Способ получения олигомеров пептидно-нуклеиновых кислот, содержащих карбоксиэтильный заместитель в α- или γ-положении боковой цепи



Способ получения олигомеров пептидно-нуклеиновых кислот, содержащих карбоксиэтильный заместитель в α- или γ-положении боковой цепи
Способ получения олигомеров пептидно-нуклеиновых кислот, содержащих карбоксиэтильный заместитель в α- или γ-положении боковой цепи
Способ получения олигомеров пептидно-нуклеиновых кислот, содержащих карбоксиэтильный заместитель в α- или γ-положении боковой цепи

 

C07K1/04 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2604732:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины Федерального медико-биологического агенство"(ФГБУ ФНКЦ ФХМ ФМБА России) (RU)

Изобретение относится к области биоорганической химии, фармакологии, молекулярной биологии и может быть использовано для получения терапевтически значимых полиамидных миметиков олигонуклеотидов (ПНК), перспективных лекарств направленного действия, обладающих повышенной стабильностью в биологических средах. Предложен способ получения олигомеров пептидно-нуклеиновых кислот, содержащих карбоксиэтильный заместитель в α- или γ-положении боковой цепи, заключающийся в наращивании на полистирольном носителе полиамидной последовательности, содержащей α-карбоксиэтил-замещенные звенья общей формулы -NH-(CH2)2N(COCH2B)-CH[(CH2)2COOH]-CO- или γ-карбоксиэтил-замещенные звенья общей формулы -NH-CH[(CH2)2COOH]-CH2-N(COCH2B)-CH2-CO-, где B - пуриновое или пиримидиновое нуклеиновое основание, с последующей обработкой носителя смесью на основе трифторуксусной кислоты и трифторметансульфокислоты, в котором для увеличения выхода и упрощения очистки целевых олигомеров, а именно уменьшения количества побочных продуктов, носитель предварительно охлаждают до -45÷-50ºС, а вместо м-крезола к смеси кислот добавляют триизопропилсилан при объемном соотношении реагентов трифторуксусная кислота:трифторметансульфокислота:триизопропилсилан 8:1:1. Способ позволяет практически полностью устранить образование побочных продуктов, связанных с N-концевыми перегруппировками полиамидного остова. Таким образом, состав конечной реакционной смеси существенно обогащается целевым олигомером ПНК, что облегчает его дальнейшую очистку с помощью ВЭЖХ. 6 ил., 3 пр.

 

Способ получения олигомеров пептидно-нуклеиновых кислот, содержащих карбоксиэтильный заместитель в α- или γ-положении боковой цепи, заключающийся в наращивании на полистирольном носителе полиамидной последовательности, содержащей α-карбоксиэтил-замещенные звенья общей формулы -NH-(CH2)2N(COCH2B)-CH[(CH2)2COOH]-CO- или γ-карбоксиэтил-замещенные звенья общей формулы -NH-CH[(CH2)2COOH]-CH2-N(COCH2B)-CH2-CO-, где B - пуриновое или пиримидиновое нуклеиновое основание, по известному протоколу с последующей обработкой носителя смесью на основе трифторуксусной кислоты и трифторметансульфокислоты, отличающийся тем, что для увеличения выхода и упрощения очистки целевых олигомеров, а именно уменьшения количества побочных продуктов, носитель предварительно охлаждают до -45÷-50ºС, а вместо м-крезола к смеси кислот добавляют триизопропилсилан при объемном соотношении реагентов трифторуксусная кислота / трифторметансульфокислота / триизопропилсилан 8:1:1.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к области биоорганической химии, фармакологии, молекулярной биологии и может быть использовано для получения терапевтически значимых миметиков олигонуклеотидов, перспективных лекарств направленного действия, обладающих повышенной стабильностью в биологических средах. Предлагаемый способ отщепления не только повышает выход целевых олигомеров пептидно-нуклеиновых кислот (ПНК), несущих отрицательно заряженные карбоксиэтильные группы (α- и γ-кэ-ПНК, или α- и γ-ce-PNA в английской транскрипции), но и значительно снижает протекание побочных процессов. Использование настоящего способа отщепления α- и γ-кэ-олигомеров ПНК будет способствовать созданию новых исследовательских инструментов молекулярной биологии и медицины, разработке стабильных чувствительных элементов биосенсоров.

Уровень технического состояния

В настоящее время большой интерес исследователей привлекает относительно новый класс веществ - так называемые пептидно-нуклеиновые кислоты. Они способны специфично связываться с комплементарными последовательностями ДНК и РНК с образованием более прочных комплексов по сравнению с природными аналогами. Наиболее известные аминоэтилглициновые ПНК (АЭГ-ПНК, aeg-PNA) [1] имеют ахиральный незаряженный остов (Фиг. 1) и, как следствие, ряд недостатков: низкая растворимость в воде, склонность к самоагрегации, низкая проникающая способность через клеточные мембраны, способность к образованию как параллельных, так и антипараллельных дуплексов с нуклеиновыми кислотами.

В последние десять лет был предложен целый ряд модификаций ПНК [2]. Один из основных подходов для получения ПНК с новыми свойствами состоит во введении заместителей в различные положения остова олигомера, среди которых наиболее перспективными для терапевтического и/или диагностического применения является модификация с введением отрицательного заряда в боковую цепь остова.

Наличие отрицательного заряда дает возможность управлять процессом гибридизации за счет изменения ионной силы раствора [3], значительно улучшает растворимость олигомеров в воде и упрощает работу с ними в биологических средах.

К сегодняшнему дню описаны различные модификации аминоэтилглициновой структуры ПНК с введением в остов отрицательного заряда:

1) тиминовый мономер γ-ПНК на основе L-Asp (введение радикала -CH2COOH в γ-положение остова) [4, 5] и олигомеры АЭГ ПНК с включением 1 или 3 модифицированных мономеров [3, 5];

2) олигоаспарагинаты (AspПНК, AspPNA) [6];

3) Nγ-карбоксиалкил-замещенные тиминовые мономеры и олигомеры (Nγ-CH2COOH и Nγ-(CH2)5COOH) [7] и др.

Синтез новых модифицированных пептидно-нуклеиновых кислот, содержащих карбоксиэтильный заместитель в α- или γ-положении боковой цепи (α-кэ и γ-кэ) (Фиг. 1) ранее был описан в наших работах [8-10], являющихся прототипом настоящего изобретения. Данные подходы, однако, позволили выделить только короткие последовательности (тетра- и гексамеры) [8, 10]. Декамеры ПНК получали либо с очень низким выходом (см. ниже гомотиминовые декамеры), либо они полностью разрушались при отщеплении с носителя [9].

В стандартном Boc-протоколе твердофазного синтеза в основном в качестве твердой подложки используют полистирол с (4-метилбензгидрил)аминогруппами, сшитый 1-2 % дивинилбензола, так называемая MBHA смола (далее - носитель) [1].

Обычно для расщепления связи олигомер-носитель используют стандартную для АЭГ ПНК методику «low-high TFMSA», заключающуюся в последовательной обработке носителя растворами с низкой и высокой концентрацией трифторметансульфокислоты в течение 1 ч при 0ºС (раствор «low TFMSA» - трифторуксусная кислота/м-крезол/диметилсульфид/трифторметансульфокислота (11:2:6:1, по объему); раствор «high TFMSA» - трифторуксусная кислота/м-крезол/трифторметансульфокислота (8:1:1, по объему)) [1]. Однако его основной недостаток состоит в низких выходах кэ-замещенных олигомеров.

Использование данного способа для отщепления декамеров H2N-(T10)α-кэ-CONH2 и H2N-(T10)γ-кэ-CONH2 (Фиг. 2) приводило практически к полному расщеплению целевых последовательностей. Выделить удалось только γ-декамер (выход 0,7 %) (Таблица 1).

Снижение времени обработки носителя раствором «low TFMSA» до 15 мин и раствором «high TFMSA» до 20 мин позволило получить α-олигомер, однако также с чрезвычайно низким выходом (0,2 %) (Фиг. 3А) (Таблица 1).

Декамер H2N-(C4T6)α-кэ-CONH2 (Фиг. 2, 4А) в этих условиях также подвергался практически полному разрушению. Из-за преобладания побочных продуктов целевой олигомер выделить не удалось [9], а короткоцепочечные олигомеры АЭГ ПНК с включением γ-кэ-замещенных тиминовых мономеров H2N-ACATγ-кэ-CONH2 и H2N-CATγ-кэCATγ-кэ-CONH2 (Фиг. 2) были получены с выходами 4,2 и 3,1 % соответственно (Таблица 1).

Другой метод расщепления синтезированного олигомера ПНК и носителя заключается в использовании смеси трифторуксусная кислота/трифторметансульфокислота/триизопропилсилан в объемном соотношении 3:1:0,1. Впервые она была применена в отношении незаряженных АЭГ ПНК при субмономерной стратегии синтеза гомопиримидиновых олигомеров. При этом температурные и временные режимы не были описаны [11]. Ранее на примере тетрамера H2N-Gα-кэCAT-CONH2 (Фиг. 2) мы показали возможность применения данной смеси для получения карбоксиэтил-замещенных ПНК. Преимущество данной методики стало очевидным только в случае сильного предварительного охлаждения носителя до -30°С. Тетрамер H2N-Gα-кэCAT-CONH2 был выделен с выходом 35 % [8]. Результат был также подтвержден на короткоцепочечных γ-олигомерах - для тетрамера H2N-ACATγ-кэ-CONH2 выход синтеза увеличился с 4,2 до 31 %, а для гексамера H2N-CATγ-кэCATγ-кэ-CONH2 - с 3,1 до 27 % [10], и на α-декамерах - олигомер H2N-(C4T6)α-кэ-CONH2 не удалось отделить от укороченной на одно мономерное звено последовательности с массой 3017 Да (Фиг. 4Б, 5А), а выход H2N-(T10)α-кэ-CONH2 увеличился с 0,2 до 2,3 % (Фиг. 3Б, таблица 1). Время обработки для тетра- и гексамеров составило 45 мин, для декамеров - 1,5 ч.

Заявляемый способ разрыва ковалентной связи олигомера ПНК с носителем включает обработку последнего раствором трифторуксусная кислота/ трифторметансульфокислота/ триизопропилсилан в объемном соотношении 8:1:1 с сильным предварительным охлаждением носителя до -45÷-50°С. Время обработки 10- и 12-меров составило 2 ч. Уменьшение концентрации трифторметансульфокислоты, увеличение концентрации триизопропилсилана (скавенджер, «ловушка радикалов») и сильное охлаждение носителя приводит к подавлению побочных реакций, упрощению выделения кэ-олигомеров ПНК и соответственно увеличению общего выхода синтеза.

Преимущество заявляемого способа подтвердили на примере гомопиримидиновых декамеров H2N-(T10)α-кэ-CONH2 (Фиг. 3В), H2N-(T10)γ-кэ-CONH2 и H2N-(C4T6)α-кэ-CONH2 (Фиг. 4В, 5Б) и коротких последовательностей H2N-ACATγ-кэ-CONH2 и H2N-CATγ-кэCATγ-кэ-CONH2 (Таблица 1).

Используя заявляемый способ, также были синтезированы 12-меры ПНК с чередующимися АЭГ и γ-карбоксиэтил-замещенными мономерами ПНК: Gly-Tγ-кэCACγ-кэCTCγ-кэCCTγ-кэCC (ПНК 1) и Gly-Tγ-кэCAγ-кэCCγ-кэTCγ-кэCCγ-кэTCγ-кэC (ПНК 2) с выходами 7,3 и 7,1 % соответственно. Изучали способность этих олигомеров к комплементарному связыванию с олигонуклеотидом d(GGAGGGAGGTGA) (ДНК 2). По данным УФ-плавления и КД-спектроскопии (Фиг. 6) олигомеры ПНК 1 и ПНК 2 образуют устойчивые антипараллельные дуплексы с комплементарной цепью ДНК 2. Причем температуры плавления этих дуплексов существенно выше, чем температура плавления антипараллельного дуплекса олигонуклеотидов ДНК 1/ДНК 2 ((d(TCACCTCCCTCC)/ d(GGAGGGAGGTGA))). Тпл (ПНК 1/ДНК 2) = 66,0°С, Тпл (ПНК 2/ДНК 2) = 82,9°С, Тпл (ДНК 1/ДНК 2) = 56,4°С.

Результаты данного исследования показывают перспективность синтеза и дальнейшего изучения свойств карбоксиэтил-замещенных олигомеров ПНК как in vitro, так и in vivo (за счет повышенной растворимости).

Раскрытие изобретения и технический результат

Техническим результатом настоящего изобретения является разработка способа отщепления α- и γ-карбоксиэтил-содержащих олигомеров ПНК с полистирольного носителя, предусматривающее практически полное устранение образования побочных продуктов, связанных с N-концевыми перегруппировками остова. Это существенно облегчает дальнейшую очистку олигомеров ПНК с помощью ВЭЖХ.

Технический результат достигается тем, что для постсинтетической обработки олигомеров использовали триизопропилсилан вместо м-крезола, вводимого в смесь трифторуксусная кислота/трифторметансульфокислота. Кроме того, мы определили соотношение реагентов и температурный режим реакции, при котором выходы олигомеров значительно увеличиваются.

Описание чертежей

На Фиг. 1 представлена общая структура олигомеров ПНК.

На Фиг. 2 представлены структуры синтезированных карбоксиэтил-замещенных олигомеров ПНК: H2N-Gα-кэCAT-CONH2, H2N-ACATγ-кэ-CONH2, H2N-CATγ-кэCATγ-кэ-CONH2, H2N-(T10)α-кэ-CONH2, H2N-(T10)γ-кэ-CONH2, H2N-(C4T6)α-кэ-CONH2, Gly-Tγ-кэCACγ-кэCTCγ-кэCCTγ-кэCC (ПНК 1) и Gly-Tγ-кэCAγ-кэCCγ-кэTCγ-кэCCγ-кэTCγ-кэC (ПНК 2).

На Фиг 3. представлено сравнение MALDI-TOF-масс-спектров реакционных смесей, полученных при отщеплении олигомера H2N-(T10)α-кэ-CONH2 по известным методикам «low-high TFMSA» (15 и 20 мин) (А) и TFA/TFMSA/TIS (3:1:0,1 по объему, 1,5 ч) (Б), а также предлагаемым способом (2 ч) (В).

На Фиг. 4 представлено сравнение MALDI-TOF-масс-спектров реакционных смесей, полученных при отщеплении олигомера H2N-(C4T6)α-кэ-CONH2 по известным методикам «low-high TFMSA» (15 и 20 мин) (А) и TFA/TFMSA/TIS (3:1:0,1 по объему, 1,5 ч), а также предлагаемым способом (2 ч) (В).

На Фиг. 5 представлены ВЭЖХ-профили реакционных смесей, полученных при отщеплении олигомера H2N-(C4T6)α-кэ-CONH2 по известной методикой TFA/TFMSA/TIS (3:1:0,1 по объему, 1,5 ч), а также предлагаемым способом (2 ч) (В).

На Фиг. 6 представлен результат исследования гибридизационных характеристик для 12-меров ПНК с чередующимися АЭГ и γ-карбоксиэтил-замещенными мономерами Gly-Tγ-кэCACγ-кэCTCγ-кэCCTγ-кэCC (ПНК 1) и Gly-Tγ-кэCAγ-кэCCγ-кэTCγ-кэCCγ-кэTCγ-кэC (ПНК 2), а именно кривые УФ-плавления и КД-спектры антипараллельных комплексов ПНК/ДНК и ДНК/ДНК.

Ниже приведены примеры реализации изобретения.

В примере 1 описан синтез ПНК олигомеров.

В примере 2 приведен анализ влияния условий постсинтетической обработки полистирольного носителя с иммобилизованным олигомером ПНК на состав реакционных смесей методами MALDI-TOF-масс-спектрометрии и ОФ ВЭЖХ.

В примере 3 описаны гибридизационные характеристики 12-меров ПНК.

Примеры реализации

Пример 1. Синтез олигомеров ПНК

Мономеры АЭГ, α- и γ-карбоксиэтил-замещенных ПНК получали в препаративных количествах по известным методикам [10, 12-15].

Олигомеры ПНК получали по стандартному Boc-протоколу твердофазного синтеза от C к N-концу цепи на приборе для пептидного синтеза [1, 8-10, 16].

Синтезированы 5 олигомеров ПНК (Фиг. 2, Таблица 1), постсинтетическая обработка которых проводилась по известным методикам «low-high TFMSA» (раствор «low TFMSA» - трифторуксусная кислота/ м-крезол/ диметилсульфид/ трифторметансульфокислота (11:2:6:1, по объему), 0ºС; раствор «high TFMSA» - трифторуксусная кислота/м-крезол/трифторметансульфокислота (8:1:1, по объему), 0ºС) [1] и смесью трифторуксусная кислота/ трифторметансульфокислота/ триизопропилсилан (3:1:0,1 по объему) с предварительным охлаждением носителя до -30°С (45 мин для тетра- и гексамеров и 1,5 ч для декамеров) и заявляемым способом (трифторуксусная кислота/ трифторметансульфокислота/ триизопропилсилан в объемном соотношении 8:1:1 с предварительным охлаждением носителя до -45÷-50°C). Время обработки полистирольного носителя составляло 2 ч в случае отщепления 10- и 12-меров и 45 мин при отщеплении коротких последовательностей (≤ 6 нуклеотидов). Выходы синтеза оценивали исходя из количества носителя, удельной нагрузки стартового мономера и количества чистого целевого олигомера.

Результаты, приведенные в Таблице 1, доказывают преимущество заявляемого способа постсинтетической обработки по сравнению с известным протоколом.

Пример 2. Анализ влияния условий постсинтетической обработки полистирольного носителя с иммобилизованным олигомером ПНК на состав реакционных смесей

Пример 2.1. Метод MALDI-TOF-масс-спектрометрии

MALDI-TOF-масс-спектры регистрировали на приборе Bruker MicroFlex (Германия), оснащенном азотным УФ-лазером с длиной волны 337 нм и стандартной мишенью - MSP target polished steel (Bruker, Германия). В качестве матрицы использовали насыщенный раствор α-циано-4-гидроксикоричной кислоты (Fluka, США) в смеси ацетонитрил:вода 1:1.

Из Фиг. 3 и 4 очевидно, что только использование заявляемого способа обеспечивает заметное превалирование пика целевого вещества в масс-спектрах реакционных смесей.

Пример 2.2. ВЭЖХ-анализ профилей реакционных смесей, полученных различными методиками.

ВЭЖХ проводили на хроматографе Agilent Chemstation 1100 Series на колонке Macherey-Nagel Nucleosil C18 (3,2×250 мм; 5 мкм) в градиенте ацетонитрила в 0,1 М ацетате аммония при 40ºС со скоростью потока 0,8 мл/мин с УФ-детектированием при 260 нм. Из Фиг. 5 видно, что применение заявляемого способа обеспечивает получение реакционной смеси с низким содержанием примесей, что значительно облегчает ВЭЖХ-очистку олигомеров и повышает общий выход синтеза.

Пример 3. Исследование гибридизационных характеристик ДНК-ПНК комплексов методами КД и УФ-плавления.

Синтетические олигодезоксирибонуклеотиды (d(TCACCTCCCTCC), ДНК 1 и d(GGAGGGAGGTGA), ДНК 2) и олигомеры ПНК (Gly-Tγ-кэCACγ-кэCTCγ-кэCCTγ-кэCC, ПНК 1 и Gly-Tγ-кэCAγ-кэCCγ-кэTCγ-кэCCγ-кэTCγ-кэC, ПНК 2) смешивали в эквимолярном соотношении в буфере 10мM Na2HPO4-NaH2PO4, 140 мM KCl, 5 мM MgCl2, рН 7,4, с суммарной концентрацией 5 мкМ, нагревали до 90°С и медленно охлаждали до 5°С.

Кривые УФ-плавления и КД-спектры полученных образцов регистрировали на спектрофотометре Chirascan™ Applied Photophysics (Великобритания). Поглощение определяли при постоянной длине волны 260 нм, температурный интервал составлял 5-90°С c шагом 2°С (допускаемая погрешность 0,1°С). Из Фиг. 6 видно, что олигомеры ПНК 1 и ПНК 2 образуют устойчивые антипараллельные дуплексы с комплементарной цепью ДНК 2, температура плавления которых выше, чем у природного аналога ДНК 1/ДНК 2.

Литература

1. L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K.H. Petersen, H.F. Hansen, T. Koch, M. Egholm, O. Buchardt, P.E. Nielsen, J. Coull, R.H. Berg. Solid-phase synthesis of peptide nucleic acids. J. Pept. Sci. 1995. V. 3. P. 175-183.

2. R. Corradini, S. Sforza, T. Tedeschi, F. Totsingan, A. Manicardi, R. Marchelli. Peptide Nucleic Acids with a Structurally Biased Backbone. Updated Review and Emerging Challenges. Current Topics in Medicinal Chemistry. 2011. V.11. №12. P. 1535-1554.

3. N.T.S. De Costa, J.M. Heemstra. Differential DNA and RNA sequence discrimination by PNA having charged side chains. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2014. V. 24. P. 2360-2363.

4. G. Haaima, A, Lohse, O. Buchardt, P.E. Nielsen. Peptide nucleic acids (PNAs) containing thymine monomers derived from chiral amino acids: hybridization and solubility properties of D-Lysine PNA. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1996. V. 35. №17. P. 1939-1942.

5. N.T.S. De Costa, J.M. Heemstra. Evaluating the effect of ionic strength on duplex stability for PNA having negatively or positively charged side chains. Plos One. 2013. V. 8. №3. P. 1-8.

6. Y.M. Bae, M.H. Kim, G.S. Yu, B.H. Um, H.K. Park, H. Lee, K.T. Lee, Y.D. Suh, J.S. Choi. Enhanced splicing correction effect by an oligo-aspartic acid-PNA conjugate and cationic carrier complexes. Journal of controlled release. 2014. V. 175. P. 54-62.

7. C. De Cola, A. Manicardi, R. Corradini, I. Izzo, F. De Riccardis. Carboxyalkyl peptoid PNAs: synthesis and hybridization properties. Tetrahedron. 2012. V. 68. P. 499-506.

8. М.В. Ширяева, Ю.Г. Кириллова, Е.Д. Никольская, Д.И. Прохоров, И.П. Смирнов, Г.Е. Позмогова. Оптимизация твердофазного синтеза полиамидных миметиков нуклеиновых кислот с применением MALDI-TOF-масс спектрометрии. Вестник МИТХТ. 2013. Т.8. №1. С. 87-95.

9. Ю.Г. Кириллова, М.В. Танкевич, Д.И. Прохоров, В.И. Швец. Особенности твердофазного синтеза отрицательно заряженных хиральных полиамидных миметиков нуклеиновых кислот. ЖОрХ. 2013. Т.49. №12. С. 1787-1795.

10. A.V. Dezhenkov, M.V. Tankevich, E.D. Nikolskaya, I.P. Smirnov, G.E. Pozmogova, V.I. Shvets, Yu. G. Kirillova. Synthesis of anionic peptide nucleic acid oligomers including γ-carboxyethyl thymine monomers. Mendeleev Commun. 2015. V. 25. P. 47-48.

11. G. Upert, M. Mehiri, M.-L. Goddard, A. Di Giorgio, R. Benhida, R. Condom, N. Patino. The “fully protected backbone” approach as a versatile tool for a new solid-phase PNA synthesis strategy. Tetrahedron Lett. 2005. V.46. P. 4081-4085.

12. K.L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H.F Hansen, T. Vulpius, K.H. Petersen, R.F. Berg, P.E. Nielsen, O. Buchardt. Synthesis of peptide nucleic acid monomers containing the four natural nucleobases: thymine, cytosine, adenine, and guanine and their oligomerization. J. Org. Chem. 1994. V. 59. № 19. P. 5767-5773.

13. Баранов, Н.С. Цвид, В.И. Лукьянченко, Д.И. Прохоров, Ю.Г. Кириллова, В.И. Швец. Исследование путей синтеза цитозинового мономера отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых кислот. Вестник МИТХТ. 2007. Т. 2. № 5. С. 28.

14. N.P. Boyarskaya, Yu.G. Kirillova, E.A. Stotland, D.I. Prokhorov, E.N. Zvonkova, V.I. Shvets. Doklady Chemistry. 2006. Т. 408. № 1. С. 57-60.

15. А.В. Деженков, М.А. Льянов, Д.И. Прохоров, Н.Е. Лысенко, О.В. Есипова, Ю.Г. Кириллова. Синтез мономеров γ-замещенных полиамидных миметиков нуклеиновых кислот. Вестник МИТХТ. 2011. Т.6. №6. С. 72-76.

16. М.В. Ширяева, Ю.Г. Кириллова, О.В. Есипова, С.В. Еремин, Т.А. Лукьянова, В.И. Швец. Твердофазный синтез отрицательно заряженных олигомеров полиамидных миметиков нуклеиновых кислот. Вестник МИТХТ. 2011. Т.6. №2. С. 81-85.

Подписи к чертежам

Фиг. 1. Общая структура олигомеров ПНК.

Фиг. 2. Структуры олигомеров H2N-Gα-кэCAT-CONH2, H2N-ACATγ-кэ-CONH2, H2N-CATγ-кэCATγ-кэ-CONH2, H2N-(T10)α-кэ-CONH2, H2N-(T10)γ-кэ-CONH2, H2N-(C4T6)α-кэ-CONH2, Gly-Tγ-кэCACγ-кэCTCγ-кэCCTγ-кэCC (ПНК 1) и Gly-Tγ-кэCAγ-кэCCγ-кэTCγ-кэCCγ-кэTCγ-кэC (ПНК 2).

Фиг. 3. Сравнительный анализ MALDI-TOF-масс-спектров реакционных смесей, полученных при отщеплении декамера H2N-(T10)α-кэ-CONH2 методикой «low-high TFMSA» (0°С, 15 и 20 мин, соответственно) (А), смесью TFA-TFMSA-TIS в объемном соотношении 3:1:0,1 (-30°С, 1,5 ч) (Б) и заявляемым способом - смесью TFA-TFMSA-TIS в объемном соотношении 8:1:1 (-45÷-50°С, 2 ч) (В).

Фиг. 4. Сравнительный анализ MALDI-TOF-масс-спектров реакционных смесей, полученных при отщеплении декамера H2N-(C4T6)α-кэ-CONH2 методикой «low-high TFMSA» (0°С, 15 и 20 мин, соответственно) (А), смесью TFA-TFMSA-TIS в объемном соотношении 3:1:0,1 (-30°С, 1,5 ч) (Б) и заявляемым способом - смесью TFA-TFMSA-TIS в объемном соотношении 8:1:1 (-45÷-50°С, 2 ч) (В).

Фиг. 5. ВЭЖХ-профили реакционных смесей, полученных при отщеплении декамера H2N-(C4T6)α-кэ-CONH2 известной смесью TFA-TFMSA-TIS в объемном соотношении 3:1:0,1 (-30°С, 1,5 ч) (А) и заявляемым способом - смесью TFA-TFMSA-TIS в объемном соотношении 8:1:1 (-45÷-50°С, 2 ч) (Б).

Фиг. 6. Кривые УФ-плавления и КД-спектры антипараллельных комплексов 12-меров ПНК с чередующимися АЭГ и γ-карбоксиэтил-замещенными мономерами Gly-Tγ-кэCACγ-кэCTCγ-кэCCTγ-кэCC (ПНК 1/ДНК 2) и Gly-Tγ-кэCAγ-кэCCγ-кэTCγ-кэCCγ-кэTCγ-кэC (ПНК 2/ДНК 2) с комплементарной последовательностью олигонуклеотида и антипараллельного дуплекса ДНК 1/ДНК 2 (5′-d(TCACCTCCCTCC)-3′/5′-d(GGAGGGAGGTGA)-3′).

Список сокращений

Boc - трет-бутилоксикарбонил-

B - пуриновое или пиримидиновое нуклеиновое основание

ПНК (PNA) - пептидно-нуклеиновая кислота

кэ (ce) - карбоксиэтил-

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота

АЭГ ПНК (aeg PNA) - аминоэтилглициновые ПНК

Asp - аспарагиновая кислота

TFMSA - трифторметансульфокислота

УФ - ультрафиолет

КД-спектроскопия - спектроскопия кругового дихроизма

MALDI-TOF-масс-спектрометрия - матричная десорбционно-ионизационная времяпролетная масс-спектрометрия

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

Описание чертежей

На Фиг. 1 представлена общая структура олигомеров ПНК.

На Фиг. 2 представлены структуры синтезированных карбоксиэтил-замещенных олигомеров ПНК: H2N-Gα-кэCAT-CONH2, H2N-ACATγ-кэ-CONH2, H2N-CATγ-кэCATγ-кэ-CONH2, H2N-(T10)α-кэ-CONH2, H2N-(T10)γ-кэ-CONH2, H2N-(C4T6)α-кэ-CONH2, Gly-Tγ-кэCACγ-кэCTCγ-кэCCTγ-кэCC (ПНК 1) и Gly-Tγ-кэCAγ-кэCCγ-кэTCγ-кэCCγ-кэTCγ-кэC (ПНК 2).

На Фиг 3. представлено сравнение MALDI-TOF-масс-спектров реакционных смесей, полученных при отщеплении олигомера H2N-(T10)α-кэ-CONH2 по известным методикам «low-high TFMSA» (15 и 20 мин) (А) и TFA/TFMSA/TIS (3:1:0,1 по объему, 1,5 ч) (Б), а также предлагаемым способом (2 ч) (В).

На Фиг. 4 представлено сравнение MALDI-TOF-масс-спектров реакционных смесей, полученных при отщеплении олигомера H2N-(C4T6)α-кэ-CONH2 по известным методикам «low-high TFMSA» (15 и 20 мин) (А) и TFA/TFMSA/TIS (3:1:0,1 по объему, 1,5 ч), а также предлагаемым способом (2 ч) (В).

На Фиг. 5 представлены ВЭЖХ-профили реакционных смесей, полученных при отщеплении олигомера H2N-(C4T6)α-кэ-CONH2 по известной методикой TFA/TFMSA/TIS (3:1:0,1 по объему, 1,5 ч), а также предлагаемым способом (2 ч) (В).

На Фиг. 6 представлен результат исследования гибридизационных характеристик для 12-меров ПНК с чередующимися АЭГ и γ-карбоксиэтил-замещенными мономерами Gly-Tγ-кэCACγ-кэCTCγ-кэCCTγ-кэCC (ПНК 1) и Gly-Tγ-кэCAγ-кэCCγ-кэTCγ-кэCCγ-кэTCγ-кэC (ПНК 2), а именно кривые УФ-плавления и КД-спектры антипараллельных комплексов ПНК/ДНК и ДНК/ДНК.

Способ получения олигомеров пептидно-нуклеиновых кислот, содержащих карбоксиэтильный заместитель в α- или γ-положении боковой цепи, заключающийся в наращивании на полистирольном носителе полиамидной последовательности, содержащей α-карбоксиэтил-замещенные звенья общей формулы -NH-(CH2)2N(COCH2B)-CH[(CH2)2COOH]-CO- или γ-карбоксиэтил-замещенные звенья общей формулы -NH-CH[(CH2)2COOH]-CH2-N(COCH2B)-CH2-CO-, где B - пуриновое или пиримидиновое нуклеиновое основание, с последующей обработкой носителя смесью на основе трифторуксусной кислоты и трифторметансульфокислоты, отличающийся тем, что для увеличения выхода и упрощения очистки целевых олигомеров, а именно уменьшения количества побочных продуктов, носитель предварительно охлаждают до -45÷-50ºC, а вместо м-крезола к смеси кислот добавляют триизопропилсилан при объемном соотношении реагентов трифторуксусная кислота:трифторметансульфокислота:триизопропилсилан 8:1:1.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для рекомбинантного получения CTR1. Получают плазмидную ДНК pNdCTR1, кодирующую гибридный полипептид GST-NdCTR1, состоящий из N-концевого полипептидного фрагмента глутатион-S-трансферазы (GST), соединенного через сайт гидролиза тромбином с полипептидным фрагментом N-концевого домена высокоаффинного импортера меди человека CTR1 (NdCTR1).

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой выделенный гибридный белок NPP1, обладающий ферментативной активностью NPP1, содержащий NPP1-компонент и Fc-участок иммуноглобулина.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к усовершенствованному рекомбинантному иммунотоксину для клеток, экспрессирующих мезотелин. Заявленный иммунотоксин представляет собой слитый белок, включающий антитело к мезотелину и фрагмент экзотоксина Pseudomonas, который модифицирован так, чтобы снизить его иммуногенность и чувствительность к протеазам.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению иммуногенных полипептидов против рака молочной железы, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммунологии, и может быть использовано в медицине. Композицию, основанную на совместном применении ApoA, интерлейкина 15 и домена Sushi альфа цепи рецептора IL15, используют для стимулирования противоопухолевого иммунного ответа у субъекта.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к антагонистам Wnt, и может быть использовано в медицине. С использованием сигнальной последовательности получают Wnt-связывающие полипептиды на основе домена Fri из FZD8 человека и Fc-фрагмента.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению нетоксичной мутантной формы гена Cholix (ntCholix) Vibrio cholera, и может быть использовано в медицине. Получают вариант Cholix, усеченный по аминокислоте A386 (Cholix386) или с удаленным остатком Glu581.

Изобретение относится к биохимии. Получают химерные белки слияния: GST УСД HDAC6 и GST-PSMA3, путем их экспрессии в клетки E.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к получению рекомбинантного белка, содержащего в своем составе последовательности миелопептидов, и может быть использовано для лечения вторичных иммунодефицитов.

Представленная группа изобретений касается слитого белка, ДНК, кодирующей такой белок, рекомбинантного вектора и клетки-хозяина. Охарактеризованный слитый белок содержит фактор VII (FVII) и трансферрин, где указанный трансферрин соединен с С-концом указанного FVII, необязательно через линкер.

Изобретение относится к способу получения маркеров молекулярной массы для глатирамера ацетата со случайной аминокислотной последовательностью, аналогичной последовательности глатирамера ацетата, содержащему стадии: a) воздействие на полипептидную смесь, которая является смесью полипептидов, содержащих аланин, глутаминовую кислоту, тирозин и лизин в том же молярном соотношении, что у глатирамера ацетата, гель-проникающей хроматографией (ГПХ)/эксклюзионной хроматографией (ЭХ) для получения полипептидных фракций с молекулярными массами в диапазоне от 2 кДа до 30 кДа; b) выбор полипептидных фракций, которые будут использованы в качестве маркеров молекулярной массы, из указанных полипептидных фракций, полученных на стадии а), таким образом, что одна из фракций представляет вершину пика молекулярной массы, а другие фракции распределены по обе стороны от вершины пика молекулярной массы; и c) определение полидисперсности указанных выбранных полипептидных фракций, где полидисперсность указанных выбранных полипептидных фракций должна составлять меньше, чем или быть равной 1,20.

Изобретения касаются способа конструирования библиотеки белков, полученных из консенсусной последовательности домена фибронектина типа III (FN3) с повышенной стабильностью, и библиотеки, полученной таким способом.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. В группу изобретений входят нуклеиновая кислота, которая кодирует флуоресцентный биосенсор для регистрации изменения рН, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID No: 4, а также кассета экспрессии и эукариотическая клетка, продуцирующая биосенсор.

Группа изобретений относится к способам синтеза гликопептида, имеющего сиалированную сахарную цепь. Путем реакции этерификации осуществляют связывание смолы, имеющей гидроксильную группу с аминокислотой, у которой азот аминогруппы защищен Вос-группой.

Настоящие изобретения относятся к области ветеринарии и касаются иммуногенной композиции (варианты) и применения пептида рибосомального белка Р0 эктопаразитов. Охарактеризованная иммуногенная композиция содержит пептид рибосомального белка Р0 экстопаразитов, либо нуклеиновую кислоту, кодирующую такой полипептид.

Настоящее изобретение относится к области бактериофаговой терапии для лечения и регулирования бактериальных инфекций. Представленная группа изобретений касается выделенного бактериофага, обладающего активностью против Pseudomonas aeruginosa, белков, кодируемых геномом такого бактериофага, фармацевтической композиции, содержащей такие белки, применяющейся для изготовления лекарственного средства для лечения инфекции, обусловленной Pseudomonas aeruginosa, способа диагностики бактериальной инфекции, вызванной Pseudomonas aeruginosa, и способа уменьшения или ингибирования колонизации или роста Pseudomonas aeruginosa на твердой поверхности.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу выделения вирусоподобных частиц VLP. Получают растения или растительный материал, содержащий VLP, локализованные в апопласте.

Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и ветеринарии. Изобретение раскрывает применение иммуногенной композиции, содержащей рекомбинантный белок PCV2 ORF2, для индукции иммунного ответа против PCV2 или для получения лекарственного средства для индукции иммунного ответа против PCV2.

Изобретение относится к биотехнологии. Представлен аналог эксенатида формулы H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Gly-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Gly-OH.

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Предложен способ получения постоянной линии клеток-амниоцитов человека, включающий трансфекцию зародышевых клеток-амниоцитов человека молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую продукты генов аденовирусов Е1А и Е1В, причем указанную последовательность нуклеиновой кислоты получают из серотипа 5 аденовируса человека, и последующую трансфекцию постоянной линии клеток-амниоцитов человека, полученной на первом этапе, молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую большой SV40 Т-антиген.

Изобретение относится к новому соединению формулы I-1, характеризующемуся эффектами тромболизиса, акцептирования свободных радикалов и направленного действия на тромб.
Наверх