Рекомбинационная кассета, содержащая гены ep153r и ep364r штамма congo (кк-262) вируса африканской чумы свиней и рекомбинантный штамм δсongocd2v вируса африканской чумы свиней



Рекомбинационная кассета, содержащая гены ep153r и ep364r штамма congo (кк-262) вируса африканской чумы свиней и рекомбинантный штамм δсongocd2v вируса африканской чумы свиней
Рекомбинационная кассета, содержащая гены ep153r и ep364r штамма congo (кк-262) вируса африканской чумы свиней и рекомбинантный штамм δсongocd2v вируса африканской чумы свиней
C12N2710/12021 - Микроорганизмы или ферменты; их композиции (биоциды, репелленты или аттрактанты или регуляторы роста растений, содержащие микроорганизмы, вирусы, микробные грибки, ферменты, агенты брожения или вещества, получаемые или экстрагируемые из микроорганизмов или из материала животного происхождения A01N 63/00; пищевые составы A21,A23; лекарственные препараты A61K; химические аспекты или использование материалов для бандажей, перевязочных средств, впитывающих подкладок или хирургических приспособлений A61L; удобрения C05); размножение, консервирование или сохранение микроорганизмов (консервирование живых тканей или органов людей или животных A01N 1/02); мутации или генная инженерия; питательные среды (среды для микробиологических испытаний C12Q)

Владельцы патента RU 2654586:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии", (ФГБНУ ФИЦВиМ) (RU)

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и генной инженерии и касается рекомбинантного штамма вируса африканской чумы свиней. Предложен штамм ΔCongoCD2v вируса африканской чумы свиней с делецией гена EP402R (CD2v), содержащий репортерный ген EGFP под контролем р72 промотора. Получен заявленный штамм из штамма КК-262 вируса АЧС путем гомологичной рекомбинации и депонирован в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии под №3148. Штамм может быть использован для изучения роли белка CD2v вируса АЧС в репродукции вируса в культурах клеток, в восприимчивых животных, а также его функций в модуляции иммунного ответа. 1 ил., 1 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к области молекулярной вирусологии и генной инженерии, в частности к штаммам вируса африканской чумы свиней (АЧС), и может быть использовано в научно-исследовательских институтах для изучения роли белка гемагглютинина (CD2v) вируса африканской чумы свиней в репродукции вируса в культурах клеток, в восприимчивых животных, их функций в модуляции иммунного ответа, а также создания прототипных вакцинных препаратов против АЧС.

Начиная с 2007 года, во многих субъектах Российской Федерации отмечается неблагополучная эпизоотологическая обстановка по АЧС. На территорию нашей страны АЧС была занесена в ноябре 2007 г., заболевание диагностировали у кабанов в Шатойском районе Республики Чечня. В последующие годы (2007-2015 гг.) вспышки болезни регистрировали еще в 35 субъектах России.

Африканская чума свиней является сложным заболеванием, для которого нет доступной вакцины. АЧС относится к списку конвенционных трансграничных болезней, оказывающих значительный экономических и социальный ущерб регионам, в которых они обнаруживаются. Возбудитель АЧС - вирус африканской чумы свиней - единственный известный представитель семейства Asfarviridae [6]. Вирус АЧС способен инфицировать всех представителей семейства Suidae вне зависимости от возраста и пола, кроме того, способен размножаться в мягких клещах рода Ornithodoros [5, 6].

Профилактика и контроль АЧС базируется на двух принципах: раннем выявлении (на основе эпидемиологических, клинических и лабораторных исследований) и строгих санитарных мерах. Таким образом, соответствующие диагностические инструменты должны совершенствоваться, чтобы быть применимыми ко всем сценариям развития болезни и иметь решающее значение для осуществления эффективных программ управления эпидемиями [1, 2, 4].

Несмотря на многолетние исследования, до сих пор не разработаны эффективные средства специфической профилактики АЧС. Неоднократные попытки создания «классических» инактивированных и живых аттенуированных вакцин, ДНК-вакцин и субъединичных вакцин на основе рекомбинатных антигенов не увенчались успехом.

В настоящее время известно более 400 штаммов и изолятов вируса АЧС, обнаруженных на территории стран Карибского бассейна, Европы, Африки и Восточной Европы. Данные исследований различных штаммов демонстрируют, что вирус АЧС обладает выраженным плюралитетом по патогенности, иммуногенности, антигенности, способности вызывать гемадсорбцию [3]. По результатам Bastos et al., 2003 получены данные о существовании 22 генотипов вируса АЧС, на основе филогенетического анализа участка гена р72 [5]. Все отмеченные генотипы вируса циркулируют на территории африканского континента и могут быть субтипированы на группы и субтипы с использованием анализа нуклеотидных последовательностей вариабельных областей генома [4]. Генотипирование вируса АЧС позволило проследить географическое распространение и молекулярную эволюцию возбудителя, однако абсолютно не коррелировало с данными о протективных свойствах различных изолятов.

Предположения о существовании нескольких иммунологических типов вируса АЧС появились в 30-х годах прошлого столетия и получили экспериментальное подтверждение на рубеже 50-60 годов. De Tray D. обнаружил антигенные различия африканских изолятов Хинде, Уганда, Тенгани в реакции задержки гемадсорбции [3]. Используя эту реакцию и иммунологическую пробу на животных, Malmquist W. доказал существование антигенной множественности изолятов, выделенных в Африке [6]. Им установлено семь иммунологических и серологических типов с референс-штаммами: Л-57, Л-60, Хинде-2, Родезия, Дакар, 2743, Мозамбик. Однако представители даже одного иммунологического типа сильно отличались между собой по фенотипическим и биологическим свойствам, что позволило предположить участие регуляторных и репродуктивных систем вируса в данном феномене.

Согласно разработанной в ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии классификации, в основу которой положены результаты РЗГАд типоспецифическими сыворотками и иммунобиологической пробы на свиньях, имеющиеся в коллекции института изоляты вируса АЧС разделены на 8 серогрупп [1]. Наиболее изученными являются штаммы вируса, отнесенные к I-IV серогруппам. Референс-штаммом I-ой серогруппы определен штамм «Лиссабон 57», II-ой - «Конго 49», III-ей - «Мозамбик 78», IV-ой «Франция 32». Нами были определены генетические маркеры, определяющие принадлежность вируса к определенной серогруппе. На основе данных нуклеотидного секвенирования локусов генома, филогенетического анализа, а также использования рекомбинантных штаммов вируса АЧС (Патент на изобретение №2571858) нами были установлены генетические маркеры серотиповой специфичности - гены EP402R (CD2v) и EP153R (C-type lectin).

В продолжение этой работы была рассмотрена гипотеза об использовании локуса C-type lectin/CD2v в качестве протективного антигена для профилактики АЧС. С целью обоснования этой гипотезы необходимо было создать рекомбинантный вирус, лишенный гена гемагглютинина (CD2v), и установить его биологические свойства.

Целью данного изобретения является получение нового рекомбинантного авирулентного штамма вируса африканской чумы свиней ΔCongoCD2v. Рекомбинантный штамм ΔCongoCD2v должен обладать способностью размножаться на перевиваемой клеточной линии COS-1, а также первичной культуре клеток косного мозга свиньи и лейкоцитов. Полученный штамм должен быть не патогенен для свиней и не вызывать гемадсорбцию эритроцитов на поверхности зараженных клеток в условиях in vitro.

Поставленная цель достигается путем создания рекомбинантного штамма вируса АЧС с удаленным геном EP402R (CD2v) и содержит репортерный ген EGFP. Штамм ΔCongoCD2v получен из аттенуированного штамма КК-262 вируса африканской чумы свиней путем гомологичной рекомбинации. Рекомбинационная кассета представляет собой рекомбинантную плазмиду на основе вектора pUC19, содержащая фрагменты генов EP153R и EP364R (плечи рекомбинации), штамма КК-262 вируса АЧС, а также репортерный ген EGFP (Рис. 1). Рекомбинантные клоны вируса были получены при одновременной трансфекции культуры клеток COS-1 рекомбинационной кассетой и инфицировании ее вирусом АЧС штамм КК-262. Для дальнейшего скрининга клонов использовали реакцию бляшкообразования и метод предельных разведений (7 последовательных пассажей на перевиваемой культуре клеток COS-1) и селекции мутантных вариантов вируса по репортерной флюоресценции гена EGFP. Чистота клональной популяции рекомбинантного вируса была подтверждена в ПЦР со специфическими праймерами, фланкирующими фрагмент генов EP152R и EP364R вируса АЧС, а также в ПЦР в режиме реального времени с использованием олигонуклеотидных праймеров и зондов, комплиментарных фрагментам гена EP402R (CD2v). Отсутствие нуклеотидных замен в сайте рекомбинации определяли нуклеотидным секвенированием фрагментов генома вируса.

Изобретение характеризуется следующими нуклеотидными последовательностями:

SEQ ID No 1: Нуклеотидная последовательность рекомбинантной кассеты для получения рекомбинантного штамма ΔCongoCD2v, которая представляет собой плазмиду на основе вектора pUC19, содержащую фрагменты генов EP153R и EP364R штамма КК-262 вируса АЧС, а также репортерный ген EGFP под контролем р72 промотора. pUC19 - последовательность вектора pUC19, Larm (EP153R) - последовательность гена EP153R штамма КК-262 вируса АЧС, p72EGFP - последовательность репортерного гена EGFP и р72 промотора, Rarm (EP364R) - последовательность гена EP364R штамма КК-262 вируса АЧС.

Полученный рекомбинантный авирулентный штамм обозначен как штамм «ΔCongoCD2v» и депонирован в Коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии под №3148.

Молекулярно-генетические свойства.

Проводили генетическую идентификацию полученного рекомбинантного штамма ΔCongoCD2v вируса африканской чумы свиней и сравнительный анализ нуклеотидной последовательности фрагмента генома. Использовали полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с последующим секвенированием продуктов амплификации. ДНК выделяли из 0,2 мл культуры клеток макрофагов свиней, инфицированной рекомбинантным вирусом с помощью набора QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Германия), согласно инструкции изготовителя. ПЦР проводили с праймерами, комплементарными фрагментам генов EP152R и EP364R и представленными в таблице 1.

* Тm - температура отжига праймеров

** bp - пар оснований

Гемадсорбирующие свойства.

Рекомбинантный штамм ΔCongoCD2v утратил гемадсорбирующую активность и не взаимодействовал с эритроцитами свиньи после инфицирования культуры клеток макрофагов свиней.

Культуральные свойства.

Рекомбинантный штамм ΔCongoCD2v вируса АЧС размножается в первичной культуре клеток макрофагов свиней, а также в перевиваемой культуре клеток COS-1. Репродукция вируса в культуре клеток макрофагов свиней сопровождается развитием цитопатического эффекта (ЦПЭ). Отмечается округление клеток и отслоение от субстрата на 2 день после заражения. Инфицированные клетки формируют обособленные кластеры, которые разрушаются по мере репродукции вируса на 3-4 день после заражения. Репродукция вируса в культуре клеток COS-1 не сопровождается выраженным цитолизом. По результатам флюоресцентой микроскопии репортерную флюоресценции от EGFP наблюдают в инфицированных клетках, формирующих небольшие локусы (3-5 клеток). Количество флюоресцирующих (инфицированных) клеток увеличивается по мере культивирования вируса. Накопление вируса как в первичной, так и перевиваемой культуре клеток составляет 6,0-7,0 lg ГАЕ 50/см3.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами.

Рекомбинантный штамм ΔCongoCD2v не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами.

Условия хранения.

Рекомбинантный штамм ΔCongoCD2v хранят при минус 40°С в виде лиофилизированной культуры клеток COS-1, инфицированной рекомбинантным штаммом вируса АЧС. Периодичность освежения штамма один раз в 10 лет.

Пример 1.

Создание рекомбинационной кассеты.

Для получения рекомбинантного штамма ΔCongoCD2v вируса АЧС была сконструирована рекомбинационная кассета, представляющая собой рекомбинантную плазмиду на основе вектора pUC19, содержащая фрагменты генов EP152R и EP364R штамма КК-262 вируса АЧС и репортерный ген EGFP, кодирующий зеленый флюоресцентный белок, под контролем промотера р72 вируса АЧС. Фрагменты генов EP152R и EP364R штамма КК-262 являлись плечами рекомбинации. Клонирование всех фрагментов в бактериальный вектор проводили последовательно с использованием фермента Т4 ДНК-лигазы (NEB, США).

Пример 2.

Рекомбинантный штамм ΔCongoCD2v получен из аттенуированного штамма КК-262 вируса африканской чумы свиней путем гомологичной рекомбинации. Рекомбинантные клоны вируса были получены при одновременной трансфекции культуры клеток COS-1 рекомбинационной кассетой и инфицировании ее штаммом КК-262 вируса АЧС. В результате гомологичной рекомбинации по плечам рекомбинации (фрагментам генов EP152R и EP364R) полученный рекомбинантный вирус представлял собой делетированный мутант вируса КК-262 (не содержал ген EP402R (CD2v)). Для дальнейшего скрининга клонов использовали реакцию бляшкообразования и метод предельных разведений (7 последовательных пассажей на перевиваемой культуре клеток COS-1) и селекции мутантных вариантов вируса по репортерной флюоресценции за счет введенного в состав вируса гена EGFP. Чистота клональной популяции рекомбинатного вируса была подтверждена в ПЦР со специфическими праймерами, фланкирующими фрагмент гена EP402R штамма КК-262 вируса АЧС, а также в ПЦР в режиме реального времени с использованием олигонуклеотидных праймеров и зондов, комплиментарных фрагментам гена EP402R (CD2v). Отсутствие нуклеотидных изменений в сайте рекомбинации определяли путем нуклеотидного секвенирования.

Пример 3.

Определение гемаглютинирующих характеристик рекомбинантного штамма ΔCongoCD2v.

Установлено, что рекомбинантный вирус ΔCongoCD2v утратил гемадсорбирующую активность и не вызывал адгезию эритроцитов на поверхности инфицированных клеток. На основании этих исследований рекомбинантный штамм вируса АЧС ΔCongoCD2v является негемадсорбирующим.

Источники информации:

1. Сероиммунологическая классификация природных изолятов вируса африканской чумы свиней. И.Ф. Вишняков, Н.И. Митин, Ю.И. Петров // Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии: Материалы научно-практической конференции ВНИИВВиМ. - Покров. - 1995. - С. 141-143.

2. Черятников Л.Л. Получение аттенуированных вариантов из различных изолятов вируса АЧС и их сравнительная оценка. / Л.Л. Черятников, Ю.И. Петров, Н.И. Митин // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии 1992. - 4.1. - С. 56.

3. D.Е. De Tray, African swine fever / De Tray D.E., // Adv. Vet. Sci. Comp. Med. - 1963. - №19. P. 299-333.

4. Enhanced discrimination of African swine fever virus isolates through nucleotide sequencing of the p54, p72, and pB602L (CVR) genes / Gallardo C., Mwaengo D.M., Macharia J.M., Arias M., Taracha E.A., Soler A. // Virus Genes. - 2009. - №38. - P. 85-95.

5. Genotyping field strains of African swine fever virus by partial p72 gene characterization / Bastos ADS, Penrith M.L., Cruciere C., Edrich J.L., Hutchings G., Roger F., Couacy-Hymann E., Thomson G.R. // Arch. Virol. - 2003. - №148. P. 693-706.

6. W. Malmquist, D. Hay, Haemadsorption and cytopathic effect produced by African swine fever virus in swine bone marrow and buffy coat cultures /Malmquist W., Hay D. // J. Vet. Res. - 1960. - №21. P. 104-108

Рекомбинантный штамм ΔCongoCD2v вируса африканской чумы свиней с делецией гена EP402R (CD2v), содержащий репортерный ген EGFP под контролем р72 промотора, полученный из штамма КК-262 вируса АЧС путем гомологичной рекомбинации, депонированный в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии под №3148, для изучения роли белка CD2v вируса АЧС в репродукции вируса в культурах клеток, в восприимчивых животных, а также его функций в модуляции иммунного ответа.



 

Похожие патенты:

Изобретения касаются способа доставки или переноса гетерологичной полинуклеотидной последовательности в печень млекопитающему и способа лечения млекопитающего с недостаточностью экспрессии фактора свертывания крови или функции.

Представленный рекомбинантный штамм обладает адресной онколитической активностью и продуцирует секретируемый химерный белок, состоящий из ГМ-КСФ человека и лактаптина (GMCSF/lact).

Изобретения относятся к области медицины и вирусологии. Представлены аттенуированные вирусы гриппа А, векторы на их основе и содержащие их фармацевтические композиции.

Изобретения касаются рекомбинантного непатогенного вируса болезни Марека (rMDVnp), представляющего собой рекомбинантный вирус герпеса индеек (rHVT), а также вакцины, содержащей такой вирус, и способа защиты кур против вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV) и вируса болезни Ньюкасла (NDV).

Изобретение относится к рекомбинантному штамму вируса осповакцины (VACV). Охарактеризованный рекомбинантный штамм VV-GMCSF-S-Lact сконструирован на основе штамма Л-ИВП вируса осповакцины, содержащего делеции фрагментов генов вирусной тимидинкиназы и ростового фактора, в районы которых встроены: ген гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) человека, структура которого соответствует кДНК матричной РНК ГМ-КСФ человека, в центральной части гена вирусной тимидинкиназы; и ген секретируемого лактаптина S-Lact, кодирующий фрагмент каппа-казеина человека 23-134 а.о.

Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и медицины. Предложены вирионы аденоассоциированного вируса (AAV) с вариантным капсидным белком, где вирионы AAV демонстрируют большую инфекционность ретинальной клетки, когда вводятся интравитреальной инъекцией, по сравнению с AAV дикого типа.

Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и иммунологии. Описаны новые аденовирусные штаммы с улучшенной серопревалентностью.

Изобретение относится к рекомбинантному штамму вируса осповакцины (ВОВ). Представленный рекомбинантный штамм VV-GMCSF-Lact сконструирован на основе штамма Л-ИВП вируса осповакцины, содержащего делеции фрагментов генов вирусной тимидинкиназы и ростового фактора, в районы которых встроены: ген гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) человека, структура которого соответствует к ДНК матричной РНК ГМ-КСФ человека, в центральной части гена вирусной тимидинкиназы; и ген лактаптина, кодирующий фрагмент каппа-казеина человека 23-134 а.о., в левом концевом районе вирусного генома.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан самокомплементарный аденоассоциированный вирусный вектор для лечения нарушений двигательных нейронов, таких как спинальная мышечная атрофия, боковой амиотрофический склероз, спинобульбарная мышечная атрофия, спиноцеребеллярная атаксия, первичный латеральный склероз и травматическое повреждение спинного мозга.

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Описана самореплицирующаяся молекула РНК.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложены рекомбинантный полипептид гемагглютинин (НА) вируса гриппа для вызова иммунного ответа на вирус гриппа H3N2, молекула нуклеиновой кислоты, его кодирующая, и вектор экспрессии, слитый белок и вирусоподобная частица (VLP), содержащие указанный полипептид НА, и выделенная клетка для выработки и экспрессии указанной VLP, а также композиция, содержащая указанные полипептид, VLP и слитый белок, и способ вызова иммунного ответа в отношении вируса гриппа H3N2.

Изобретение относится к области медицинской вирусологии и касается штамма вируса гриппа. Вакцинный штамм A/17/Нью Йорк/15/5364 (H1N1) pdm09 - реассортант, полученный путем скрещивания «дикого» вируса А/Нью Йорк/61/2015 (H1N1) pdm09 с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - донором аттенуации, безвредным для людей.

Изобретения относятся к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касаются вакцины и способа ее получения. Способ изготовления вакцины включает в себя культивирование вирусного антигена в суспензионной культуре клеток ВНК-21, инактивацию, очистку вирусной суспензии от балластных примесей, концентрирование полученного антигена вируса ящура и соединение с адъювантом.

Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии и сельского хозяйства и касается штамма вируса ядерного полиэдроза. Штамм ХСМ 22-А вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки Helicoverpa armigera Hbn.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению вектора экспрессии, содержащего (а) нуклеотидную последовательность С68 и (б) мультиантигенную конструкцию ДНК, кодирующую иммуногенные полипептиды простатоассоциированных антигенов (РАА), что может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается штамма вируса ящура. Представлен штамм вируса ящура Aphtae epizooticae типа О сем.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к новым иммуногенам на основе перекрывающихся пептидов (OLP), и может быть использовано в медицине для предупреждения или лечения ВИЧ инфекции.

Изобретения относятся к выделению экспрессированных бакуловирусами вирусоподобных частиц (VLP)безоболочечных вирусов из клеток насекомых и касаются способа выделения экспрессированных бакуловирусом VLP цирковируса свиней 2-го типа (PCV2) в клетках насекомых и способа получения экспрессированных бакуловирусами VLP PCV2.

Настоящее изобретение относится к вирусологии и ветеринарии. Предложен штамм “Калмыкия-16” вируса оспы овец семейства Poxviridae рода Capripoxvirus, выделенный от больной овцы во время эпизоотии болезни в Республике Калмыкия и депонированный в Государственной коллекции микроорганизмов Государственного научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии под номером 3160.

Изобретение относится к вирусологии и ветеринарии. Предложен штамм вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота «Волгоградский» семейства Poxviridae, род Capripoxvirus, выделенный из патологического материала от больных коров из Волгоградской области и депонированный в Государственной коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии под №3161.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к генетически модифицированному грызуну, который продуцирует человеческий или гуманизированный белок IL-7. Также раскрыта нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий или гуманизированный белок IL-7, ES-клетка, указанного грызуна, клетка, которая содержит гуманизированный ген IL-7, ткань, которая содержит гуманизированный ген IL-7.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и генной инженерии и касается рекомбинантного штамма вируса африканской чумы свиней. Предложен штамм ΔCongoCD2v вируса африканской чумы свиней с делецией гена EP402R, содержащий репортерный ген EGFP под контролем р72 промотора. Получен заявленный штамм из штамма КК-262 вируса АЧС путем гомологичной рекомбинации и депонирован в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии под №3148. Штамм может быть использован для изучения роли белка CD2v вируса АЧС в репродукции вируса в культурах клеток, в восприимчивых животных, а также его функций в модуляции иммунного ответа. 1 ил., 1 табл., 3 пр.

Наверх