Способ сайт-специфического гидролиза днк

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ предусматривает приготовление реакционной смеси, содержащей буферный раствор и исследуемый образец ДНК. Добавляют к смеси ДНК-метилтрансферазу с активностью 2 е.а./мкл, модифицирующую цитозин в положении С5, выбранную из группы: Fsp4HI, НаеIII, HspAI, AluI, в зависимости от того, какой сайт необходимо расщепить, смесь инкубируют в течение часа, полученную С5-метилированную ДНК обрабатывают MD-эндонуклеазой ElmI с активностью 2 е.а./мкл или PkrI с активностью 2 е.а./мкл в зависимости от того, в какой позиции необходимо гидролизовать ДНК. С помощью данного способа можно осуществить исчерпывающий сайт-специфический гидролиз ДНК по шести- и восьминуклеотидным последовательностям, не расщепляемым традиционно используемыми эндонуклеазами рестрикции. 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 6 пр.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для осуществления исчерпывающего сайт-специфического гидролиза фаговой, плазмидной или геномной ДНК по нуклеотидным последовательностям, который невозможно получить с применением традиционно используемых эндонуклеаз рестрикции.

При проведении эпигенетического анализа ДНК, например, при сравнении статуса метилирования ДНК малигнантных и здоровых клеток человека анализируют преимущественно сайты узнавания метилзависимых сайт-специфических ДНК-эндонуклеаз (MD-эндонуклеаз), которые расщепляются с низкой эффективностью, что существенно ограничивает возможности использования данных ферментов.

В настоящее время описано чуть более 350 прототипов эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз), отличающихся друг от друга узнаваемой нуклеотидной последовательностью (1). Для некоторых сайтов узнавания известны рестриктазы, обладающие способностью расщеплять в разных позициях гидролиза относительно сайта узнавания - гетерошизомеров. Однако по-прежнему остается актуальной задача дальнейшего расширения спектра последовательностей, которые можно избирательно гидролизовать на двухцепочечной ДНК, что важно для молекулярной биологии, генной инженерии, биотехнологии и медицины.

Известен способ сайт-специфического гидролиза С5 метилированной ДНК, включающий обработку ДНК сайт-специфической ДНК-эндонуклеазой (обычно эндонуклеазой рестрикции II типа) в реакционном буфере, содержащем 3-10 мМ Mg2+ (2). Данный способ позволяет осуществлять сайт-специфический гидролиз ДНК примерно по 360-380 последовательностям длиной от 3 до 10 п.н.

Однако данным способом невозможно осуществить гидролиз ДНК по целому ряду протяженных последовательностей длиной 6-8 п.н. из-за отсутствия MD-эндонукулеаз (из природных или рекомбинантных бактериальных штаммов-продуцентов), узнающих и сайт-специфично расщепляющих эти последовательности.

Наиболее близким аналогом к заявляемому способу - прототипом - является способ сайт-специфического гидролиза ДНК (3), включающий подготовку реакционной смеси, содержащей буферный раствор и образец исследуемой ДНК, метилирование исследуемой ДНК путем добавления к смеси адениновой ДНК-метилтрансферазы (метилазы) и инкубирования смеси в течение часа, обработку полученной Ν6-метилированной ДНК MD-эндонуклеазой DpnI, расщепляющей ее по образовавшимся в результате метилирования последовательностям 5′-G(m6A)TC-3′, с последующей остановкой реакции инактивированием ферментов при температуре 70°С и анализом результата гидролиза ДНК с помощью гель-электрофореза. Известный способ позволяет гидролизовать только два сайта: 5′-TCGATCGA-3′ и 5′-ATCGATCGAT-3′.

Недостатками данного способа являются:

1) ограниченные функциональные возможности способа, поскольку он позволяет гидролизовать только два сайта гидролиза ДНК с применением небольшого набора адениновых метилаз;

2) неполнота гидролиза по сайтам 5′-GATC-3′ в случае, если аденин метилирован только на одной из цепей ДНК;

3) отсутствие возможности определения разных вариантов позиций гидролиза из-за использования лишь одной рестриктазы DpnI с фиксированной позицией гидролиза относительно сайта узнавания.

Задачей изобретения является расширение функциональных возможностей известного способа.

Технический результат: осуществление исчерпывающего сайт-специфического гидролиза ДНК по шести- и восьминуклеотидным последовательностям, не расщепляемым традиционно используемыми эндонуклеазами рестрикции.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом сайт-специфического гидролиза ДНК, заключающемся в следующем.

Готовят реакционную смесь, содержащую буферный раствор, содержащий 10 мМ Трис-HCl (рН 7,5 при 25°С), 0,1 мМ S-аденозил-L-метионин, 1 мМ дитиотреитол (ДТТ) и 1 мкг образца ДНК. Для метилирования образца исследуемой ДНК к смеси добавляют 1 мкл препарата ДНК-метилтрансферазы с активностью 2 е.а./мкл и смесь инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре. В зависимости от того, какой сайт необходимо расщепить, ДНК-метилтраснферазу выбирают из группы: Fsp4HI, НаеIII, HspAI, AluI. Для сайт-специфического гидролиза полученной С5-метилированной ДНК в смесь добавляют воду и 10-кратный реакционный SE-буфер «Y» (330 мМ Трис-ацетат (рН 7,9 при 25°С), 100 мМ магния ацетат, 660 мМ калия ацетат, 10 мМ ДТТ). Полученную реакционную смесь тщательно перемешивают, после чего добавляют к ней препарат MD-эндонуклеазы PkrI (4) с активностью 2 е.а./мкл или препарат MD-эндонуклеазы ElmI с активностью 2 е.а./мкл в зависимости от того, в какой позиции необходимо гидролизовать ДНК, и повторно инкубируют при температуре 37°С в течение 1 ч с последующей остановкой реакции инактивированием ферментов при температуре 70°С в течение 5 минут и анализом результата гидролиза С5-метилированной последовательности ДНК с помощью гель-электрофореза (5).

Конкретное количество реагентов и объем реакционной смеси зависят от количества исследуемого образца ДНК, которую необходимо подвергнуть исчерпывающему сайт-специфическому гидролизу.

Предлагаемый способ позволяет провести исчерпывающий сайт-специфический гидролиз по трем последовательностям нуклеотидов: 5′-GCNGCNGC-3′, 5′-GGCCGCGC-3′ и 5′-AGCTGCGC-3′, причем каждая из последовательностей может быть отдельно гидролизована в двух различных позициях в зависимости от того, какая из MD-эндонуклеаз используется - PkrI или ElmI:

1) 5′-GCN↓GCN↓GC-3′

3′-CG↑NCG↑NCG -5′

2) 5′-GC↓NGC↓NGC-3′

3′-CGN↑CGN↑CG -5′

3) 5′-GGC↓CGCGC-3′

3′-CCGG↑CGCG -5′

4) 5′-GGCC↓GCGC-3′

3′-CCG↑GCGCG -5′

5) 5′-AGC↓TGCGC-3′

3′-TCGA↑CGCG -5′

6) 5′-AGCT↓GCGC-3′

3′-TCG↑ACGCG -5′

Определяющими отличиями заявляемого способа по сравнению с прототипом являются:

1. Для метилирования образца ДНК используют ДНК-метилтрансферазу, модифицирующую не аденин в положении N6, а цитозин в положении С5, что обеспечивает 100% метилирование ДНК по сайтам узнавания ДНК-метилтрансфераз и образование сайтов узнавания MD-эндонуклеаз, с помощью которых осуществляется гидролиз ДНК.

2. По окончании метилирования ДНК в реакционную смесь добавляют препарат MD-эндонуклеазы, предназначенной для сайт-специфического гидролиза, при этом в зависимости от того, какая позиция гидролиза относительно сайта узнавания является предпочтительной, выбирают одну из MD-эндонуклеаз - PkrI или ElmI, позволяющих расщеплять последовательность ДНК: 5′-GCNGC-3′ перед (для ElmI) или после (для PkrI) центрального нуклеотида.

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает сайт-специфический гидролиз ДНК по позициям, не расщепляемым традиционно используемыми эндонуклеазами рестрикции.

При использовании способа-прототипа ни одна из традиционно используемых для этой цели эндонуклеаз рестрикции не способна расщеплять ДНК по вышеуказанным последовательностям, что ограничивает применение этих ферментов в молекулярной биологии, генной инженерии и медицине.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Сайт-специфический гидролиз ДНК плазмиды pUC19 по последовательности 5′-GCNGCNGC-3′ с помощью MD-эндонуклеазы PkrI

Создание сайта узнавания PkrI и ElmI возможно при метилировании метилазой Fsp4HI. В этом случае образуется разнесенная палиндромная шестинуклеотидная метилированная последовательность 5′-G(5mC)NG(5mC)NGC-3′/3′-CGN(5mC)GN(5mC)G(5mC)G-5′, которая представляет собой два метилированных пересекающихся сайта узнавания PkrI и ElmI (две пересекающихся последовательности 5′-GCNGC-3′, содержащих на обеих цепях по три 5-метилцитозиновых остатка).

В качестве объекта для проверки возможности сайт-специфического расщепления по сайту 5′-GCNGCNGC-3′ выбиралась ДНК плазмиды pUC19, содержащая две таких последовательности.

На фиг. 1 представлено сравнение теоретически рассчитанной с помощью программы Vector NTI картины гидролиза ДНК pUC19 по разнесенной палиндромной шестинуклеотидной последовательности 5′-GCNGCNGC-3′ с экспериментальными данными и приведена картина расщепления ДНК pUC19, метилированной метилазой Fsp4HI, с помощью PkrI после проведения электрофореза в 1% агарозном геле, где дорожки:

1 - исходная ДНК pUC19 (кольцевая форма);

2 - ДНК pUC19, метилированная ДНК-метилтрансферазой Fsp4HI и обработанная MD-эндонуклеазой PkrI;

М - маркер молекулярного веса ДНК 1 kb.

Справа - теоретически смоделированная (в программе Vector NTI) картина расщепления ДНК pUC19 по сайту 5′-GCNGCNGC-3′.

Как видно из фиг. 1, теоретически рассчитанная картина расщепления ДНК и результаты эксперимента совпадают.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о возможности получения полного (100%) сайт-специфического гидролиза ДНК по шестинуклеотидной последовательности 5′-GCNGCNGC-3′ с помощью предварительного метилирования ДНК метилазой Fsp4HI и последующим расщеплением ее MD-эндонуклеазой PkrI.

Пример 2. Сайт-специфический гидролиз ДНК аденовируса типа 2 по последовательности 5′-GGCCGCGC-3′ с помощью эндонуклеазы ElmI

Создание сайта узнавания PkrI и ElmI возможно при совместном метилировании метилазами НаеIII и HspAI. В этом случае образуется непалиндромная восьминуклеотидная метилированная последовательность

внутри которой содержится сайт узнавания PkrI и ElmI, содержащий три 5-метилцитозиновых остатка (подчеркнут).

Удобным объектом для проверки возможности сайт-специфического расщепления по сайту 5′-GGCCGCGC-3′ является ДНК аденовируса типа 2 - Ad2 (производство «New England Biolabs», США), так как она содержит 7 таких сайтов.

На фиг. 2 представлено сравнение теоретически рассчитанной с помощью программы Vector NTI картины гидролиза аденовирусной ДНК по непалиндромной восьминуклеотидной последовательности 5′-GGCCGCGC-3′ с экспериментальными данными и приведена картина расщепления метилированной метилазами НаеIII и HspAI аденовирусной ДНК с помощью ElmI после проведения электрофореза в 1% агарозном геле, где дорожки:

1 - ДНК Аd2;

2 - ДНК Ad2, метилированная ДНК-метилтрансферазами НаеIII и HspAI и обработанная MD-эндонуклеазой ElmI;

М - маркер молекулярного веса ДНК 1 kb.

Справа - теоретически смоделированная (в программе Vector NTI) картина расщепления ДНК фага лямбда по сайту 5′-GGCCGCGC-3′.

Как видно из фиг. 2, теоретически рассчитанная картина расщепления ДНК и результаты эксперимента совпадают.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о возможности получения полного (100%) сайт-специфического гидролиза ДНК по восьминуклеотидной последовательности 5′-GGCCGCGC-3′ с помощью предварительного метилирования ДНК метилазами НаеIII и HspAI и последующим расщеплением ее MD-эндонуклеазой ElmI.

Пример 3. Сайт-специфический гидролиз ДНК фага лямбда по последовательности 5′-AGCTGCGC-3′ с помощью эндонуклеазы ElmI

Создание сайта узнавания PkrI и ElmI возможно при совместном метилировании метилазами AluI и HspAI. В этом случае образуется непалиндромная восьминуклеотидная метилированная последовательность:

внутри которой содержится сайт узнавания ElmI и PkrI, содержащий три 5-метилцитозиновых остатка (подчеркнут).

Удобным объектом для проверки возможности сайт-специфического расщепления по сайту 5′-AGCTGCGC-3′ является ДНК фага лямбда, так как она содержит 7 таких сайтов.

На фиг. 3 представлено сравнение теоретически рассчитанной с помощью программы Vector NTI картины гидролиза ДНК фага лямбда по непалиндромной восьминуклеотидной последовательности 5′-AGCTGCGC-3′ с экспериментальными данными и приведена картина расщепления метилированной метилазами AluI и HspAI ДНК фага лямбда с помощью ElmI после проведения электрофореза в 1% агарозном геле, где дорожки:

1 - исходная ДНК фага лямбда;

2 - ДНК фага лямбда, метилированная ДНК-метилтрансферазами AluI и HspAI и обработанная MD-эндонуклеазой ElmI;

M - маркер молекулярного веса ДНК 1 kb.

Справа - теоретически смоделированная (в программе Vector NTI) картина расщепления ДНК фага лямбда по сайту 5′-AGCTGCGC-3′.

Как видно из фиг. 3, теоретически рассчитанная картина расщепления ДНК и результаты эксперимента совпадают.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о возможности получения полного (100%) сайт-специфического гидролиза ДНК по восьминуклеотидной последовательности 5′-AGCTGCGC-3′ с помощью предварительного метилирования ДНК метилазами AluI и HspAI и последующим расщеплением ее MD-эндонуклеазой ElmI.

Пример 4. Осуществление сайт-специфического гидролиза по последовательности 5′-GCNGCNGC-3′

Все расчеты количества используемых реагентов приведены для объема реакционной смеси 50 мкл, но могут быть масштабированы.

К 10 мкл реакционной смеси, содержащей буферный раствор, содержащий 10 мМ Трис-HCl (рН 7,5 при 25°С), 0,1 мМ 5-аденозил-L-метионин, 1 мМ ДТТ и 1 мкг образца гидролизуемой ДНК, добавляли 1 мкл препарата ДНК-метилтрансферазы Fsp4HI с активностью 2 е.а./мкл. Реакционную смесь инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре (24-30°С), после чего в смесь добавляли 36 мкл воды и 4 мкл 10-кратного реакционного SE-буфера «Y» (330 мМ Трис-ацетат (рН 7,9 при 25°С), 100 мМ магния ацетат, 660 мМ калия ацетат, 10 мМ ДТТ). Полученную реакционную смесь объемом 50 мкл тщательно перемешивали, после чего добавляли 2 мкл препарата MD-эндонуклеазы PkrI с активностью 2 е.а./мкл - для получения гидролиза в позиции после центральных нуклеотидов N -

5′-GCN↓GCN↓GC-3′

3′-CG↑NCG↑NCG -5′

или добавляли 2 мкл препарата MD-эндонуклеазы ElmI с активностью 2 е.а./мкл - для получения гидролиза перед центральными нуклеотидами N -

5′-GC↓NGC↓NGC-3′

3′-CGN↑CGN↑CG -5′

Полученную реакционную смесь повторно инкубировали при температуре 37°С в течение 1 часа с последующей остановкой реакции инактивированием ферментов при температуре 70°С в течение 5 минут. Результаты гидролиза анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле.

Пример 5. Осуществление сайт-специфического гидролиза по последовательности 5′-GGCCGCGC-3′

Все расчеты количества используемых реагентов приведены для объема реакционной смеси 50 мкл.

К 10 мкл буферного раствора, содержащего 10 мМ Трис-HCl (рН 7,5 при 25°С), 0,1 мМ S-аденозил-L-метионин, 1 мМ ДТТ и 1 мкг образца гидролизуемой ДНК, добавляли 0,5 мкл препарата ДНК-метилтрансферазы НаеIII с активностью 2 е.а./мкл и 0,5 мкл ДНК-метилтрансферазы HspAI с активностью 2 е.а./мкл.

Реакционную смесь инкубировали в течение 1 часа при 37°С, после чего в смесь добавляли 36 мкл воды и 4 мкл 10-кратного реакционного SE-буфера «Y» (330 мМ Трис-ацетат (рН 7,9 при 25°С), 100 мМ магния ацетат, 660 мМ калия ацетат, 10 мМ ДТТ). Полученную реакционную смесь объемом 50 мкл тщательно перемешивали пипеткой, после чего для гидролиза в позиции после третьего нуклеотида на верней цепи и после четвертого нуклеотида на нижней цепи -

5′-GGC↓CGCGC-3′

3′-CCGG↑CGCG -5′

добавляли 2 мкл препарата MD-эндонуклеазы ElmI с активностью 2 е.а./мкл, а для получения гидролиза в последовательности

5′-GGCC↓GCGC-3′

3′-CCG↑GCGCG -5′

в позиции, указанной стрелочками, добавляли 2 мкл препарата MD-эндонуклеазы PkrI с активностью 2 е.а./мкл.

Полученную реакционную смесь повторно инкубировали при температуре 37°С в течение 1 часа с последующей остановкой реакции инактивированием ферментов при температуре 70°С в течение 5 минут. Результаты гидролиза анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле.

Пример 6. Осуществление сайт-специфического гидролиза по последовательности 5′-AGCTGCGC-3′

Все расчеты количества используемых реагентов приведены для объема реакционной смеси 50 мкл.

К 10 мкл буферного раствора, содержащего 10 мМ Трис-HCl (рН 7,5 при 25°С), 0,1 мМ S-аденозил-L-метионин, 1 мМ ДТТ и 1 мкг образца гидролизуемой ДНК, добавляли 0,5 мкл препарата ДНК-метилтрансферазы AluI с активностью 2 е.а./мкл и 0,5 мкл ДНК-метилтрансферазы HspAI с активностью 2 е.а./мкл. Реакционную смесь инкубировали в течение 1 часа при 37°С, после чего в смесь добавляли 36 мкл воды и 4 мкл 10-кратного реакционного SE-буфера «Y» (330 мМ Трис-ацетат (рН 7,9 при 25°С), 100 мМ магния ацетат, 660 мМ калия ацетат, 10 мМ ДТТ). Полученную реакционную смесь объемом 50 мкл тщательно перемешивали пипеткой, после чего для получения гидролиза в позиции после третьего нуклеотида на верхней цепи и после четвертого нуклеотида на нижней цепи -

5′-AGC↓TGCGC-3′

3′-TCGA↑CGCG -5′

добавляли 2 мкл препарата MD-эндонуклеазы ElmI с активностью 2 е.а./мкл, а для получения гидролиза в последовательности

5′-AGCT↓GCGC-3′

3′-TCG↑ACGCG -5′

в позиции, указанной стрелочками, добавляли 2 мкл препарата MD-эндонуклеазы PkrI с активностью 2 е.а./мкл.

Полученную реакционную смесь повторно инкубировали при температуре 37°С в течение 1 часа. По окончании инкубации все ферменты в реакционной смеси инактивировали инкубацией пробирки с реакционной смесью при температуре 70°С в течение 5 минут. Результаты гидролиза анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле.

Предлагаемый способ обеспечивает возможность получить исчерпывающий гидролиз ДНК, предварительно метилированной подобранными для этих целей ДНК-метилтрансферазами, а затем обработанной MD-эндонуклеазой PkrI или ElmI, каждая из которых обеспечивает гидролиз ДНК по шести- и восьминуклеотидным последовательностям, не расщепляемым традиционно используемыми эндонуклеазами рестрикции.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Pingoud Α., Wilson G.G., Wende W.Type II restriction endonucleases - a historical perspective and more // Nucleic Acids Res. - 2014. - V. 42. - P. 7489-527.

2. Pingoud Α., Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases // Nucleic Acids Research. - 2001. - V. 29. - P. 705-3727

3. McClelland M, Kessler LG, Bittner M. Site-specific cleavage of DNA at 8- and 10-base-pair sequences // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1984. - V.81. - P. 983-987.

4. Чернухин Β.Α., Наякшина Т.Н, Гончар Д.Α., Томилова Ю.Э., Тарасова М.В., Дедков B.C., Михненкова Н.А., Дегтярёв С.Х. Новая сайт-специфическая метилзависимая ДНК эндонуклеаза PkrI узнает и расщепляет метилированную последовательность 5`-GCNAGC-3`/3`-CGNCG-5`, содержащую не менее 3-х 5-метилцитозинов // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. - 2011. - Т. 7. - №3, С. 35-42.

5. Maniatis Т., Fritsch E.F. and Sambrook J. Molecular cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1982. 545 pages.

1. Способ сайт-специфического гидролиза ДНК, включающий подготовку реакционной смеси, содержащей буферный раствор и образец исследуемой ДНК, метилирование ДНК путем добавления к смеси препарата ДНК-метилтрансферазы и инкубирования смеси в течение часа при комнатной температуре, добавление в смесь реакционного буфера и препарата MD-эндонуклеазы и повторное инкубирование полученной реакционной смеси при температуре 37°С в течение 1 ч с последующей остановкой реакции инактивированием ферментов при температуре 70°С и анализом результата гидролиза ДНК с помощью гель-электрофореза, отличающийся тем, что для метилирования образца ДНК используют ДНК-метилтрансферазу с активностью 2 е.а./мкл, модифицирующую цитозин в положении С5, выбранную из группы: Fsp4HI, HaeIII, HspAI, AluI, в зависимости от того, какой сайт необходимо расщепить, а для сайт-специфического гидролиза полученной С5-метилированной ДНК в реакционную смесь добавляют препарат MD-эндонуклеазы PkrI с активностью 2 е.а./мкл или препарат ElmI с активностью 2 е.а./мкл в зависимости от того, в какой позиции необходимо гидролизовать ДНК.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для метилирования ДНК в качестве реакционного буфера используют раствор, содержащий 10 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 0,1 мМ S-аденозил-L-метионин, 1 мМ дитиотреитол.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для сайт-специфического гидролиза С5-метилированной ДНК используют 10-кратный SE-буфер «Y», содержащий 330 мМ Трис-ацетат (рН 7,9 при 25°С), 100 мМ магния ацетат, 660 мМ калия ацетат, 10 мМ дитиотреитол.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены способ и система для определения нуклеотидной последовательности в заданной области генома плода.

Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования риска развития первичной открытоугольной глаукомы (ПОУГ). У индивидуумов русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья России, из периферической венозной крови выделяют ДНК, после чего проводят анализ полиморфизмов генов TNFα, Ltα, TNFR1 и TNFR2.

Настоящее изобретение относится к количественному способу определения, обладает ли обследуемый человек нарушенной функцией репарации ошибочно спаренных оснований ДНК.

Изобретение относится к области медицины и касается способа, тест-системы диагностики диабетической нефропатии. Сущность способа заключается в том, что в образце от субъекта определяют биомаркер, который представляет собой подобный антигену CD5.

Группа изобретений относится к области молекулярной биологии и может быть использована в молекулярно-генетической диагностике онкологических заболеваний. Способ предусматривает проведение биоинформационного анализа предшествующих публикаций о генах-онкомаркерах колоректального рака и отбор генов, метилирование сайтов PuCGPy регуляторных областей которых происходит с высокой частотой в ДНК клеток колоректального рака, с учетом возможности выявления метилирования гена на ранних стадиях заболевания и формирование панели из следующих генов-онкомаркеров колоректального рака: CNRIP1, ELMO1, ESR1, FBN1, RXRg, RYR2, SEPT9b, SOCS3 и UCHL1.

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и касается способа дифференциации токсигенных и атоксигенных штаммов холерных вибрионов О1 серогруппы по ингибирующей активности.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан диагностический способ in vitro диагностики рака эндометрия.

Изобретение касается способа диагностики волчанки у человека. Представленное изобретение включает определение наличия вариации по меньшей мере в одном локусе риска SLE, причем указанная вариация по меньшей мере в одном локусе представляет собой аллель риска однонуклеотидного полиморфизма (SNP).

Изобретение относится к молекулярной биологии и может быть использовано при проведении медико-биологических исследований. Предложен способ подготовки суспензии лимфоцитов человека в этанол-уксусном фиксаторе для выделения ДНК, включающий центрифугирование указанной суспензии и удаление надосадочной жидкости.

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, ветеринарной медицины, в частности к набору олигодезоксирибонуклеотидов для амплификации и детекции видоспецифичного фрагмента ДНК Anaplasma marginale методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме «реального времени».

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ сайт-специфического гидролиза С5-метилированной последовательности ДНК. Готовят реакционную смесь, содержащую буферный раствор и образец С5-метилированной ДНК, добавляют к смеси диметилсульфоксид до конечной концентрации 15-25%, а затем MD-эндонуклеазу, смесь инкубируют в течение часа при 30-37°C с последующим анализом результата гидролиза ДНК методом гель-электрофореза, при этом в качестве MD-эндонуклеазы используют GlaI с концентрацией 4-8 е.а./мкл или PcsI с концентрацией 1-2 е.а./мкл. Изобретение позволяет повысить эффективность сайт-специфического гидролиза С5-метилированной последовательности ДНК. 3 з.п. ф-лы, 3 ил., 4 пр.

Изобретение относится к области медицинской диагностики и касается прогнозирования интенсивности болевого синдрома в раннем послеоперационном периоде у больных хроническим калькулезным холециститом, русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья России. Способ включает забор крови и выделение ДНК из периферической венозной крови. После выделения ДНК проводят анализ полиморфизмов генов IL-1А -889Т>С, IL-5 -703С>Т и прогнозируют более выраженную боль у больных хроническим калькулезным холециститом в 18 часов и в 22 часа первых суток после холецистэктомии в случае выявления генотипов -889ТТ и -889СТ IL-1A. Прогнозируют интенсивные болевые ощущения в 8 часов вторых суток после операции при выявлении генотипов -703СТ и -703ТТ IL-5. 5 ил.

Изобретение относится к области медицины, в частности к молекулярной биологии и онкологии, и предназначено для прогнозирования развития острой почечной недостаточности (ОПН) после кратковременной ишемии почки. Из тканевых проб почки до ишемии выделяют тотальную РНК, получают кДНК, осуществляют амплификацию в режиме реального времени и рассчитывают относительную экспрессию генетических локусов CASP3, CASP8, CASP9 и АСТВ. При уровне относительной экспрессии генов RECASP3=(3,17±0,9)*10-2; RECASP8=(5,87±0,8)*10-2 и RECASP9=(4,34±1,6)*10-2 в ткани почек прогнозируют развитие ОПН в послеоперационный период. При уровне RECASP3=(6,08±1,2)*10-2; RECASP8=(15,87±3,6)*10-2 и RECASP9=(29,26±9,5)*10-2 прогнозируют благоприятный послеоперационный период. Изобретение позволяет осуществить ранний прогноз осложнений развития ОПН у больных, перенесших лапароскопическую резекцию почки в условиях тепловой ишемии. 2 табл., 2 пр.

Изобретение относится к биохимии. Описаны выделенные моноклональные антитела, которые специфически связываются с PD-1 с высокой аффинностью. Представлены молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие описанные антитела, экспрессионные векторы, клетки-хозяева и способы экспрессии описанных антител. Также представлены биспецифические молекулы и фармацевтические композиции, содержащие описанные антитела. Описаны способы детектирования PD-1 и лечения различных заболеваний, включая рак и инфекционные заболевания. Изобретение расширяет арсенал антител против PD-1. 10 н. и 25 з.п. ф-лы, 54 ил., 7 табл., 25 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описаны способ и система для определения того, существует ли аномалия генома. При этом аномалия генома представляет собой анеуплоидию. Способ включает стадии выделения ядросодержащих эритроцитов плода из образца от беременной женщины, секвенирования полного генома указанных ядросодержащих эритроцитов, чтобы получить результат секвенирования, и на основе указанного результате секвенирования определения того, существует ли аномалия генома в указанных ядросодержащих эритроцитах. Предложенная группа изобретений может быть использована в медицине. 2 н. и 18 з.п. ф-лы, 11 ил., 2 табл.

Изобретение относится к биохимии. Предоставлена композиция для осуществления реакции замещения цепей нуклеиновых кислот, содержащая первый и второй комплексы нуклеиновых кислот, каждый из которых содержит первую, вторую, третью и четвертую цепи нуклеиновых кислот, где каждая из цепей содержит последовательно первый, второй и третий фрагменты. Изобретение позволяет получать молекулярные копьютеры с наноразмерами. 9 з.п. ф-лы, 19 ил., 2 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области медицины, в частности к медицинской генетике и онкогинекологии, и предназначено для прогнозирования риска развития рака яичников. Осуществляют выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови и комплексную детекцию мутаций c.5266dupC (BRCA1), c.181T>G (BRCA1), del5395 (CHEK2) и p.R145W (CHEK2) у одного пациента. Обнаружение одной из указанных мутаций свидетельствует о повышенном риске развития рака яичников. Изобретение обеспечивает упрощение способа определения мутаций c.5266dupC, c.181T>G (BRCA1), del5395 и p.R145W (CHEK2) и сокращение времени исследования до 1 дня. 4 ил., 5 пр.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для определения степени гетероплазмии мутаций митохондриального генома. Проводят полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени, вычисляют значение ΔCt, определяют коэффициент эффективности амплификации и рассчитывают степень гетероплазмии мутаций митохондриального генома по формуле. Изобретение обеспечивает простой и доступный для использования в клинической практике способ определения гетероплазмии мутаций митохондриального генома. 5 пр.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для определения риска развития артериальной гипертензии. Осуществляют забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени и определение инсерции/делеции (I- и D-аллели) Alu-фрагмента гена ангиотензинпревращающего фермента. Риск развития артериальной гипертензии у работающих в условиях превышения уровня шума выше предельно допустимого при генотипе I/I гена ангиотензинпревращающего фермента оценивают ниже 50%, при генотипе I/D - 50-70%, а при генотипе D/D - выше 70%. Изобретение обеспечивает повышение скорости определения риска развития артериальной гипертензии у лиц, подвергающихся воздействию шума, и упрощение способа при одновременном повышении степени его достоверности. 3 ил., 3 пр.
Изобретение относится к области медицины и предназначено для диагностики предрасположенности к посттравматическому остеоартрозу коленного сустава. У пациентов существляют генотипирование полиморфизма rs2276109 (A-82G) гена ММР-12. При выявлении генотипа GG диагностируют генетическую предрасположенность к развитию посттравматического остеоартроза коленного сустава. Изобретение обеспечивает увеличение достоверности выявления генетической предрасположенности человека к развитию остеоартроза коленного сустава после травматического повреждения за счет определения полиморфизма в гене матриксной металлопротеиназы 12. 1 з.п. ф-лы, 3 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ предусматривает приготовление реакционной смеси, содержащей буферный раствор и исследуемый образец ДНК. Добавляют к смеси ДНК-метилтрансферазу с активностью 2 е.а.мкл, модифицирующую цитозин в положении С5, выбранную из группы: Fsp4HI, НаеIII, HspAI, AluI, в зависимости от того, какой сайт необходимо расщепить, смесь инкубируют в течение часа, полученную С5-метилированную ДНК обрабатывают MD-эндонуклеазой ElmI с активностью 2 е.а.мкл или PkrI с активностью 2 е.а.мкл в зависимости от того, в какой позиции необходимо гидролизовать ДНК. С помощью данного способа можно осуществить исчерпывающий сайт-специфический гидролиз ДНК по шести- и восьминуклеотидным последовательностям, не расщепляемым традиционно используемыми эндонуклеазами рестрикции. 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 6 пр.

Наверх