуру ткани, через 20-30 суток развившиеся побеги пересаживают для микроразмножения на питательную среду Мурасиге-Скуга (MS), содержащую 0,5 мкМ БАП+0,25 мкМ ИМК+0,05 мкМ ГК, укореняют побеги на агаризированной среде Мурасиге-Скуга, дополненной 1 мкМ НУК, затем растения-регенеранты вынимают из культуральных сосудов, отмывают корни в дистиллированной воде от агара, закрепляют в кассетах и помещают в гидропонную установку на 90 суток для адаптации и выращивания растительного лекарственного сырья на питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей 1/4 состава макросолей, 1/4 состава микросолей, полный набор витаминов, хелата железа и кальция хлористого, при температуре 24-26°C, режим освещения: 16 часов день, 8 часов ночь.

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности картофелеводства. В способе выращивают мини-клубни оздоровленного картофеля в защищенном грунте, полученные от пробирочных растений.

Изобретение относится к области биотехнологии растений и лесному хозяйстве. Изобретение представляет собой способ подготовки микропобегов in vitro ясеня, осины, ивы для последующего укоренения в условиях ex vitro, включающий перенос растений после стадии мультипликации на питательную среду WPM для элонгации, с добавлением сахарозы 30 г/л, агар-агара 9 г/л, инозитола 100 мг/л, пиридоксина 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л и никотиновой кислоты 0,5 мг/л, где в среду для элонгации добавляют глутамин в концентрации 0,5 или 1,0 ммоль/л, при этом культивирование растений осуществляется при повышенной освещенности - от 5 до 8 тыс.

Изобретение относится к области биотехнологии растений и лесному хозяйству. Изобретение представляет собой способ криоконсервации пазушных почек in vitro растений осины, заключающийся в изоляции пазушных почек, предварительном их обезвоживании в средах, содержащих осмолитики, переносе почек в криопробирки, криоконсервации криопробирок с почками в жидком азоте, оттаивании почек и посткриогенной регенерации из них растений, отличающийся тем, что на этапе обезвоживания перед быстрым замораживанием сначала почки помещают в раствор I, содержащий питательную среду и осмолитики (WPM с добавлением к сахарозе (0,2-0,5М) глицерола (1,7-2,5М)), затем почки переносят в раствор II, содержащий питательную среду и осмолитики (WPM, сахароза (0,2-0,5М), глицерол (2,5-3,5М), этиленгликоль (1-1,5М), диметилсульфоксид (1,5-2М)), с последующим переносом в жидкость для замораживания (WPM, содержащая сахарозу (0,2-0,5М), глицерол (3,5-4М), этиленгликоль (1,5-2,5М), диметилсульфоксид (1,5-2М)).

Изобретение относится к области биотехнологии и растениеводства. Изобретение представляет собой способ сохранения in vitro растений земляники (Fragaria L.), заключающийся в том, что растения помещают в пробирки на питательную среду Мурасиге-Скуга, модифицированную 6% сахарозы, 10-12 г/л агар-агара, 0,2 мг/л 6-бензиламинопурина, 0,1-0,5 мг/л паклобутразола, 6 мМ глюконата кальция, а на ее поверхность выкладывают гранулы альгината кальция с тиосульфатом серебра, закрывают пробирки и переносят их в условия при температуре от 1 до 10°С, 6-часовом световом дне и освещенности 0,5-0,8 клк.

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой способ размножения пеперомии in vitro, включающий отделение эксплантов, стерилизацию, посадку на питательную среду Мурасиге-Скуга, микроразмножение путем отделения побегов от эксплантов, их укоренение на питательной среде Мурасиге-Скуга и дальнейшее укоренение в грунте, где при микроразмножении экспланты высаживают на агаризованную питательную среду Мурасиге-Скуга, дополненную 10 г/л глюкозы и 0,1 мг/л Рибав-Экстра и культивируют в течение 4 недель, затем сформировавшиеся растения-регенераты с корнями замачивают в растворе 3 мг/л индолилуксусной кислоты в течение 15 минут и укореняют в условиях ex vitro в грунте, состоящем из смеси торфа и песка 1:1.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения лилий, содержащих в лепестках делфинидин. При этом способ включает введение в лилии гена флавоноид-3′,5′-гидроксилазы (F3′5′H) из колокольчиков, введение фрагмента гена флавоноид-3′-гидроксилазы (F3′H) из лилий, введение фрагмента гена дигидрофлавонол 4-редуктазы (DFR) из лилий, синтез делфинидина в результате деятельности введенного гена F3′5′H, с подавлением при этом экспрессии эндогенного гена F3′H, который участвует в синтезе цианидина в лепестках лилий, и получение лилий, которые содержат дельфинидин в лепестках. Изобретение позволяет эффективно получать лилии, содержащие в лепестках делфинидин. 4 з.п. ф-лы, 3 ил., 6 табл., 8 пр.
Наверх