Способ определения метастатического потенциала опухоли молочной железы

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, может быть использовано для определения метастатического потенциала инвазивного протокового рака молочной железы. Для этого на подготовленных для морфологического исследования препаратах операционного материала молочной железы больной инвазивным протоковым раком оценивают в баллах степень выраженности следующих признаков изменения десмопластической стромы: разволокнение пучков коллагеновых волокон и их распад; наличие участков с изменением физико-химических свойств коллагеновых волокон; повышение содержания нейтральных гликопротеинов в участках разрушения коллагеновых волокон; снижение содержания сульфатированных гликозаминогликанов в десмопластической строме; выраженность инфильтрации лимфо-гистиоцитарными элементами; отек внеклеточного матрикса в зоне инфильтрации. Отсутствие каждого из вышеуказанных признаков оценивают нулем баллов, незначительное, умеренное и выраженное проявление каждого из данных признаков оценивают одним, тремя и семью баллами соответственно. Затем суммируют баллы по всем вышеприведенным признакам и при достижении суммы баллов 15 и выше делают вывод о высоком метастатическом потенциале, а при сумме баллов, равной 14 и менее, делают вывод о низком метастатическом потенциале ИПР молочной железы у данной больной. Чувствительность предлагаемого способа составляет 0,857, специфичность - 0,769, точность способа - 0,788. Изобретение обеспечивает возможность определения метастатического потенциала указанного вида опухоли, что важно для выбора дальнейшей тактики лечения пациенток. 10 з.п. ф-лы, 3 табл.

 

Изобретение относится к медицине.

Известны способы оценки метастатического потенциала опухоли у больных раком молочной железы (РМЖ), а именно:

1. Способ оценки метастатического потенциала клеток рака молочной железы путем определения экспрессии гена транскрипционного фактора (GSEF). Метод включает в себя следующие действия: выявление уровня GSEF генного продукта в пробе, полученной от нормальной ткани молочной железы; выявление уровня GSEF генного продукта в пробе, полученной из опухоли молочной железы; при этом если уровень GSEF генного продукта в камере с образцом опухоли значительно ниже, чем в контроле, то это указывает на то, что опухоль молочной железы содержит раковые клетки с высоким метастатическим потенциалом. Метод основан на анализе 9-ти клеточных линий человеческой карциномы молочной железы с высоким метастатическим потенциалом и 6-ти клеточных линий человеческой карциномы молочной железы, который определяли на ксеногенной модели - по способности формировать опухолевые узлы у мышей после инъекции опухолевых клеток (US 6566063 B1 Methods for determining metastatic potential of breast cancer cells by detecting GSEF gene product expression.. Заявлено 12 мая 2000; дата публикации 20 мая 2003; авторы изобретения - Joerg Kaufmann, Hong Xin, Greg Harrowe).

Способ включает сложный анализ, использование при разработке ксеногенной модели (мышей) метастазирования опухоли - в качестве метастазов рассматриваются опухолевые узлы, образующиеся у мышей после инъекции им ксеногенных опухолевых клеток (человека), отсутствует адаптация способа к клинической онкологической практике. Это делает применение данного метода затруднительным для широкой практики с целью диагностики метастазов в лимфатических узлах при раке молочной железы.

2. Цитоморфологический способ вероятностной диагностики метастазов у больных раком молочной железы, основанный на оценке доли пролиферирующих клеток РМЖ с помощью моноклональных антител к ядерным белкам пролиферации, уровня пролиферативной активности, по которым определяют вероятность генерализации процесса (патент РФ №2129278 на изобретение «Способ прогнозирования отдаленных метастазов у больных раком молочной железы». Дата подачи заявки: 22.07.1997; дата публикации: 20.04.1999. Автор(ы): Гуляк Н.С.; Сергеева Н.С.; Чиссов В.И.; Демидов В.П.; Пак Д.Д.; Джубалиева С.К.).

Метод разработан для оценки вероятности гематогенного метастазирования в отдаленные органы и не может быть применен для оценки метастазирования в регионарные лимфатические узлы.

3. Способ оценки вероятности лимфогенного метастазирования инфильтрирующего протокового рака молочной железы, который заключается в том, что проводят морфологическое исследование пробы инфильтративного компонента рака молочной железы с определением процентного содержания микроальвеолярных структур (MAC) по отношению к остальным выделяемым структурам компонента. При их содержании менее 10% определяют низкую, при их содержании от 11% до 50% - умеренную, а при их содержании 51-75% и более - высокую вероятность лимфогенного метастазирования инфильтрирующего протокового рака молочной железы (патент РФ №2362165 на изобретение «Способ оценки вероятности лимфогенного метастазирования инфильтрирующего протокового рака молочной железы». Заявка: 2006121304/15, 15.06.2006. Опубликовано: 20.07.2009. Автор(ы): Завьялова М.В., Перельмутер В.М., Слонимская Е.М., Вторушин С.В.) (прототип).

Рассчитанные согласно таблице 3 описания данного изобретения значения чувствительности, специфичности и точности способа-прототипа (полученные в результате объединения подгрупп с отсутствием MAC и наличием их в количестве менее 10% в группу «отрицательное значение теста», а подгрупп с содержанием MAC 11-75% и более - в группу «положительное значение теста») составили соответственно: 0,503; 0,732; 0,614.

Раскрытие изобретения

Сущность предлагаемого способа определения метастатического потенциала инвазивного протокового рака (ИПР) молочной железы заключается в следующем. Операционный материал молочной железы больной обрабатывают для морфологического исследования (фиксируют, заливают в парафин, делают серийные срезы). Срезы окрашивают для выявления таких компонентов внеклеточного матрикса, как коллагеновые волокна, сульфатированные гликозаминогликаны, нейтральные гликопротеины. На окрашенных препаратах оценивают в баллах степень выраженности следующих признаков изменения десмопластической стромы: разволокнение пучков коллагеновых волокон и их распад (данный признак для краткости именуется далее признаком «А»); наличие участков с изменением физико-химических свойств коллагеновых волокон, именуемый далее признаком «Б»; повышение содержания нейтральных гликопротеинов в участках разрушения коллагеновых волокон, именуемый далее признаком «В»; снижение содержания сульфатированных гликозаминогликанов в десмопластической строме, именуемый далее признаком «Г»; наличие и выраженность инфильтрации внеклеточного матрикса лимфо-гистиоцитарными элементами, именуемый далее признаком «Д»; наличие отека в зоне параконкрозной инфильтрации, именуемое далее признаком «Е». Отсутствие каждого из вышеуказанных признаков изменения десмопластической стромы на срезах операционного материала молочной железы данной больной оценивают нулем баллов; незначительное, умеренное и выраженное проявление каждого из признаков оценивают одним, тремя и семью баллами соответственно. Затем суммируют баллы по вышеприведенным признакам и при достижении суммы баллов 15 и выше делают вывод о высоком метастатическом потенциале, а при сумме баллов, равной 14 и менее, делают вывод о низком метастатическом потенциале ИПР молочной железы у данной больной.

Незначительным проявлением признака «А» является разволокнение пучков коллагена при отсутствии их деградации; умеренным проявлением данного признака - наличие участков значительного разволокнения пучков коллагеновых волокон, которое сочетается с размытостью контуров и незначительной фрагментированностью коллагеновых волокон; выраженным проявлением признака «А» - наличие глыбчатого распада коллагеновых волокон.

Незначительным проявлением признака «Б» является наличие на всем препарате единичных мелких участков с изменением физико-химических свойств коллагена; умеренным проявлением признака «Б» - наличие на препарате более 3-х мелких участков с изменением физико-химических свойств коллагена; выраженным проявлением признака «Б» является наличие на препарате более 3-х обширных участков с изменением его физико-химических свойств.

Изменение физико-химических свойств коллагена определяют по изменению его тинкториальных свойств, что при окраске коллагеновых волокон пикрофуксином по ван Гизону проявляется заменой ярко-красного или малинового окрашивания коллагеновых волокон на оранжево-коричневое.

Незначительное проявление признака «В» определяют по наличию на препарате единичных мелких участков повышения содержания нейтральных гликопротеинов в участках разрушения коллагеновых волокон; умеренное проявление признака «В» - по тому, что повышение содержания нейтральных гликопротеинов в участках разрушения коллагеновых волокон наблюдается на большей части поля зрения в большинстве полей зрения; выраженное проявление признака «В» определяют по тому, что наряду с повышением содержания нейтральных гликопротеинов в участках разрушения коллагеновых волокон на большей части поля зрения в большинстве полей зрения, наблюдается один или несколько участков резко выраженного повышения их содержания.

При выявлении нейтральных гликопротеинов PAS-реакцией по McManus, нормальное содержание нейтральных гликопротеинов в участках разрушения коллагеновых волокон (отсутствие признака «В») определяют по светло-фиолетовому окрашиванию нейтральных гликопротеинов; незначительное повышение их содержания (незначительное проявление признака «В») - по наличию единичных мелких участков фиолетового окрашивания в областях разрушения коллагеновых волокон; умеренное проявление признака «В» - по фиолетовому окрашиванию, которое занимает большую часть поля зрения в большинстве полей зрения); выраженное проявление признака «В» определяют по тому, что, наряду с фиолетовым окрашиванием, которое занимает большую часть поля зрения в большинстве полей зрения, наблюдаются один или несколько участков с темно-фиолетовым или фиалковым окрашиванием.

Незначительным, умеренным и выраженным проявлением признака «Г» является соответственно незначительное, умеренное и выраженное снижения содержания сульфатированных гликозаминогликанов во внеклеточном матриксе.

При выявлении сульфатированных гликозаминогликанов окраской альциановым синим при pH 1,0 с последующей докраской ядер кармалюмом Маера, нормальное содержание сульфатированных гликозаминогликанов во внеклеточном матриксе (отсутствие признака «Г») определяют по бирюзовому окрашиванию препарата; незначительное снижение содержания сульфатированных гликозаминогликанов в десмопластической строме (незначительное проявление признака «Г») определяют по наличию одного или нескольких светло-бирюзовых участков на препарате, остальная часть которого имеет бирюзовое окрашивание; умеренное проявление признака «Г» - по наличию единичных бледно-розовых участков; выраженное проявление признака - по наличию множественных розовых участков на препарате.

Незначительное проявление признака «Д» определяют по наличию участков лимфо-гистиоцитарной инфильтрации с площадью каждого, равной одному полю зрения или менее с неплотным распределением клеточных элементов; умеренное проявление признака «Д» - по наличию одного или более обширных участков лимфо-гистиоцитарной инфильтрации с площадью каждого, превышающей одно поле зрения, с неплотным распределением клеточных элементов; выраженное проявление признака «Д» - по наличию одного или более обширных участков лимфо-гистиоцитарной инфильтрации с плотным распределением клеточных элементов.

Незначительным, умеренным и выраженным проявлением признака «Е» является соответственно незначительный, умеренный и выраженный отек в зоне параконкрозной инфильтрации.

При незначительном проявлении признака «Е» компоненты внеклеточного матрикса занимают более 75% площади поля зрения; при умеренном проявлении признака - компоненты внеклеточного матрикса занимают от 25 до 75% поля зрения; при выраженном проявлении признака «Е» компоненты внеклеточного матрикса занимают менее 25% площади поля зрения.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение чувствительности, специфичности и точности способа определения метастатического потенциала инвазивного протокового рака молочной железы.

Обоснование изобретения

Было проведено изучение метастатического потенциала инвазивного протокового рака молочной железы, состоящее из двух этапов.

На первом этапе исследовали операционный материал опухоли молочной железы от пациенток с заключительным диагнозом «инвазивный протоковый рак молочной железы». Одну группу этих пациенток составили пациентки с установленным наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах и установленным их количеством, другую группу - пациентки с установленным отсутствием метастазов в регионарных лимфатических узлах.

Целью данного этапа являлось выявление признаков, характеризующих изменения десмопластической стромы опухоли, коррелирующих с наличием метастазов (выявление указанных признаков, степени их выраженности и разработка ее балльной оценки).

На втором этапе было проведено слепое исследование, когда эксперт не знал о наличии или отсутствии метастазов в регионарных лимфатических узлах. Целью данного этапа являлось установление точности оценки метастатического потенциала опухоли молочной железы с помощью предлагаемого способа.

Материал и методы исследования

Исследование было проведено на операционном материале опухоли молочной железы 53 пациенток с инвазивным протоковым раком молочной железы (злокачественная опухоль) в возрасте 59 (54,5; 66,5) лет и операционном материале молочной железы 11 пациенток с фиброаденомой (доброкачественная опухоль) в возрасте 48 (28,0; 56,8) лет.

На первом этапе исследовали операционный материал опухоли молочной железы 20 пациенток с инвазивным протоковым раком молочной железы. Метастазы в регионарных лимфатических узлах присутствовали у 8 из них, у остальных 12-ти их не было.

На втором этапе исследовали операционный материал опухоли молочной железы 33 пациенток с инвазивным протоковым раком молочной железы, у 7 из которых было установлено наличие метастазов в регионарных лимфатических узлах, у остальных 26 пациенток было установлено их отсутствие. Кроме того, был исследован операционный материал 11 пациенток с фиброаденомой молочной железы (группа сравнения).

Операционный материал молочной железы фиксировали в 12% формалине. Из залитых в парафин объектов делали серийные срезы толщиной 7 мкм, которые размещали на 4-х группах предметных стекол: для обзорной микроскопии (определения лимфо-гистиоцитарной инфильтрации, степени выраженности отека в области инфильтрации), а также для выявления таких компонентов внеклеточного матрикса, как коллагеновые волокна, сульфатированные гликозаминогликаны, нейтральные гликопротеины. На полученных срезах изучали одни и те же участки ткани, при этом оценивали зону опухолевой инвазии и зону параконкрозной инфильтрации. Морфология молочной железы оценивалась при обзорной микроскопии после окраски срезов гематоксилином Эрлиха и эозином. Коллагеновые волокна выявляли пикрофуксином по ван Гизону, сульфатированные гликозаминогликаны - альциановым синим при pH 1,0 с последующей докраской ядер кармалюмом Маера, нейтральные гликопротеины - PAS реакцией по McManus (Роскин Г.И., Левинсон Л.Б., 1957; Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996).

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием программного пакета для статистической обработки SPSS v 17.0 for Windows. Для сравнения независимых групп использовали критерий Крускала-Уоллиса с последующим межгрупповым сравнением с помощью критерия Манна-Уитни. Различия между значениями сравниваемых параметров расценивали как статистически значимые при p<0,05. Полученные в ходе исследования данные представлены как медиана (Me) и интерквартильный размах (Q₁; Q₃).

Результаты исследования

Первый этап исследования

При морфологическом изучении компонентов десмопластической стромы на гистологических препаратах, полученных с блоков образцов операционного материала опухоли, было отмечено, что внеклеточный матрикс по своим характеристикам у пациенток с инвазивным протоковым раком, имеющих метастазы в регионарных лимфатических узлах, отличается от такового у пациенток с отсутствием последних (таблица 2).

Группа пациенток с инвазивным протоковым раком и наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах

У большинства пациенток данной группы имелось значительное разволокнение пучков коллагеновых волокон, размытость их контуров, фрагментированность (3 балла по признаку «А»). У некоторых больных имелись участки с глыбчатым распадом коллагеновых волокон (7 баллов по признаку «А»).

При этом наблюдались множественные обширные участки с изменением физико-химических свойств коллагеновых волокон, проявлявшемся изменением их тинкториальных свойств (7 баллов по признаку «Б»).

В участках разрушения коллагеновых волокон наблюдалось умеренное увеличение количества нейтральных гликопротеинов (3 балла по признаку «В»).

У подавляющего большинства пациенток с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах отмечалось незначительное снижение содержания сульфатированных гликозаминогликанов в десмопластической строме (1 балл по признаку «Г»).

Вместе с тем, на гистологических препаратах части пациенток наряду с участками незначительного снижения содержания сульфатированных гликозаминогликанов, наблюдались участки умеренного (3 балла по признаку «Г»), а у части - выраженного снижения их содержания (7 баллов по признаку «Г»).

При оценке выраженности инфильтрации опухоли лимфо-гистиоцитарными элементами у пациенток с наличием метастазов, как правило, отмечались обширные участки с неплотным распределением клеточных элементов - клеточные элементы находились на расстоянии более трех диаметров клетки (3 балла по признаку «Д»).

В зоне параконкрозной инфильтрации имелся отек - наблюдалось уменьшение плотности компонентов внеклеточного матрикса в пределах 25-75% поля зрения (3 балла по признаку «Е»).

Группа пациенток с инвазивным протоковым раком и отсутствием метастазов в регионарных лимфатических узлах

Морфологическое исследование препаратов в подавляющем большинстве случаев обнаруживало незначительное разволокнение пучков коллагена при отсутствии их деградации (таблица 2) (1 балл по признаку «А»). У единичных пациенток выявлялись области со значительным разволокнением пучков коллагеновых волокон, размытостью их контуров, фрагментированностью (3 балла по признаку «А») и, крайне редко, глыбчатым распадом коллагеновых волокон (7 баллов по признаку «А»).

Однако в отличие от категории пациенток с метастазами, в подобных участках не наблюдалось изменение физико-химических свойств коллагеновых волокон, отсутствовало изменение их тинкториальных свойств (0 баллов по признаку «Б»).

На срезах этой категории пациенток в участках измененных коллагеновых волокон наблюдалось незначительное повышение содержания нейтральных гликопротеинов (1 балл по признаку «В»).

У подавляющего большинства пациенток отмечалось снижение содержания сульфатированных гликозаминогликанов в десмопластической строме (1 балл по признаку «Г»), но, в отличие от пациенток с наличием метастазов, не наблюдалось выраженного их снижения.

При оценке выраженности инфильтрации опухоли лимфо-гистиоцитарными элементами у пациенток этой группы, в отличие от пациенток с метастазами, отмечались лишь небольшие участки с неплотным распределением клеточных элементов (клеточные элементы находятся на расстоянии более трех диаметров клетки) (1 балл по признаку «Д»).

При этом в тех случаях, когда наблюдалась лимфоцитарная инфильтрация, компоненты внеклеточного матрикса, в отличие от категории больных с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах, занимали более 75% площади поля зрения, как следствие незначительности отека (1 балл по признаку «Е»).

Сумма балльной оценки изменений внеклеточного матрикса у категорий больных с инвазивным протоковым раком с наличием метастазов и без метастазов в регионарных лимфатических узлах имела высокую статистическую значимость различий (p<0,001).

Результатом исследований, проведенных на первом этапе, явилась приведенная ниже таблица признаков и их балльная оценка (таблица 1).

Примечание:

* - достоверные отличия по сравнению с группой больных без метастазов при p<0,01;

** - достоверные отличия по сравнению с группой больных без метастазов при p<0,001.

Второй этап исследования

При морфологическом изучении десмопластической стромы опухоли на образцах операционного материала было отмечено, что она по своим характеристикам у пациенток с инвазивным протоковым раком, имеющих метастазы в регионарных лимфатических узлах, так же, как и на первом этапе исследования, отличалась от десмопластической стромы опухоли у пациенток без метастазов, и тем более от внеклеточного матрикса пациенток с фиброаденомой (таблица 3).

Группа пациенток с инвазивным протоковым раком и метастазами в регионарных лимфатических узлах

На препаратах этой группы пациенток кроме областей со значительным разволокнением пучков коллагеновых волокон, размытостью их контуров, фрагментированностью (3 балла по признаку «А») наблюдался глыбчатый распад коллагеновых волокон (7 баллов по признаку «А»).

Имелись множественные обширные участки с выраженным изменением физико-химических свойств коллагена, проявлявшемся изменением тинкториальных свойств коллагеновых волокон (7 баллов по признаку «Б»).

В участках разрушения коллагеновых волокон наблюдалось умеренное повышение содержания нейтральных гликопротеинов (3 балла по признаку «В»), а на препаратах отдельных пациенток - выраженное повышение их содержания (7 баллов по признаку «В»).

У подавляющего большинства пациенток данной группы было обнаружено незначительное снижение содержания сульфатированных гликозаминогликанов в десмопластической строме (1 балл по признаку «Г»). Вместе с тем, у части пациенток отмечалось умеренное снижение их содержания (3 балла по признаку «Г»), а у отдельных пациенток - выраженное снижение (7 баллов по признаку «Г»).

При оценке степени выраженности инфильтрации опухоли лимфо-гистиоцитарными элементами, как правило, отмечались обширные участки с неплотным распределением клеточных элементов (клеточные элементы находились на расстоянии более трех диаметров клетки) (3 балла по признаку «Д»).

У большинства пациенток в зоне параконкрозной инфильтрации отмечался отек - уменьшение плотности компонентов внеклеточного матрикса: они занимали менее 25% поля зрения (7 баллов по признаку «Е»).

Группа пациенток с инвазивным протоковым раком и отсутствием метастазов в регионарных лимфатических узлах

В подавляющем большинстве случаев наблюдалось незначительное разволокнение пучков коллагена при отсутствии их деградации (таблица 2) (1 балл по признаку «А»). На гистологических препаратах отдельных пациенток выявлялись области со значительным разволокнением пучков коллагеновых волокон, размытостостью их контуров, фрагментированностью (3 балла по признаку «А») или глыбчатым распадом коллагеновых волокон (7 баллов по признаку «А»).

Однако в отличие от группы пациенток с метастазами, в подобных областях имелись лишь единичные мелкие участки с изменением физико-химических свойств коллагеновых волокон (1 балл по признаку «Б»).

В участках измененных коллагеновых волокон наблюдалось незначительное повышение содержания нейтральных гликопротеинов (1 балл по признаку «В»).

У подавляющего большинства пациенток наблюдалось незначительное снижение содержания сульфатированных гликозаминогликанов в десмопластической строме (1 балл по признаку «Г»). В отличие от пациенток с наличием метастазов не наблюдалось выраженного снижения сульфатированных гликозаминогликанов.

При оценке степени выраженности инфильтрации опухоли лимфо-гистиоцитарными элементами у пациенток без метастазов, в отличие от пациенток с метастазами, отмечались лишь небольшие участки с неплотным распределением клеточных элементов (клеточные элементы находились на расстоянии более трех диаметров клетки) (1 балл по признаку «Д»).

В тех случаях, когда наблюдалась лимфо-гистиоцитарная инфильтрация, компоненты внеклеточного матрикса, в отличие от категории больных с метастазами, занимали более 75% площади поля зрения, как следствие незначительности отека (1 балл по признаку «Е»).

Необходимо отметить, что сумма балльной оценки изменений внеклеточного матрикса у категорий больных с инвазивным протоковым раком с наличием метастазов и без метастазов в регионарных лимфатических узлах статистически достоверно различались (таблица 3). Кроме того, имелась средняя положительная корреляционная связь между этим показателем и количеством метастазов (r=0,670; p<0,0001).

Группа пациенток с фиброаденомой

При морфологическом исследовании препаратов пациенток этой группы не наблюдалось участков с дегенеративными изменениями коллагеновых волокон (таблица 3) (0 баллов по признаку «А»), более того, пучки коллагеновых волокон были мощнее и плотно примыкали друг к другу.

В отличие от пациенток с инвазивным протоковым раком никаких изменений физико-химических и, как следствие, тинкториальных свойств коллагена ни в одном случае не наблюдалось (0 баллов по признаку «Б»).

Учитывая, что участков с дегенеративными изменениями коллагеновых волокон не наблюдалось, признак «повышение содержания нейтральных гликопротеинов в участках разрушения коллагеновых волокон» оценивался нулем баллов.

Вместе с тем необходимо отметить, что при постановке PAS-реакции на препаратах пациенток с фиброаденомой отмечалось усиление интенсивности окрашивания нейтральных гликопротеинов, как отражение повышенной их продукции фибробластами/фиброцитами.

У пациенток с фиброаденомой в отличие от пациенток с инвазивным протоковым раком обнаружилось повышение содержания сульфатированных гликозаминогликанов в десмопластической строме, как отражение повышенной их продукции фибробластами/фиброцитами (0 баллов по признаку «Г»).

В отличие от пациенток с инвазивным протоковым раком, у пациенток с фиброаденомой инфильтрация лимфогистиоцитарными элементами наблюдалась лишь у единичных пациенток, на непротяженных участках и с неплотным распределением клеточных элементов (клеточные элементы находились на расстоянии более трех диаметров клетки) (0 баллов по признаку «Д» у большинства пациенток.

В тех случаях, когда наблюдалась лимфоцитарная инфильтрация, компоненты внеклеточного матрикса, в отличие от больных с инвазивным протоковым раком, занимали более 75% площади поля зрения (1 балл по признаку «Е»), как следствие незначительности отека.

Примечание:

* - достоверные отличия по сравнению с группой больных без метастазов при p<0,05;

** - достоверные отличия по сравнению с группой больных без метастазов при p<0,01;

*** - достоверные отличия по сравнению с группой больных без метастазов при p<0,001.

Чувствительность предлагаемого способа составила 0,857, специфичность - 0,769, точность способа - 0,788.

Для уточнения качества предлагаемого способа определения метастатического потенциала опухоли молочной железы была построена ROC-кривая. Полученное значение площади под кривой (англ. Area Under Curve, AUC) было равно 0,915, что свидетельствовало об отличном качестве предлагаемой модели (Mossman D1, Somoza Е. ROC curves, test accuracy, and the description of diagnostic tests // J Neuropsychiatry Clin Neurosci. 1991 Summer; 3(3):330-3; Hanley JA, McNeil BJ. The meaning and use of the area under a receiver operating characteristic (ROC) curve // Radiology. 1982 Apr; 143(1):29-36).

Примеры осуществления изобретения

Больная А-ва.

Патологоанатомическое заключение: инвазивный протоковый рак молочной железы.

При морфологическом изучении образцов операционного материала молочной железы были выявлены следующие изменения или отсутствие изменений десмопластической стромы по признакам «А»-«Е»:

А - значительное разволокнение пучков коллагеновых волокон, размытость контуров волокон, незначительная фрагментированность коллагеновых волокон - 3 балла;

Б - отсутствие участков с изменением тинкториальных свойств коллагеновых волокон (коллагеновые волокна имели интенсивно малиновую окраску) - 0 баллов;

В - отсутствовало повышение содержания нейтральных гликопротеинов в участках разрушения коллагеновых волокон - 0 баллов;

Г - снижение содержания сульфатированных гликозаминогликанов в десмопластической строме, которое проявлялось уменьшением интенсивности сродства к бирюзовой окраске (наличием нескольких светло-бирюзовых участков на фоне бирюзового окрашивания остальной части препарата») - 1 балл;

Д - наличие небольших участков с неплотным распределением клеточных элементов - 1 балл;

Е - незначительный отек: компоненты внеклеточного матрикса в зоне параконкрозной инфильтрации занимали более 75% площади поля зрения - 1 балл.

Сумма баллов равнялась 6, что соответствовало низкому метастатическому потенциалу опухоли у данного пациента.

При исследовании регионарных лимфатических узлов метастазы не были выявлены.

Больная Е-на.

Патологоанатомическое заключение: инвазивный протоковый рак молочной железы.

При морфологическом изучении образцов операционного материала молочной железы были выявлено следующие изменения десмопластической стромы по признакам «А»-«Е»:

А - незначительное разволокнение пучков коллагена при отсутствии их деградации - 1 балл;

Б - отсутствие участков с изменением тинкториальных свойств коллагеновых волокон - 0 баллов;

В - выраженное повышение содержания нейтральных гликопротеинов в участках разрушения коллагеновых волокон. Наряду с общим усилением интенсивности фиолетовой окраски выявлялись участки с интенсивно фиолетовой окраской (более 75% поля зрения окрашена в фиолетовый цвет, в большинстве полей зрения, наблюдается один или несколько участков с темно-фиолетовой или фиалковой окраской) - 7 баллов;

Г - содержание сульфатированных гликозаминогликанов в десмопластической строме не снижено, внеклеточный матрикс окрашен в бирюзовый цвет - 0 баллов;

Д - наличие непротяженных участков с неплотным распределением клеточных элементов - 1 балл;

Е - умеренный отек: компоненты внеклеточного матрикса в зоне параконкрозной инфильтрации занимают 40% площади поля зрения - 3 балла.

Сумма баллов равнялась 12, что соответствовало низкому метастатическому потенциалу опухоли у данного пациента.

При исследовании регионарных лимфатических узлов метастазы не выявлены.

Больная Б-ко.

Патологоанатомическое заключение: инвазивный протоковый рак молочной железы.

При морфологическом изучении образцов операционного материала молочной железы были выявлены следующие изменения десмопластической стромы по признакам «А»-«Е»:

А - участки с глыбчатым распадом коллагеновых волокон - 7 баллов;

Б - множественные обширные участки с изменением тинкториальных свойств коллагеновых волокон, в которых они приобретали оранжево-коричневую окраску - 7 баллов;

В - повышение содержания нейтральных гликопротеинов в участках разрушения коллагеновых волокон не отмечалось - 0 баллов;

Г - снижение содержания сульфатированных гликозаминогликанов в десмопластической строме, которое проявлялось уменьшением интенсивности сродства к бирюзовой окраске (наблюдали наличие нескольких светло-бирюзовых участков в разных полях зрения на фоне бирюзового окрашивания остальной части препарата) - 1 балл;

Д - наличие непротяженных участков с неплотным распределением клеточных элементов - 1 балл;

Е - незначительный отек: компоненты внеклеточного матрикса в зоне параконкрозной инфильтрации занимали более 75% площади поля зрения - 1 балл.

Сумма баллов равнялась 17, что соответствовало высокому метастатическому потенциалу опухоли у данного пациента. При исследовании регионарных лимфатических узлов в одном из них были выявлены опухолевые клетки.

Больная Д-ва.

Патологоанатомическое заключение: инвазивный протоковый рак молочной железы.

При морфологическом изучении образцов операционного материала молочной железы были выявлены следующие изменения десмопластической стромы по признакам «А»-«Е»:

А - участки с глыбчатым распадом коллагеновых волокон - 7 баллов;

Б - множественные обширные участки с изменением тинкториальных свойств коллагеновых волокон, в которых они приобретали оранжево-коричневую окраску - 7 баллов;

В - выраженное повышение содержания нейтральных гликопротеинов в участках разрушения коллагеновых волокон. Наряду с общим усилением интенсивности фиолетовой окраски, наблюдались участки с интенсивно фиолетовой окраской (более 75% поля зрения окрашена в фиолетовый цвет в большинстве полей зрения, наблюдается один или несколько участков с темно-фиолетовой или фиалковой окраской) - 7 баллов;

Г - выраженное снижение содержания сульфатированных гликозаминогликанов в десмопластической строме; уменьшение интенсивности окрашивания бирюзовой краской и наличие множественных розовых участков - 7 балл;

Д - обширные участки с неплотным распределением клеточных элементов (клеточные элементы находятся на расстоянии более чем три диаметра клетки) - 3 балла;

Е - выраженный отек: компоненты внеклеточного матрикса занимают менее 25% площади поля зрения - 7 баллов.

Сумма баллов равнялась 38, что соответствовало высокому метастатическому потенциалу опухоли у данной пациентки. При исследовании регионарных лимфатических узлов в 15 из них были выявлены опухолевые клетки.

Больная Г-ко.

Патологоанатомическое заключение: фиброаденома молочной железы.

При морфологическом изучении образцов операционного материала молочной железы были выявлены следующие изменения десмопластической стромы по признакам «А»-«Е»:

А - отсутствие распада коллагеновых волокон, а также их разволокнения - 0 балла;

Б - отсутствие участков с изменением тинкториальных свойств коллагеновых волокон - 0 баллов;

В - учитывая, что участков с дегенеративными изменениями коллагеновых волокон не наблюдалось, показатель «повышение содержания нейтральных гликопротеинов в участках разрушения коллагеновых волокон» расценивался как отсутствие признака - 0 баллов;

Г - незначительное снижение содержания сульфатированных гликозаминогликанов в десмопластической строме, которое проявлялось уменьшением интенсивности сродства к бирюзовой окраске (наблюдалось нескольких светло-бирюзовых участков на фоне бирюзового окрашивания остальной части препарата) - 1 балл;

Д - отсутствие участков инфильтрации лимфо-гистиоцитарными элементами - 0 баллов;

Е - учитывая, что параконкрозная инфильтрация отсутствовала, показатель «уменьшение плотности компонентов внеклеточного матрикса в зоне параконкрозной инфильтрации, как проявление отека» расценивался как отсутствие признака - 0 баллов.

Сумма баллов равнялась 1, что соответствовало низкому метастатическому потенциалу опухоли у данного пациента. При исследовании регионарных лимфатических узлов метастазы отсутствовали.

По литературным данным, у 70% больных раком выявляются метастазы, и в 90% случаев смерть от рака наблюдается в результате метастазов (Arvelo F, Sojo F, Cotte С. Cancer and the metastatic substrate // Ecancermedicalscience. 2016 Dec 8; 10:701. doi: 10.3332/ecancer. 2016.701. Review). Этот факт подчеркивает актуальность своевременной диагностики метастатического поражения. Поэтому определение метастатического потенциала опухоли, т.е. способности опухоли к метастазированию, является важной клинико-диагностической задачей.

1. Способ определения метастатического потенциала инвазивного протокового рака (ИПР) молочной железы, включающий обработку операционного материала молочной железы пациента и получение срезов для морфологического исследования, отличающийся тем, что срезы окрашивают для выявления таких компонентов внеклеточного матрикса, как коллагеновые волокна, сульфатированные гликозаминогликаны, нейтральные гликопротеины, а также выявления инфильтрации внеклеточного матрикса опухоли лимфо-гистицитарными элементами и его отека; на окрашенных препаратах оценивают в баллах степень выраженности следующих признаков изменения десмопластической стромы: разволокнение пучков коллагеновых волокон и их распад, именуемый далее признаком «А»; наличие участков с изменением физико-химических свойств коллагеновых волокон, именуемый далее признаком «Б»; повышение содержания нейтральных гликопротеинов в участках разрушения коллагеновых волокон, именуемый далее признаком «В»; снижение содержания сульфатированных гликозаминогликанов в десмопластической строме, именуемый далее признаком «Г»; наличие и выраженность инфильтрации внеклеточного матрикса лимфо-гистиоцитарными элементами, именуемый далее признаком «Д»; наличие отека в зоне инфильтрации, именуемый далее признаком «Е»; отсутствие каждого из вышеуказанных признаков изменения десмопластической стромы оценивают нулем баллов; незначительное, умеренное и выраженное проявление каждого из них оценивают одним, тремя и семью баллами соответственно, затем суммируют баллы по вышеприведенным признакам и при достижении суммы баллов 15 и выше делают вывод о высоком метастатическом потенциале, а при сумме баллов, равной 14 и менее, делают вывод о низком метастатическом потенциале ИПР молочной железы у данной больной.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что незначительным проявлением признака «А» является разволокнение пучков коллагена при отсутствии их деградации; умеренным проявлением признака «А» является наличие участков значительного разволокнения пучков коллагеновых волокон, которое сочетается с размытостью контуров волокон и незначительной фрагментированностью коллагеновых волокон; выраженным проявлением признака «А» является наличие глыбчатого распада коллагеновых волокон.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что незначительным проявлением признака «Б» является наличие единичных мелких участков с изменением физико-химических свойств коллагеновых волокон; умеренным проявлением - наличие множественных мелких участков с изменением физико-химических свойств коллагеновых волокон; выраженным проявлением признака «Б» является наличие множественных обширных участков с изменением физико-химических свойств коллагеновых волокон.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что изменение физико-химических свойств коллагеновых волокон определяют по изменению их тинкториальных свойств.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что при окраске коллагеновых волокон пикрофуксином по ван Гизону участки с изменением тинкториальных свойств коллагеновых волокон определяют по изменению ярко-красного или малинового окрашивания на оранжево-коричневое.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что незначительное проявление признака «В» определяют по наличию единичных мелких участков повышения содержания нейтральных гликопротеинов в участках разрушения коллагеновых волокон; умеренное проявлением - по тому, что повышение содержания нейтральных гликопротеинов в участках разрушения коллагеновых волокон наблюдается на большей части поля зрения в большинстве полей зрения; выраженное проявление признака «В» определяют по тому, что наряду с повышением содержания нейтральных гликопротеинов в участках разрушения коллагеновых волокон на большей части поля зрения в большинстве полей зрения наблюдается один или несколько участков резко выраженного повышения их содержания.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что при выявлении нейтральных гликопротеинов PAS-реакцией по McManus нормальное содержание нейтральных гликопротеинов в участках разрушения коллагеновых волокон определяют по светло-фиолетовому окрашиванию нейтральных гликопротеинов; незначительное повышение их содержания определяют по наличию единичных мелких участков фиолетового окрашивания в участках разрушения коллагеновых волокон; умеренное проявление признака «В» определяют по фиолетовому окрашиванию, которое занимает большую часть поля зрения в большинстве полей зрения; выраженное проявление признака «В» определяют по тому, что наряду с фиолетовым окрашиванием, которое занимает большую часть поля зрения в большинстве полей зрения, наблюдаются один или несколько участков с темно-фиолетовым или фиалковым окрашиванием.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что незначительным, умеренным и выраженным проявлением признака «Г» является соответственно незначительное, умеренное и выраженное снижения содержания сульфатированных гликозаминогликанов во внеклеточном матриксе.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что при выявлении сульфатированных гликозаминогликанов альциановым синим при pH 1,0 с последующей докраской ядер кармалюмом Маера отсутствие признака «Г» определяют по бирюзовому окрашиванию препарата; незначительное проявление признака «Г» - по наличию одного или нескольких светло-бирюзовых участков на препарате, остальная часть которого имеет бирюзовое окрашивание; умеренное проявление признака «Г» определяют по наличию единичных бледно-розовых участков; выраженное проявление признака - по наличию множественных розовых участков.

10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что незначительное проявление признака «Д» определяют по наличию участков лимфо-гистиоцитарной инфильтрации площадью, равной одному полю зрения или менее, с неплотным распределением клеточных элементов; умеренное проявление признака «Д» - по наличию обширных участков лимфо-гистиоцитарной инфильтрации, превышающей одно поле зрения, с неплотным распределением клеточных элементов; выраженное проявление признака «Д» определяют по наличию обширных участков лимфо-гистиоцитарной инфильтрации с плотным распределением клеточных элементов.

11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что незначительное проявление признака «Е» определяют по тому, что компоненты внеклеточного матрикса занимают более 75% площади поля зрения; умеренное проявление признака «Е» - по тому, что компоненты внеклеточного матрикса занимают от 25 до 75% поля зрения; выраженное проявление признака «Е» определяют по тому, что компоненты внеклеточного матрикса занимают менее 25% площади поля зрения.