Способ скрининга злокачественных новообразований у человека



Владельцы патента RU 2665965:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр радиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации" (ФГБУ "НМИЦ радиологии" Минздрава России) (RU)

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии и эпигенетике, и предназначено для скрининга злокачественных новообразований у человека. Осуществляют забор периферической крови. Получают образцы суспензии, содержащие лимфоциты. В образцах суспензии определяют частоту нестимулированных лимфоцитов с асинхронной репликацией (ЛАР) гена AURKA. При частоте ЛАР гена AURKA, превышающей 28,0%, подтверждают обнаружение у человека злокачественного новообразования. Изобретение обеспечивает упрощение способа скрининга злокачественных новообразований у человека, сокращение времени исследования и его стоимости. 2 ил., 6 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии и эпигенетике, и касается способа скрининга злокачественных новообразований у человека.

В настоящее время все большую актуальность приобретает диагностика онкологических заболеваний на основе биологических маркеров на уровне клеток, субклеточных структур и генома. Нормальное клеточное деление требует, чтобы геном реплицировался правильно, гарантируя тем самым, что геномная информация в неизмененном виде перешла из одного клеточного поколения в другое. Процесс ДНК репликации является жестко регулируемым и синхронизирован по всему геному. Нарушение времени репликации является важным компонентом в развитии опухоли и ранним эпигенетическим событием при канцерогенезе [Genome Research. 2012; 22(10): 1833-1844, Science. 2017; 355(6331): 1330-1334]. В немногочисленных зарубежных работах показано, что частота лимфоцитов с асинхронной репликацией (ЛАР) изученных генов у онкологических больных достоверно повышена по сравнению со здоровыми лицами [Genes, Chromosomes and Cancer. 1998; 22(3): 225-231, Genes, Chromosomes and Cancer. 2000; 27(3): 270-277, Cancer Genetics and Cytogenetics. 2003; 143(2): 133-139, Neoplasia. 2010; 12(8): 668-674] и увеличивается в процессе малигнизации заболеваний [Experimental Hematology. 2000; 28(2): 156-160, Journal of Cellular Biochemistry. 2013; 114(5): 1074-1083].

В России подобные работы не проводились.

Известен способ выявления рака и риска развития рака, основанный на определении уровня синхронности репликации аллелей генов в клетках, изолированных из жидкостей тела человека («Facile detection of cancer and cancer risk based on level of coordination between alleles» патент US 6803195 B1, 1999 г.).

Недостатком данного способа является применение его только для рака простаты и рака молочной железы.

Известен «Способ диагностики онкологических заболеваний» по патенту RU 2384845, в котором проводят исследование образца, взятого у пациента, на выявление онкологического маркера мРНК гена Т (Brachyury). Онкологическое заболевание диагностируют при обнаружении сильного генспецифического сигнала мРНК гена Т (Brachyury). Недостатком данного способа является отбор материала для анализа непосредственно из различных органов для выявления в них онкологического заболевания.

Известен «Способ дифференциальной диагностики заболеваний онкологического и неонкологического генеза» по патенту RU 2593015. Сущность способа состоит в том, что исследуют электрофоретическую подвижность эритроцитов и при ее снижении менее, чем на 49% от физиологической нормы, диагностируют заболевание неонкологического генеза. При снижении электрофоретической подвижности эритроцитов более чем на 50% от физиологической нормы диагностируют заболевание онкологического генеза, при физиологической норме, равной 1,75±0,04 мкм⋅см/В⋅с.

К недостаткам способа можно отнести диагностику злокачественных новообразований происходящих только из эпителиальных тканей.

Известен «Способ скрининга и мониторинга онкологических заболеваний» по патенту RU 2537263. Он включает забор образца ткани, выделение из образца ткани РНК, синтез кДНК, амплификацию посредством множественной обратной транскрипции полимеразной цепной реакцией с последующим анализом амплифицированных продуктов.

Недостатком способа является сложность интерпретации результатов, а также возможность загрязнения образцов посторонней ДНК и, как результат, ложноположительный ответ.

В качестве прототипа предлагаемого изобретения выбран способ дифференциальной диагностики больных раком простаты, изложенный в статье Cytron S. et al. [Cytron S., Stepnov E., Bounkin I., Mashevich M, Dotan A., Avivi L. Epigenetic analyses in blood cells of men suspected of prostate cancer predict the outcome of biopsy better than serum PSA levels. // Clinical Epigenetics. 2011; 2(2): 383-388. DOI: 10.1007/s 13148-011-0029-3]. Диагностика рака простаты с применением рассматриваемого способа основана на анализе количества стимулированных фитогемагглютининином (ФГА) лимфоцитов периферической крови с асинхронной репликацией генов RB1 и AML1, выявляемых при помощи флуоресцентной in situ гибридизации (FISH). Способ реализуют в следующей последовательности:

1. У каждого пациента берут 5 мл периферической крови, из которой готовят клеточную культуру ФГА-стимулированных лимфоцитов.

2. Культуру инкубируют при +37°С в течение 72 ч, затем проводят гипотонизацию и фиксацию лимфоцитов. Полученную клеточную суспензию хранят при -20°С до приготовления препаратов для флуоресцентной in situ гибридизации (FISH).

3. Используют два коммерческих молекулярных зонда фирмы Vysis (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA) на гены RBI и AML1. In situ гибридизацию и пост-гибридизационную отмывку проводят согласно стандартному протоколу, рекомендованному фирмой-производителем. Готовые предметные стекла хранят при -20°С до момента анализа.

4. Препараты анализируют с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus ВН2, оснащенного тройным линейным фильтром (Chroma Technology, Brattleboro, VT, USA). Для каждого образца анализируют не менее 200 клеток, имеющих 2 отчетливых, хорошо определяемых флуоресцентных сигнала. Анализируемые флуоресцентные сигналы в клетках подразделяют на 2 категории: "S" - единичный сигнал, представляющий собой участок еще нереплицированной ДНК и "D" - двойной сигнал от реплицированного участка ДНК. Таким образом, часть клеток отражает одинаковый статус репликации: клетки с нереплицированными аллелями (SS - клетки) и клетки с реплицированными аллелями (DD - клетки); другая часть клеток отражает асинхронную репликацию - когда в клетке виден один сигнал одинарный, а второй двойной (SD - клетки). Для каждого гена рассчитывают частоту SD клеток, по отношению ко всей клеточной популяции, содержащей два сигнала (общее число SD, SS, и DD клеток). Статистическую достоверность различия между двумя клеточными популяциями определяют с помощью критерия Стьюдента (t-тест (Microsoft Excel)).

Недостатки способа.

1. Зависимость пролиферативной кинетики (митотического индекса и скорости пролиферации) от марки компонентов культуральной среды, времени культивирования и индивидуальных особенностей донора/больного может вносить ошибку в результаты.

2. Материалом для FISH-исследования является 72-часовая культура ФГА-стимулированных лимфоцитов, что увеличивает продолжительность исследования до 6 рабочих дней.

Технический результат предлагаемого решения заключается в создании возможности проведения скрининга злокачественных новообразований у человека, упрощение способа, сокращение времени исследования и его стоимости.

Сущность способа, включает забор периферической крови, получение образцов суспензий содержащих нестимулированные лимфоциты и анализ в них асинхронной репликации гена AURKA с помощью флуоресцентной in situ гибридизации - FISH. Если частота лимфоцитов с асинхронной репликацией - ЛАР гена AURKA превышает 28,0%, то это свидетельствует о наличии у человека злокачественного новообразования.

Перечень фигур.

Фиг. 1. Лимфоцит с нереплицированными аллелями гена AURKA: 1 - ядро клетки, 2 - флуоресцентные сигналы, показывающие нереплицированные аллели гена;

Фиг. 2. Лимфоцит с асинхронно реплицированными (ЛАР) аллелями гена AURKA: 1 - ядро клетки, 2 - флуоресцентный сигнал, показывающий нереплицированный аллель гена; 3 - флуоресцентный сигнал, показывающий реплицированный аллель гена.

Порядок реализации способа.

1. Образцы венозной крови (3 мл) забирают при помощи вакуумной системы, содержащей Li-гепарин в концентрации 12-30 ME на 1 мл крови. В центрифужную пробирку переносят 1 мл цельной крови, добавляют 9 мл теплого(+37°С) гипотонического раствора KCl (550 мг/110 мл) и помещают в термостат (+37°С) на 30 мин. После окончания гипотонизации пробирки центрифугируют (1000 об/мин) в течение 10 минут. Затем удаляют супернатант, оставив в пробирке около 0,3-0,5 мл. Осадок ресуспендируют и заливают (до 10 мл) свежеприготовленным фиксатором Карноя (3 части метанола и 1 часть ледяной уксусной кислоты), непрерывно перемешивая на шейкере. Далее центрифугируют (1000 об/мин) в течение 15 минут. Смену фиксатора с последующим центрифугированием и удалением супернатанта до 0,5 мл производят трижды. Пробирку с суспензией клеток в последнем фиксаторе заклеивают парафилмом и помещают в морозильную камеру (-20°С) для хранения и/или дальнейшего использования. Перед приготовлением препаратов пробирку вынимают из морозильной камеры, хорошо встряхивают и центрифугируют (1000 об/мин) 10 минут. Затем удаляют супернатант, оставив 0,3-0,5 мл, и непрерывно перемешивая на шейкере добавляют 2-9 капель свежеприготовленного фиксатора Карноя. Клеточную суспензию раскапывают по 15-30 мкл на охлажденные в морозильной камере (-20°С), предварительно очищенные предметные стекла на теплом термостолике (+30°С). Готовые препараты помещают в термостат (+37°С) на ночь для досушивания. На следующий день на предметное стекло наносят 100-150 мкл раствора РНК-азы (10 мкл раствора RNAse (10 мг/мл), 100 мкл 20×SSC (стандартный цитратный буфер) (рН 5.3) и 890 мкл бидистиллированной воды), закрывают покровным стеклом (22×50 мм) и, поместив во влажную камеру, убирают на 60 мин в термостат (+37°С). Затем стряхивают покровное стекло и отмывают препарат при комнатной температуре в фосфатном буфере (PBS) (рН 7.0-7.2) в течение 5 мин, далее - в растворе пепсина (85 мкл 37% (12N) HCl, 50 мкл рабочего 10% раствора пепсина, доведенного до 100 мл дистиллированной водой) в течение 12 мин на водяной бане при +37°С. Переносят препарат в стакан с PBS (рН 7.0-7.2) комнатной температуры на 5 мин. Далее отмывают в растворе MgCl2 (5 мл 1М MgCl2, 3 мл 37% формальдегида, доведенные до 100 мл PBS (рН 7.0-7.2)) при комнатной температуре в течение 10 мин. После чего отмывают в PBS (рН 7.0-7.2) 5 мин. Затем проводят дегидратацию препарата в серии спиртов (этанол) разной концентрации (70%, 85% и 96%) по 3 мин в каждом.

2. Препарат высушивают при комнатной температуре и используют коммерческий молекулярный зонд на ген AURKA согласно протоколу фирмы-производителя (Kreatech, Нидерланды).

3. Анализ препаратов проводят на флуоресцентном микроскопе Axiolmager А-2 (Carl Zeiss, Германия) с набором фильтров DAPI, Orange/Green, Gold (Vysis, США). Для каждого образца анализируют не менее 300 клеток, имеющих отчетливые хорошо определяемые флуоресцентные сигналы. Анализируемые флуоресцентные сигналы в клетках (фиг 1, фиг. 2) подразделяют на 2 категории: "S" - единичный сигнал, представляющий собой участок еще нереплицированной ДНК (фиг. 1 п. 2, фиг.2 п. 2) и "D" - двойной сигнал от реплицированного участка ДНК (фиг 2 п. 3). Таким образом, одна часть клеток имеет нереплицированные аллели гена AURKA (фиг. 1), другая часть клеток отражает асинхронную репликацию аллелей гена AURKA - когда в клетке виден один сигнал одинарный, а второй двойной (фиг. 2). Статистическую достоверность различия между двумя клеточными популяциями определяют с помощью критерия Стьюдента.

Примеры конкретного применения.

Пример №1. Больной А. 1941 год рождения. Находился на лечении в отделении лучевого и хирургического лечения заболеваний абдоминальной области с диагнозом первично-множественный метахронный рак: рак прямой кишки cT2N0M0 IB, рак желудка pT3N0M0 IIA. Образец периферической крови взят перед операцией по поводу второй опухоли. Проведен анализ частоты ЛАР гена AURKA до начала лечения. Частота ЛАР гена AURKA составила 38,3%, что свидетельствует о наличии у него злокачественного новообразования.

Пример №2. Больная Б. 1968 года рождения. Находилась на лечении в отделении лучевого и хирургического лечения заболеваний абдоминальной области с диагнозом рак желудка cT4aN0M0. Образец периферической крови взят перед диагностической лапароскопией. Проведен анализ частоты ЛАР гена AURKA до начала лечения. Частота ЛАР гена AURKA составила 34,3%, что свидетельствует о наличии у нее злокачественного новообразования.

Пример №3. Больной В. 1961 года рождения. Находился на лечении в отделении лучевой и лекарственной терапии гемобластозов с диагнозом хронический лимфоцитарный лейкоз, подтвержденный имммунофенотипированием лимфоцитов. Образец периферической крови взят при постановке диагноза. Проведен анализ частоты ЛАР гена AURKA до начала лечения. Частота ЛАР гена AURKA составила 47,7%, что свидетельствует о наличии у него злокачественного новообразования.

Пример №4. Больной Д. 1948 года рождения. Находился в отделении лучевого и хирургического лечения заболеваний абдоминальной области с диагнозом рак желудка T4N0M0. Впоследствии, по результатам морфологического исследования операционного материала диагноз был пересмотрен: язва желудка. Образец периферической крови взят перед операцией. Проведен анализ частоты ЛАР гена AURKA до начала лечения. Частота ЛАР гена AURKA составила 26%, что свидетельствует об отсутствии у него злокачественного новообразования.

Пример №5. Больная Г. 1986 года рождения. Находилась на лечении в отделении лучевого и хирургического лечения заболеваний абдоминальной области с диагнозом желчекаменная болезнь: хронический калькулезный холецистит. Образец периферической крови взят перед операцией. Проведен анализ частоты ЛАР гена AURKA до начала лечения. Частота ЛАР теш. AURKA составила 21,2%, что свидетельствует об отсутствии у нее злокачественного новообразования.

Пример №6. Донор Е. 1977 года рождения. Клинически здоров. Проведен анализ частоты ЛАР гена AURKA. Частота ЛАР гена AURKA составила 13,9%, что свидетельствует об отсутствии у него злокачественного новообразования.

Подтверждение достижения технического результата.

Всего обследовано 220 человек. В первую группу - 188 человек были включены больные хроническим лимфоцитарным лейкозом, больные лимфомой Ходжкина, больные раком желудка и больные с первично-множественными злокачественными новообразованиями различных локализаций (молочная железа, предстательная железа, щитовидная железа, легкие, желудочно-кишечный тракт, гортань, мочевой пузырь, почки, матка). Во вторую группу вошло 32 человека без злокачественных новообразований.

Среднегрупповые частоты ЛАР теш. AURKA составили 20,6±0,7% в группе лиц без злокачественных новообразований и 36,4±0,4% в группе онкологических больных. Проведенный анализ показал, что у 95% онкологических больных частота ЛАР превышала верхнюю границу 95% доверительного интервала 27,9% для группы лиц без злокачественных новообразований. Таким образом, чувствительность предлагаемого способа составила 95%., специфичность - 100%.

Предлагаемое изобретение обеспечивает при использовании следующий технический эффект:

- возможность проведения скрининг-диагностики злокачественных новообразований;

- по сравнению с прототипом предложенное изобретение снижает в 2 раза время для осуществления диагностического исследования и его трудоемкость;

- устраняет зависимость результата анализа от условий культивирования лимфоцитов;

- снижает в 4 раза экономические затраты на проведение исследования, так как для осуществления его по прототипу требуется наличие дополнительных реактивов и больший расход дорогостоящих ДНК-зондов;

- обеспечивает высокую чувствительность исследования - 95% и специфичность - 100%;

Статистическую обработку данных проводят с помощью стандартных методов статистического анализа с использованием компьютерной программы Microsoft Excel (2007). Оценку достоверности различий между двумя клеточными популяциями проводят по t-критерию. При сравнении межгрупповых показателей используют критерий Хи-квадрат.- Различия считаются статистически достоверными при t≥1,96 и χ2≥3,84, что соответствует р<0,05.

Способ скрининга злокачественных новообразований у человека, включающий забор периферической крови, получение образцов суспензии, содержащих лимфоциты, использование флуоресцентной in situ гибридизации, отличающийся тем, что в образцах суспензии определяют частоту нестимулированных лимфоцитов с асинхронной репликацией (ЛАР) гена AURKA и при частоте ЛАР гена AURKA, превышающей 28,0%, подтверждают обнаружение у человека злокачественного новообразования.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, в частности к онкоурологии, и касается прогнозирования клинического статуса рака предстательной железы. Для этого проводят определение в сыворотке крови больного до начала лечения уровней общего простатического антигена (общПСА) с калибровкой Hybritech.
Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и предназначено для прогноза рака молочной железы с использованием цифрового изображения гистологического препарата, приготовленного из образца опухолевой ткани.
Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и предназначено для прогноза рака молочной железы с использованием цифрового изображения гистологического препарата, приготовленного из образца опухолевой ткани.

Предложенная группа изобретений относится к области фармакогеномики. Предложены способы и набор для прогнозирования чувствительности пациента со злокачественным новообразованием к лечению ингибитором Wnt посредством измерения дифференциальной экспрессии биомаркера Notch1 в образце злокачественного новообразования.

Изобретение относится к иммунологии. Предложено антитело и его антигенсвязывающий фрагмент против эпитопа, расположенного в С-концевой части клаудина 18.2 (CLDN18.2).
Изобретение относится к области медицины, а именно к области онкологии, и касается способов прогнозирования риска возникновения лимфогенного метастазирования при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы Способ прогнозирования лимфогенного метастазирования включает оценку инфильтративного компонента ткани опухоли, где выделяют наличие разных типов структур от 1 до 5, среди которых - альвеолярные, тубулярные, трабекулярные, солидные структуры и дискретные группы опухолевых клеток, далее в альвеолярных, тубулярных, трабекулярных и солидных структурах инфильтративного компонента опухоли определяют наличие краудинга, проводят оценку рецепторного статуса и экспрессии маркеров инвазивного клеточного роста Snail, интегрина β1 и интегрина β3, а также определяют наличие участков фокального отсутствия экспрессии РЭ, РП и Ki67 по периферии разных типов структур инфильтративного компонента.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и предназначено для прогнозирования пятилетней безметастатической выживаемости у больных раком молочной железы.

Группа изобретений относится к биотехнологии и медицине. Предложены способы прогнозирования ответа субъекта-человека, страдающего, предположительно страдающего раком эндометрия, или с риском развития рака эндометрия, на терапию, включающую ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль (варианты).

Группа изобретений относится к биотехнологии и медицине. Предложены способы прогнозирования ответа субъекта-человека, страдающего, предположительно страдающего раком эндометрия, или с риском развития рака эндометрия, на терапию, включающую ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль (варианты).

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для прогнозирования чувствительности опухоли к неоадьювантной химиотерапии при люминальном В молекулярно-генетическом типе рака молочной железы.

Предложенная группа изобретений относится к области молекулярной биологии и медицины. Предложены способ и набор для специфической идентификации по меньшей мере одной последовательности ДНК в образце путем проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающие одну пару праймеров, специфичных для этой последовательности ДНК, и пару зондов, в которой один представляет собой олигонуклеотидный мишень-специфичный зонд, имеющий 3'-сегмент, комплементарный идентифицируемому участку последовательности ДНК и содержащий метку, и 5'-сегмент, некомплементарный идентифицируемой последовательности ДНК и содержащий метку, а другой - олигонуклеотидный сигнальный зонд, комплементарный 5'-сегменту мишень-специфичного зонда и содержащий метку.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для диагностики мутантного аллеля, вызывающего короткий позвоночник или брахиспину у крупного рогатого скота.

Изобретение относится к области биологии и экспериментальной медицины. Предложен способ оценки фармакологических и токсических свойств веществ - потенциальных лигандов AHR человека - с использованием линии мух Drosophila melanogaster.
Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены способ и тестовый набор для определения предрасположенности пациента к тяжелому периодонтальному заболеванию и/или к высокому риску прогрессирования периодонтального заболевания.

Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования риска развития инсульта у мужчин русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья.

Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования риска развития эссенциальной гипертензии у женщин. Проводят анализ полиморфизмов генов матриксных металлопротеиназ ММP-1 и ММP-3 и прогнозируют высокий риск развития эссенциальной гипертензии у женщин при выявлении сочетания генотипа 1G/1G по локусу rs1799750 ММP-1 и генотипа 6A/6А по локусу rs3025058 ММP-3.

Изобретение относится к биотехнологии. Описаны композиции и способы для определения находящихся в системе кровообращения биомолекул до, во время и/или после лечения пациента противораковым или противоопухолевым лекарственным препаратом (или предполагаемым лекарственным препаратом).

Изобретение относится к области медицины и предназначено для идентификации генетических маркеров поздней формы болезни Паркинсона. Осуществляют подготовку образцов ДНК из взятого у пациентов с болезнью Паркинсона биологического материала.

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к определению прогноза развития септического синдрома у пациента, и может быть использовано в медицине. Получают биологический образец, выбранный из образца крови, сыворотки, слюны, ткани или циркулирующих клеток пациента, и экстрагируют биологический материал: нуклеиновую кислоту или белок из биологического образца.

Предложенная группа изобретений относится к области фармакогеномики. Предложены способы и набор для прогнозирования чувствительности пациента со злокачественным новообразованием к лечению ингибитором Wnt посредством измерения дифференциальной экспрессии биомаркера Notch1 в образце злокачественного новообразования.

Изобретение относится к клинической микробиологии. Предложен способ оценки эффективности конъюгативного переноса в полимикробных сообществах.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии и эпигенетике, и предназначено для скрининга злокачественных новообразований у человека. Осуществляют забор периферической крови. Получают образцы суспензии, содержащие лимфоциты. В образцах суспензии определяют частоту нестимулированных лимфоцитов с асинхронной репликацией гена AURKA. При частоте ЛАР гена AURKA, превышающей 28,0, подтверждают обнаружение у человека злокачественного новообразования. Изобретение обеспечивает упрощение способа скрининга злокачественных новообразований у человека, сокращение времени исследования и его стоимости. 2 ил., 6 пр.

Наверх