Способ скрининговой диагностики острого клеточного отторжения трансплантированного сердца

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике, может быть использовано при ведении пациентов после трансплантации сердца для диагностики отторжения трансплантированного сердца. Сущность способа: в сыворотке крови определяют концентрацию VEGF-A и при уровне VEGF-A выше 317 пг/мл диагностируют острое клеточное отторжение. Преимущество изобретения заключается в обеспечении простоты, доступности, неинвазивности диагностики, сокращении времени ее проведения при одновременном достижении достоверного диагностического скрининга острого клеточного отторжения как в раннем, так и в отдаленном посттрансплантационных периодах у реципиентов сердца, а также в улучшении результатов трансплантирования сердца, повышении выживаемости реципиентов путем своевременного определения показаний к внеплановой эндомиокардиальной биопсии, коронароангиографии и уточнения тактики ведения больных путем определения уровня концентрации VEGF-A в сыворотке крови. 2 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике, может быть использовано при ведении пациентов после трансплантации сердца для диагностики отторжения трансплантированного сердца.

Трансплантация сердца (ТС) является эффективным методом лечения пациентов в терминальной стадии застойной сердечной недостаточности. За последние 5 лет число операций ТС многократно увеличилось, при этом улучшились показатели продолжительности и качества жизни.

Несмотря на значительные достижения и существенный прогресс в лечении реципиентов сердца, различные виды отторжения трансплантированного сердца являются главными причинами потери трансплантата на ранних и отдаленных сроках после операции.

Объективным отражением системности процессов, происходящих в организме реципиентов, является изменение концентрации в крови ряда специфических молекул - биомаркеров. Выявление лабораторных биомаркеров для диагностики осложнений после ТС - сложная задача, поскольку тесты на большинство предполагаемых биомаркеров имеют недостаточную чувствительность и специфичность.

Факторы роста эндотелия сосудов - мощные ангиогенные факторы, которые продуцируются макрофагами, фибробластами, гепатоцитами, эндотелиальными и другими клетками сосудов и участвуют в активации, пролиферации, миграции и дифференцировке клеток эндотелия кровеносных и лимфатических сосудов. При этом упомянутые факторы взаимодействуют с сосудами через специфические тирозинкиназные рецепторы.

Фактор роста эндотелия сосудов - А (далее VEGF-A) - фактор, который активирует пролиферацию эндотелиальньгх клеток, обладает провоспалительными свойствами, являясь хемоаттрактантом для моноцитов и лимфоцитов, а также увеличивает проницаемость стенок микрососудов для жидкости и различных макромолекул.

Reinders М.Е. и соавт. показали, что содержание VEGF-A в эндомиокардиальных биоптатах может быть индикатором риска развития сосудистых осложнений трансплантата [Expression patterns of vascular endothelial growth factor in human cardiac allografts: association with rejection / M.E. Reinders, J.C. Fang, W. Wong et al. // Transplantation. - 2003. - Vol. 76. - P. 224-230]

Усиление экспрессии VEGF-A в сердечном трансплантате сопровождается инфильтрацией моноцитами и макрофагами, отложением фибрина и коррелирует с развитием как острого, так и хронического отторжения в соответствии с работами R.J. Torry и соавт. [Vascular endothelial growth factor expression in transplanted human hearts / R.J. Torry, C.A. Labarrere, D.S. Torry et al. // Transplantation. - 1995. - Vol. 60. - P. 1451-1457]. Однако определение VEGF-A в этом случае связано с инвазивной процедурой для пациента - проведением эндомиокардиальной биопсии.

Aharrinejad S. и соавт. показали, что повышение уровней VEGF-A и матриксной металлопротеиназы-1 (ММР-1) в сыворотке крови реципиентов сердца в первые недели после ТС предшествуют развитию отторжения. Авторы предложили измерять содержание двух указанных маркеров для прогнозирования отторжения сердечного трансплантата и адекватного изменения протокола иммуносупрессивной терапии [Aharinejad, S. Serum matrix Metalloprotease-1 and Vascular endothelial growth factor-A predict cardiac allograft rejection / S. Aharinejad, K. Krenn, A. Zuckermann et al. // American Journal of Transplantation. - 2009. - №9. - P. 149-159].

Однако известный способ предполагает прогнозирование отторжения путем исследования сразу двух показателей VEGF-A и ММР-1, не определяет четкие диагностические критерии для острого клеточного отторжения и применим только в первые недели после трансплантации сердца.

Проблема диагностики острого клеточного отторжения трансплантированного сердца является актуальной ввиду того, что в настоящее время в клинике диагностика производится по результатам инвазивных методов - эндомиокардиальной биопсии [Белецкая Л.В., Баранова Ф.С., Куприянова А.Г. и др. C4d-компонент комплемента как один из маркеров отторжения гуморального типа // Вестник трансплант. и искусств. органов. 2003. №4. С. 72-77] - (прототип). Многочисленные публикации зарубежных и отечественных авторов свидетельствуют о высоком риске осложнений и неблагоприятного исхода при использовании данного метода.

Нами поставлена задача - разработать доступный, неинвазивный, достоверный способ скрининговой диагностики острого клеточного отторжения трансплантированного сердца.

Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в обеспечении простоты, доступности, неинвазивности диагностики, сокращении времени ее проведения при одновременном достижении достоверного диагностического скрининга острого клеточного отторжения как в раннем, так и в отдаленном посттрансплантационных периодах у реципиентов сердца, а также в улучшении результатов ТС, повышении выживаемости реципиентов путем своевременного определения показаний к внеплановой эндомиокардиальной биопсии, коронароангиографии и уточнения тактики ведения больных путем определения уровня концентрации VEGF-A в сыворотке крови.

Нами эмпирически установлен достоверный скрининговый диагностический показатель острого клеточного отторжения трансплантированного сердца, основанный на оценке концентрации VEGF-A у реципиентов сердца в сыворотке крови, который оказался информативным в любые сроки после трансплантации. Использование предлагаемого прогностического маркера позволяет ограничить круг пациентов, которым требуется проведение эндомиокардиальной биопсии для уточнения диагноза острого клеточного отторжения трансплантированного сердца.

Сущность изобретения состоит в следующем.

Для скрининговой диагностики острого клеточного отторжения трансплантированного сердца в сыворотке крови определяют концентрацию VEGF-A и при уровне VEGF-A выше 317 пг/мл диагностируют острое клеточное отторжение.

Способ осуществляется следующим образом.

В качестве материала для исследования концентрации биомаркера используют сыворотку крови. Взятие крови для исследования производят, как правило, одновременно с плановым обследованием пациентов.

Кровь собирают в одноразовые пробирки (BD Vacutainer, Becton Dickinson, США) и центрифугируют в течение 10 минут при 3500/1500 g оборотах при комнатной температуре. Полученную сыворотку переносят в эппендорф и замораживают в случае необходимости. Образцы сыворотки необходимо хранить при температуре -20°C.

Концентрация VEGF-A может быть измерена, например, с использованием технологии хМАР и реагентов Simplex ProcartaPlex™ (Affymetrix, США). Цифровая обработка сигналов может быть произведена на проточном флуоресцентном анализаторе Luminex (Luminex Corporation, США). Обслуживание прибора и обработку результатов анализа проводят с помощью программного обеспечения xPONENT 3.1.

Определение проводят в соответствии с инструкцией. Анализ выполняют с помощью устройства Hand-Held Magnetic для фиксирования магнитных частиц на дне планшета.

Процедура анализа включает несколько этапов.

1. Подготовка калибраторов:

Для построения калибровочной кривой используют четыре готовых стандартных набора калибраторов (А, В, С и Е), содержащих исследуемый аналит. В первый стандарт (А) добавляют 250 мкл универсального буфера и инкубируют на льду в течение 10 минут, затем осторожно перемешивают при помощи магнитной мешалки в течение 30 секунд. Все содержимое переносят во второй флакон с другим стандартом (В) и процедуру повторяют еще три раза для растворения стандартов всех 4-х флаконов. Далее для построения калибровочной кривой, состоящей из 8 точек, готовят серию четырехкратных разведений с использованием универсального буфера.

2. Детекторные антитела:

Все детекторные антитела в наборе находятся в виде концентрата (50х), требующего последующего разведения в 50 раз. Смесь детекторных антител (1х) готовят в соответствии со следующими расчетами: 25 мкл смеси детекторных антител (1х) на одну лунку. Пипетируют 1/50 конечного объема каждого концентрата детекторных антител (1x) (Simplex) во флакон с этикеткой «Смесь детекторных антител (1х)»; до конечного объема доводят растворителем для детекторных антител.

3. Подготовка планшета:

Во все лунки планшета вносят смесь микросфер с нагруженными на них антителами объемом 50 мкл, далее планшет устанавливают в устройство Hand-Held Magnetic для фиксации магнитных сфер, что позволяет проводить отмывку микросфер.

В первый и второй стрипы вносят подготовленные калибраторы, каждый образец повторяется дважды. В оставшиеся лунки вносят по 25 мкл буфера и 25 мкл исследуемых образцов.

Время инкубации составляет 2 ч при комнатной температуре и постоянном перемешивании (500 об/мин в планшетном термостате). После трехкратного отмывания микросфер от несвязавшихся компонентов реакции во все лунки добавляют по 25 мкл детекторных антител.

Время инкубации составляет 30 минут. После 3-кратной промывки микросфер с помощью устройства Hand-Held Magnetic в каждую лунку добавляют по 50 мкл раствора стрептавидина-фикоэритрина для детекции комплекса антиген-антитело.

Для построения калибровочных кривых, обработки и расчета результатов используют программное обеспечение xPONENT 3.1.

При уровне VEGF-A выше 317 пг/мл диагностируют острое клеточное отторжение.

Для доказательств возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.

Пример 1.

Пациенту В., 49 лет, выполнена ортотопическая трансплантация сердца. Послеоперационный период протекал гладко. Иммуносупрессивная терапия была назначена по стандартной схеме. Однако измеренный на 1122 сутки после операции уровень VEGF-A в сыворотке крови составил 1748,3 пг/мл. В соответствии с предлагаемым способом у пациента диагностировано острое клеточное отторжение трансплантированного сердца. Методом эндомиокардиальной биопсии диагноз подтвержден: было установлено острое клеточное отторжение типа 1 В.

Пример 2.

Пациент Н., 48 лет, поступил с диагнозом: дилатационная кардиомиопатия. Пациенту выполнена операция - ортотопическая трансплантация сердца. Послеоперационный период протекал гладко. Иммуносупрессивная терапия была назначена по стандартной схеме. Измеренный уровень VEGF-A в сыворотке крови на 20 сутки после ТС составил 193 пг/мл. В течение периода наблюдения (с первых суток до 6 месяцев после ТС) клинически, а также по данным эндомиокардиальных биопсий не было обнаружено морфологических и иммуногистохимических признаков острого клеточного отторжения сердечного трансплантата.

Предложенный способ апробирован в клинической практике на 98 пациентах. Уровень VEGF-A выше установленного нами порогового значения - 317 пг/мл был у 37 пациентов с трансплантированным сердцем, из них у 12 (32,4%) развилось острое клеточное отторжение. Уровень VEGF-А ниже порогового значения был у 61 пациентов после ТС, из них ни у кого не развилось острое клеточное отторжение, что было подтверждено с помощью эндомиокардиальных биопсий. Таким образом, чувствительность предлагаемого способа диагностики составила 100%, его специфичность - 71%, а точность - 74%.

Использование в клинической практике патентуемого способа дает возможность достоверно диагностировать острое клеточное отторжение на ранних этапах его развития, произвести отбор пациентов, которым показано специальное дообследование для подтверждения диагноза.

Способ скрининговой диагностики острого клеточного отторжения трансплантированного сердца в отдаленном посттрансплантационном периоде у реципиентов сердца, характеризующийся тем, что в сыворотке крови определяют концентрацию фактора роста эндотелия сосудов - А (VEGF-A) и при уровне VEGF-A выше 317 пг/мл диагностируют острое клеточное отторжение.



 

Похожие патенты:

Настоящее изобретение относится к способу стратификации терапии обморока у пациента путем определения уровня СТ-проЕТ-1 в образце жидкости организма указанного пациента, корреляции уровня СТ-проЕТ-1 со стратификацией терапии обморока, где пациентов стратифицируют в соответствии с их потребностью в кардиостимуляторе посредством определения уровня СТ-проЕТ-1.
Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для прогнозирования развития плацентарной недостаточности в первом триместре беременности у женщин после процедуры экстракорпорального оплодотворения.

Способ относится к области медицины, а именно к аллергологии в педиатрии, детской гастроэнтерологии, и может быть использован для диагностики аллергической энтеропатии, индуцированной белком коровьего молока у детей грудного возраста.

Изобретение относится к области медицины, а именно к области гастроэнтерологии и онкологии, и может быть использовано для прогнозирования риска развития аденокарциномы желудка.

Изобретение относится к медицине, а именно к молекулярной фармакологии, и может быть использовано для получения меченых катионных дендримерных пептидов для внутриклеточной доставки нуклеиновых кислот (НК).

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и касается способов мониторинга эффективности противоопухолевого лечения немелкоклеточного рака легкого.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к новым аллергенам лошади, и может быть использовано в медицине для профилактического или терапевтического лечения или диагностики аллергии типа I на лошадей.

Группа изобретений относится к медицине и касается способа получения связывающего агента или смеси связывающих агентов, способных связываться с эпитопом, содержащимся в аминокислотной последовательности, соответствующей С-концевой части препро-вазопрессина, состоящей из аминокислот 146-163, но не содержащей аминокислоту 164, где указанный способ включает стадии получения связывающего агента с использованием формирующего агента; определения способности связывающего агента связываться с аминокислотной последовательностью длиной по меньшей мере 12 аминокислот, содержащейся в аминокислотной последовательности, соответствующей С-концевой части, но не содержащей аминокислоту 164 препро-вазопрессина; отбора связывающего агента из множества связывающих агентов.

Настоящее изобретение относится к области микробиологии и касается способа определения таких характеристик, как типирование, потенциальная устойчивость по меньшей мере к одному антимикробному средству и фактора вирулентности, по меньшей мере, одного микроорганизма из образца.

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии и гемостазиологии, и может быть использовано для оценки степени тяжести воспалительных заболеваний органов малого таза.

Настоящее изобретение относится к определению уровня маркерных пептидов в образце, полученном из физиологической жидкости субъекта, поступившего в отделение неотложной помощи с неспецифическими жалобами. Изобретение раскрывает способ оценки вероятности возникновения у пациента неблагоприятных событий, прогноза его выживаемости или принятия конкретных решений при его ведении, включающий определение уровня маркерного пептида, выбранного из группы, содержащей проANP, проBNP, проAVP, проADM, проЕТ-1, РСТ, PRX-4, или их фрагментов, включающих по крайней мере 12 аминокислот в длину. Маркерные пептиды или их фрагменты представляют собой независимые прогностические факторы для серьезных состояний, включая смерть и госпитализацию, у пациентов, доставленных в отделения неотложной медицины с неспецифическими жалобами. 16 з.п. ф-лы, 45 ил., 16 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике в медицине неотложных состояний и к экспериментальной медицине, и может быть использовано для оценки степени тяжести любой этиологии у пациентов и лабораторных животных. Сущность способа: первоначально измеряют концентрацию белка в пробе жидкого биологического материала человека или животного, затем пробу инкубируют в кипящей водяной бане в течение 3 минут, повторно определяют концентрацию белка в прогретой пробе и при снижении концентрации белка в пробе после прогревания более чем в 25 раз оценивают как отсутствие интоксикации, при снижении в 25-21 раз - как интоксикацию легкой степени, при снижении в 20-16 раза - как интоксикацию средней степени, а при снижении концентрации белка менее чем в 16 раз - как интоксикацию тяжелой степени. Изобретение обеспечивает упрощение и повышение универсальности процедуры оценки степени тяжести интоксикации как у пациентов с подозрением на интоксикационный синдром, так и лабораторных животных при моделировании эндогенной или экзогенной интоксикации. 1 табл., 7 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточной инженерии, и может быть использовано для определения биологической активности IFN-γ. Получают линию клеток меланомы человека PiGAS с регистрационным номером ВКПМ Н-161 путем трансфекции родительской линии клеток меланомы человека MelP плазмидой pGAS(x6)-Luc//Neo, кодирующей репортерную конструкцию 6xGAS-Luc, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 1, включающую 6 повторов сайта связывания транскрипционного фактора STAT-1, минимального промотора SV-40 и гена люциферазы светлячка Photinus pyralis (Luc), а также последовательности SEQ ID NO: 2, включающую ген устойчивости Neo к селективному антибиотику G418 под контролем своего конститутивного промотора PGK-1. Изобретение обеспечивает получение репортерной клеточной линии, позволяющей определять биоактивный IFN-γ путем детекции активации JAK/STAT-1 - сигнального пути. 6 ил., 5 пр.
Наверх