Способ электрофоретического разделения белков сыворотки крови и молока в полиакриламидном геле


 


Владельцы патента RU 2616906:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Орловский государственный аграрный университет" (RU)

Изобретение относится к биологии, в частности к биохимии и молекулярной биологии, и может найти применение при разделении белков сыворотки крови и молока на фракции в полиакриламидном геле. Задача изобретения - повысить точность проведения электрофореза и сократить время проведения анализа. Для достижения поставленной задачи в способе электрофоретического разделения белков сыворотки крови и молока в полиакриламидном геле, заключающемся в проведении электрофореза в полиакриламидном геле с использованием концентрирующего геля с рН=6,7 и разделяющего геля с рН=8,9 при силе тока 25 мА, с предварительным разведением сыворотки крови и молока, согласно изобретению в качестве концентрирующего геля используют мелкопористый гель, при этом сыворотку крови и молока разводят в физиологическом растворе 1:2. 2 ил.

 

Изобретение относится к биологии, в частности к биохимии и молекулярной биологии, и может найти применение при разделении белков сыворотки крови и молока на фракции в полиакриламидном геле.

Электрофорез широко применяют в исследовательской и клинико-лабораторной практике. Посредством его выявляют и выделяют белки, липопротеиды, гликопротеиды, нуклеиновые кислоты. Подавляющее большинство исследований с помощью электрофореза позволяет диагностировать состояние белкового обмена биологического организма.

В медико-биологических исследованиях применяют множество вариантов двух главных модификаций электрофореза в свободной жидкости (свободно-проточный электрофорез) и зонального электрофореза (зонный электрофорез, или электрофорез на инертных носителях).

Для разделения белков плазмы крови широкое распространение получил зонный электрофорез на поддерживающих средах-носителях. Зонный электрофорез можно осуществлять с использованием смоченных буферным раствором (рН-8,6) полосок хроматографической бумаги, ацетататцеллюлозной пленки, агарового геля и других носителей.

Известен способ разделения белков на фракции, используя электрофорез в полиакриламидном геле. Этот метод нашел самое широкое применение в биохимических и научных исследованиях. Он используется для изучения белков, липо- и гликопротеинов, пептидов, гормонов, ферментов и нуклеиновых кислот.

Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле значительно повышается при использовании в качестве носителя системы гелей (обычно двух - «рабочего», мелкопористого и непосредственно над ним «формирующего», крупнопористого). Кроме степени пористости эти гели резко различаются по величине рН и молярности буферных растворов, в которых они полимеризуются. Такой электрофорез называют ступенчатым или дискэлектрофорезом.

Известна методика проведения электрофореза в полиакриламидном геле с использованием крупнопористого концентрирующего геля (рН=6,7) и мелкопористого разделяющего геля (рН=8,9). Разведение сыворотки крови и молока проводят с использованием раствора сахарозы. Проводят электрофоретическое концентрирование белков сыворотки крови в крупнопористом концентрирующем геле в течение 30 мин при силе тока 25 мА. При использовании этого геля в качестве концентрирующего происходит диффузия белков сыворотки крови и молока, что приводит к частичной потере белков и, следовательно, снижению точности электрофоретического разделения (Малахова А.Г., Кармолиев Р.Х. Применение современных биохимических методов исследования в ветеринарии. М., 1986) [1].

Недостатками данной методики электрофореза являются недостаточно высокая точность проведения электрофореза за счет наличия процесса диффузии в крупнопористом концентрирующем геле и длительность осуществления методики.

Задачей изобретения является повышение точности проведения электрофореза и сокращение времени проведения анализа.

Для достижения поставленной задачи в способе электрофоретического разделения белков сыворотки крови и молока в полиакриламидном геле, заключающемся в проведении электрофореза в полиакриламидном геле с использованием концентрирующего геля с рН=6,7 и разделяющего геля с рН=8,9 при силе тока 25 мА, с предварительным разведением сыворотки крови и молока, согласно изобретению в качестве концентрирующего геля используют мелкопористый гель, при этом сыворотку крови и молока разводят в физиологическом растворе 1:2.

Мелкопористый гель выполняет также функции концентрирующего благодаря тому, что в предлагаемой методике сохраняется прерывистость системы буферов, что обеспечивает концентрирование белков пробы и образование тонкой стартовой зоны на границе концентрирующего и разделяющего гелей из-за возникающего электрохимического эффекта.

Использование в качестве концентрирующего геля мелкопористого (7,5%-ного) геля с рН=6,7 приводит к снижению процесса диффузии разделяемых белков, что позволяет избежать потери белков и повысить точность анализа. Кроме того, полимеризация в мелкопористом геле проходит быстрее. Электрофоретическое концентрирование белков сыворотки крови в мелкопористом концентрирующем геле осуществляется в течение 10 мин при силе тока 25 мА. Это позволяет сократить время проведения анализа.

Использование физиологического раствора для разведения проб сыворотки крови и молока является наиболее физиологичным для этих биологических жидкостей. Кроме того, хлорид-ионы из физиологического раствора, дополнительно введенные к хлорид-ионам концентрирующего буфера, устремляющиеся под действием электрического поля в сторону анода и оставляющие за собой бедное ионами пространство, приводят к резкому падению напряжения. Это вызывает ускорение медленных ионов глицината и следующих за ними белковых молекул.

Пример выполнения.

1. В блок для полиакриламидных гелей заливают разделяющий (7,5%-ный) мелкопористый гель с рН=8,9. Осторожно наслаивают на поверхность гелевого раствора дистиллированную воду или раствор триса. Через 30-60 минут полимеризация заканчивается, что отмечается появлением границы раздела между поверхностью геля и водой.

2. Сливают воду, поверхность разделяющего геля 2-3 раза промывают раствором акриламида, не содержащим рибофлавин, и заливают затем в кассету 7,5%-ный раствор акриламида с рH=6,7 почти до верхнего края, вставляют сверху гребенку из оргстекла для формирования лунок. Полимеризация длится 15 минут. Затем вынимают гребенку и вносят в лунки по 0,01 мл проб сыворотки крови (молока), разведенной физраствором в соотношении 1:2. В крайние лунки вносят по одной капле раствора 12 (бромфенолового синего), который является индикатором передвижения белка в геле.

3. Помещают кассету в нижний электродный сосуд с платиновым электродом и сверху, по месту щели, прижимают верхним электродным сосудом с платиновым электродом. В нижний электродный сосуд заливают 1000 мл буферного раствора 10, с рН 8,3, в верхний электродный сосуд осторожно, чтобы не вымыть пробы из лунок, заливают 500 мл того же буферного раствора. Камеру деления подключают к источнику питания.

4. Проводят электрофоретическое концентрирование белков сыворотки крови (молока) в течение 10 мин при силе тока 25 мА. После прохождения фронта индикатора границы раздела двух гелей силу тока увеличивают до 50 мА. Электрофорез заканчивается по достижении первой зоны красителя нижнего края кассеты. По окончании электрофореза отсасывают буферный раствор из верхнего электродного сосуда и отделяют его от кассеты. Осторожно отслаивают пластину геля от стенок кассеты и гель отмывают в 7%-ном растворе уксусной кислоты.

5. Отмытый гель фотографируют. На фиг. 1 представлена электрофореграмма белков сыворотки крови. На фиг. 2 представлена электрофореграмма белков молока. Полученные электрофореграммы свидетельствуют о высокой разделяющей способности заявляемого способа.

Таким образом, заявляемый способ позволят повысить точность проведения электрофореза, сократить длительность процесса проведения анализа.

Способ электрофоретического разделения белков сыворотки крови и молока в полиакриламидном геле, заключающийся в проведении электрофореза в полиакриламидном геле с использованием концентрирующего геля с рН=6,7 и разделяющего геля с рН=8,9 при силе тока 25 мА, с предварительным разведением сыворотки крови и молока, отличающийся тем, что в качестве концентрирующего геля используют мелкопористый гель, при этом сыворотку крови и молока разводят в физиологическом растворе 1:2.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины, а именно к исследованию физических и химических свойств биологических материалов, и может быть использовано в судебно-медицинской практике для посмертного определения инфаркта миокарда.

Предлагаемый способ относится к медицине, в частности к стоматологии, и может быть использован для диагностики гингивита у детей. Cпособ включает предварительную подготовку образца слюны пациента, после этого осуществляют исследование образца слюны методом ИК - спектроскопии в области спектров поглощения 1200-1000 см-1.

Предлагаемое изобретение относится к клинической медицине, в частности к клинической гематологии, и развивает новые направления в изучении сгустка крови с целью создания новых дополнительных возможностей в исследовании больных и доноров.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, и может быть использовано для профилактики анемии у несовершеннолетних беременных женщин. Способ включает обследование на содержание ферритина в венозной крови, при его величине ниже 35 нг/мл назначают пероральные железосодержащие препараты в общепринятых профилактических дозах сроком на 3 месяца, и если через три месяца содержание ферритина в венозной крови повторно ниже 35 нг/мл, прием железосодержащих препаратов продолжают еще 3 месяца.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам экспериментального моделирования процессов, протекающих в полости рта человека, в частности, образования зубного камня.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторным методам исследования, экспресс-методу диагностики инфекционного заболевания, сопровождающегося наличием микроорганизмов в крови.

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования вероятности наступления клинической беременности у женщин с индексом массы тела от 28,5 и выше в программе экстракорпорального оплодотворения.

Изобретение относится к медицине и предназначено для раннего выявления у больных раком головки поджелудочной железы предпосылок к развитию острого послеоперационного панкреатита культи поджелудочной железы после панкреатодуоденальной резекции.

Изобретение относится к медицине, а именно к терапии, эндокринологии и кардиологии, и может быть использовано для комплексного лечения метаболического синдрома. Для этого проводят диетотерапию пониженной калорийности 1200 ккал для женщин и 1500 ккал для мужчин с ограничением углеводсодержащих продуктов и жиров.

Изобретение относится к медицине, в частности эндокринологии, и может быть использовано для неинвазивной экспресс-диагностики диабета второго типа. Проводят забор слюны человека.

Изобретение относится к способу определения горького вкуса в сырах. Способ предусматривает проведение количественного анализа массовой доли общего белка методом Кьельдаля и массовой доли общего растворимого белка сыра с последующим вычислением степени протеолиза (СП) по формуле: , где Браст - массовая доля общего растворимого белка, %, Боб - массовая доля общего белка, %; сравнение полученного значения степени протеолиза с разработанной шкалой оценки, представленной на чертеже, в соответствии с которой в сырах, независимо от продолжительности хранения, при значении степени протеолиза до 21% горький вкус отсутствует, при значениях степени протеолиза от 21 до 22,5% и более сыры имеют горький вкус.
Изобретение относится к области молочной промышленности и касается способа определения содержания жира и белка в молоке, характеризующегося тем, что у пробы молока измеряют динамическое поверхностное натяжение на тензиометре, работающем по принципу максимального давления в пузырьке, по полученным значениям динамического поверхностного натяжения определяют содержание белка и жира в молоке с использованием формул регрессионно-корреляционного анализа, определяющих взаимосвязь между содержанием жира и белка в молоке с его динамическим поверхностным натяжением.

Изобретение относится к аналитической химии, а именно анализу молочных продуктов, и может быть использовано для определения удельной активности стронция-90 (Sr-90) в молоке или молочной сыворотке с концентрацией радионуклида на уровне ПДК и ниже.

Изобретение относится к молочной промышленности. Отбирают пробу НФ-концентрата, измеряют активную кислотность (рН), вносят пробное количество раствора щелочи, определяют величину изменения кислотности и пересчитывают расход щелочи на необходимую величину изменения кислотности по следующей формуле: , где: Vщ - количество раствора щелочи для нейтрализации НФ-концентрата объемом Vк, дм3; Vк - объем НФ-концентрата творожной сыворотки, подлежащий нейтрализации, дм3; pHзад - заданное значение активной кислотности НФ-концентрата; рН0 - исходное значение активной кислотности НФ-концентрата; рН1 - значение активной кислотности пробы НФ-концентрата объемом 1 дм3 после внесения раствора щелочи объемом Vпр; Vпр - количество раствора щелочи, добавленное в пробу НФ-концентрата, дм3.
Изобретение относится к ветеринарно-санитарной экспертизе, а именно к контролю качества молока и молочных продуктов. Для этого определяют содержание каррагинана в молоке и молочных продуктах.

Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно к способу определения термоустойчивости молока. Для этого степень денатурации белков молока осуществляют по данным измерения биоэлектрического потенциала в биологически активных центрах кожи коровы №1, №3, №16, №20, №38, №39, №44 до выдаивания молока, находят среднюю его величину.
Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для диагностики бруцеллеза овец и коз. Изобретение заключается в применении молока в реакции непрямой агглютинации для диагностики бруцеллеза овец и коз.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен способ определения наличия штамма молочнокислых бактерий, включающего IS-элемент, в молочном продукте.
Изобретение относится к области сельского хозяйства и предназначено для диагностики дисбаланса Cu, Mo и W у сельскохозяйственных копытных животных. Способ включает подготовку проб биоиндикаторов, определение в них содержания микроэлементов и оценку полученных результатов.

(57) Изобретение относится к области сельского хозяйства и предназначено для определения санитарно-гигиенического состояния молока. Оценивают общее количество бактерий и количество соматических клеток в молоке.

Способ относится к области химической промышленности и позволяет определить содержание коэнзима Q10 в кремах косметических методом катодной дифференциально-импульсной вольтамперометрии.
Наверх