Способ флуоресцентной идентификации амилоида

Изобретение относится к медицине, а именно к области диагностики амилоидозов при помощи окрашивания гистологических образцов, и может быть использовано в патологической анатомии, цитологии, клинической лабораторной диагностике и биологии. Способ флуоресцентной идентификации амилоида для диагностики амилоидозов основан на применении для окрашивания препаратов динатриевой соли 2,7-(1-амино-4-сульфо-2-нафтилазо)флуорена. Способ не требует исключительно высокой квалификации персонала, обладает высокой степенью специфичности и обеспечивает низкую вероятность ложноположительных и ложноотрицательных результатов за счет практически полного исключения фоновой окраски тканей. 2 ил., 2 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к области диагностики амилоидозов при помощи окрашивания гистологических образцов, и может быть использовано в патологической анатомии, цитологии, клинической лабораторной диагностике и биологии.

В настоящее время описано 36 системных и локальных амилоидозов, включая болезнь Альцгеймера и осложнения диабета 2 типа [Sipe J.D. 2016]. Диагностика и дифференциальная диагностика амилоидозов являются весьма актуальными для современного здравоохранения.

Известен способ гистохимического выявления амилоида при помощи Конго красного (золотой стандарт идентификации амилоида) [Bennhold Н., 1922, Гусельникова В.В., 2016, Коржевский Д.Э., 2007, Коржевский Д.Э., 2013]. Несмотря на широкое использование данного способа, он не лишен недостатков, связанных с необходимостью высокой квалификации специалистов-морфологов, частым ложным окрашиванием фона и неамилоидных белковых агрегатов, в частности окрашиванием фиброзных структур.

Предложены также флуоресцентные красители - тиофлавины [Biancalanaa М., 2010] и олиготиофены [ 2015]. Однако эти красители, хотя и обладают достаточно высокой чувствительностью, менее специфичны и чаще, чем Конго красный, приводят к ложноположительным и ложноотрицательным результатам.

Окраска образцов тканей Конго красным, тиофлавинами [Koidec S. 2010] и олиготиофенами [ 2015] включает:

1) Фиксацию биологического материала в растворах формалина или других фиксирующих жидкостях;

2) Обезвоживание фиксированных объектов с помощью этанола;

3) Замещение этанола ксилолом или другим растворителем парафина;

4) Заливку объектов в парафин или комбинированные парафиновые среды;

5) Изготовление срезов и их наклейку на предметные стекла;

6) Удаление парафина (ксилолом или его заменителем) и регидратацию срезов;

7) Окраску препаратов красителем и заключение в водорастворимую или гидрофобную среды.

При этом отложения амилоида в тканях обнаруживаются благодаря его способности сорбировать Конго красный с характерным окрашиванием и двойным лучепреломлением в поляризованном свете, а также по слабо выраженной флуоресценции. Окрашивание тиофлавинами и олиготиофенами сопровождается образованием флуоресцирующих комплексов.

Задачей настоящего изобретения является разработка чувствительного способа, позволяющего с высокой степенью специфичности выявлять амилоид на гистологических препаратах биопсийного и аутопсийного материала, с целью снижения вероятность ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Способ предполагает использование ультрафиолетовой и конфокальной микроскопии (флуоресцентный анализ) для идентификации амилоида, практически полного исключения фоновой окраски тканей и не требует исключительно высокой квалификации персонала.

Поставленная задача была решена путем применения для выявления амилоидных отложений аналога Конго красного на основе флуорена, представляющего собой динатриевую соль 2,7-(1-амино-4-сульфо-2-нафтилазо)флуорена.

В литературе имеется лишь небольшое число публикаций по получению и изучению свойств данного соединения [Novelli А., 1928, Ashburn Т.Т., 1996, Stopa В., 2003]. Для окрашивания амилоида, данное производное флуорена никогда ранее не применялось. Коммерческого препарата не существует. Поэтому были осуществлены синтез и очистка целевого производного флуорена. В качестве исходных соединений использованы 2,7-диаминофлуорен и нафтионовая кислота. Синтез осуществлен путем диазотирования определенного количества диаминофлуорена путем добавления расчетного количества нитрита натрия в разбавленной соляной кислоте при охлаждении и дальнейшего азосочетания бис-диазониевой соли флуорена с расчетным (двойным молярным избытком) количеством натриевой соли нафтионовой кислоты в условиях образования буферной среды за счет добавления уксуснокислого натрия. Реакция сопровождается образованием интенсивно окрашенного продукта. Синтезированный краситель очищен при помощи осаждения в кислых условиях концентрированным раствором хлорида натрия и последующей хроматографии на порошковой целлюлозе и ВЭЖХ. Синтез целевого соединения подтвержден методом масс-спектрометрии.

Полученное вещество характеризуется максимумом поглощения при рН выше 6,0 в видимой области при 500 нм. Это вещество связывается с модельными фибриллами амилоидогенных белков, что сопровождается изменением спектра поглощения и образованием комплексов краситель-фибриллы. Кроме того, в присутствии фибрилл наблюдается выраженное возрастание интенсивности флуоресценции красителя (возбуждение 470-500 нм, эмиссия 590 нм).

Очищенный краситель (производное флуорена) применен для окраски гистологических препаратов больных амилоидозами.

Срезы окрашивают полученным красителем в следующей последовательности:

1) Удаляют парафин и регидратируют срезы.

2) Промывают срезы в дистиллированной воде (5 мин).

3) Удаляют избыток жидкости со срезов, наносят необходимое количество гематоксилина (например, квасцовый гематоксилин Джилла) [Коржевский Д.Э., 2007.] и инкубируют 1 мин при комнатной температуре.

4) Удаляют раствор гематоксилина со срезов и сполоскивают стекла в щелочной воде (70 мкл 10% водного раствора аммиака на 100 мл дистиллированной воды) в течение 1 мин.

5) Промывают стекла в дистиллированной воде 3 мин.

6) Далее фильтровальной бумагой максимально убирают воду вокруг срезов и наносят краситель - 0,01% водный раствор динатриевой соли 2,7-(1-амино-4-сульфо-2-нафтилазо)флуорена.

7) После этого перемещают препараты во влажную камеру и инкубируют в термостате при температуре 40°C в течение часа.

8) Промывают препараты в дистиллированной воде (10 мин).

9) Максимально удаляют жидкость со срезов и предметного стекла фильтровальной бумагой и наносят на срезы необходимое количество водорастворимой заключающей среды Fluorescent Mounting Medium (Dako, США) или аналогичной водорастворимой среды, после чего заключают срезы под покровное стекло.

Подготовленные препараты анализируются при помощи микроскопии под УФ и конфокальной микроскопии.

Применимость способа иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Амилоидоз сердца.

На фиг. 1 представлена микрофотография окрашенного заявляемым способом среза препарата миокарда, предоставленного лабораторией кардиомиопатий Института сердечно-сосудистых заболеваний при 1 СПбГМУ им. И.П. Павлова. При исследовании с использованием флуоресцентной микроскопии (микроскоп Leica DM2500) на препарате миокарда определяются интенсивно флуоресцирующие в оранжево-красном диапазоне амилоидные массы (отмечены стрелками), распространяющиеся в межмышечных прослойках соединительной ткани и охватывающих узким ободком отдельные кардиомиоциты. Представленная картина характерна для диффузного отложения амилоида в миокарде. Данный вариант амилоидоза был верифицирован иммуногистохимически как AL-амилоидоз.

Пример 2. Амилоидоз слизистых оболочек (наследственный транстиретиновый амилоидоз).

При использовании флуоресцентной микроскопии (микроскоп Leica DM2500) в препарате слизистой оболочки ротовой полости (фиг. 2) определяются очаговые скопления амилоида (отмечены стрелкой), обладающие интенсивной оранжево-красной флуоресценцией. Указанные скопления обнаружены на границе собственной пластинки слизистой оболочки и мышечной ткани. Представленная картина характерна для проявлений системного амилоидоза. Данный вариант амилоидоза был верифицирован результатами молекулярно-генетического анализа как ATTR-амилоидоз (мутация Ala81Val) с выраженными признаками амилоидозной кардиомиопатии.

В двух представленных примерах краситель продемонстрировал выраженную интенсивность флуоресценции в сочетании с высокой селективностью выявления амилоида при полном отсутствии фоновой флуоресценции. Способ позволяет идентифицировать амилоид по интенсивной красной флуоресценции, в значительной степени упростить процедуру окраски, а также повысить чувствительность за счет практически полного исключения фоновой окраски, сопровождающей окрашивание Конго красным.

Литература

1. Ashburn Т.Т., Han Н., VcGuinness В., Lansbury Р.Т. Amyloid probes based on Congo Red distinguish between fibrils comprising different peptides. Chemistry and Biology. 1996, V. 3, N 5, 351-358.

2. Bennhold H. Eine spezifische mit Kongorot. Med. Wschr. 1922, 44, 1537-1538.

3. Biancalanaa M., Koidec S. Molecular mechanism of Thioflavin-T binding to amyloid fibrils // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 2010. Vol. 1804, №7. P. 1405-1412.

4. Novelli A., Ruiz C., New substantive dyes derived from 2,7-diaminofluorene, Ann. Asoc. Quim. Argent., 1928, V. 16, 56-64.

5. Real de Costa R., Filigheddu M.T., Trujillo D., Systemic AA amyloidosis: epidemiology, diagnosis, and management // Clinical Epidemiology. 2014. Vol. 6. P. 369-77.

6. Sipe J.D., Benson M.D., Buxbaum J.N., Ikeda S.-i., Merlini G., Saraiva M.J.M., Westermark P. Amyloid fibril proteins and amyloidosis: chemical identification and clinical classification. International Society of Amyloidosis 2016 Nomenclature Guidelines. Amyloid. The Journal of protein folding disorders. 2016, 23 (4), 209-213.

7. Bijzet J., Hazenberg B.P., Nilsson K.P., Sensitive and rapid assessment of amyloid by oligothiophene fluorescence in subcutaneous fat tissue // Amyloid. 2015. Vol. 22, №1, C. 19-25.

8. Stopa В., Piekarska В., Konieczny L., Rybarska J., Spolnik P., Zemanek G., Roterman I., Krol M. The structure and protein binding of amyloid-specific dye reagents. Acta Biochimica Polonica. 2003, V. 50, N 4, 1213-1227.

9. Гусельникова B.B., Кирик O.B., Федорова E.A., Шавловский М.М,, Гудкова А.Я., Коржевский Д.Э. Быстрый способ окраски амилоида Конго красным для световой и флюоресцентной микроскопии // Морфология, 2016, Т. 149, вып. 2. С. 84-88.

10. Коржевский Д.Э. Применение гематоксилина в гистологической технике // Морфология, 2007, Т. 132, вып. 6. С. 77-82.

11. Коржевский Д.Э., Сухорукова Е.Г. Морфологическая диагностика. Гистохимические методы окрашивания гистологических препаратов. СПб.: СпецЛит, 2013.

Способ флуоресцентной идентификации амилоида для диагностики амилоидозов, заключающийся в окраске амилоидных отложений в тканях, отличающийся тем, что для окраски применяют динатриевую соль 2,7-(1-амино-4-сульфо-2-нафтилазо)флуорена.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии и оториноларингологии, и может быть использовано для отбора пациентов в группу риска по развитию фолликулярной ангины, ассоциированной с недифтерийными коринебактериями.

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмохирургии, и может быть использовано для экспресс-оценки витального красителя для контрастирования внутриглазных структур заднего сегмента глаза.

Группа изобретений относится к области органической и аналитической химии, а именно к реагенту для обнаружения катионов Zn2+, представляющему собой 2-(1-(пиридин-2-ил)4-фенил-изохинолин-3-ил)-25,26,27,28-тетраметоксикаликс[4]арен, а также к способу его получения, включающему проведение реакции аза-Дильса-Альдера при температуре 105-110°С в атмосфере инертного газа 2-(6-фенил-3-(2-пиридин-2-ил)-1,2,4-триазин-5-ил)-25,26,27,28-тетраметоксикаликс[4]арена с 1,2-дегидробензолом, который генерируется in situ путем взаимодействия антраниловой кислоты с изоамилнитритом: .Группа изобретений обеспечивает повышение эффективности обнаружения и/или супрамолекулярной экстракции катионов Zn2+, а также расширение арсенала способов получения реагентов для обнаружения и/или супрамолекулярной экстракции катионов Zn2+.

Группа изобретений относится к области органической и аналитической химии, а именно к реагенту для обнаружения катионов Zn2+ и Сd2+ в виде 2-(5-фенил-2,2'-бипиридин-6-ил)-25,26,27,28-тетраметоксикаликс[4]арена, а также к способу его получения, включающему проведение реакции аза-Дильса-Альдера между 2-(6-фенил-3-(2-пиридил)-1,2,4-триазин-5-ил)-25,26,27,28-тетраметоксикаликс[4]ареном и 2,5-норборнадиеном при температуре 130-150°C и в атмосфере инертного газа: .Группа изобретений обеспечивает повышение эффективности обнаружения и/или супрамолекулярной экстракции катионов Zn2+ и Сd2+, а также расширение арсенала способов получения реагентов для обнаружения и/или супрамолекулярной экстракции катионов Zn2+ и Сd2+.

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, а именно способу получения и аттестации стандартного образца гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита.

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, а именно способу получения и аттестации стандартного образца гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита.

Изобретение относится к медицине и касается способа оценки агрегационной способности эритроцитов. Способ включает выделение эритроцитов из крови и регистрацию их агрегационной способности, где в качестве индуктора агрегации используют трихлорид железа, при этом эритроциты помещают в кювету агрегометра, добавляют трихлорид железа в финальной концентрации 200-400 мкМ и регистрируют степень агрегации фотометрическим методом.

Изобретение относится к области медицины, а именно к профилактической медицине. Способ прогнозирования значений относительной концентрации гамма-глутамилтрансферазы в сыворотке крови через 4-5 лет у стажированных работающих в условиях экспозиции винилхлоридом без признаков патологии заключается в том, что определяют уровень гамма-глутамилтрансферазы, альбумина и относительного содержания липопротеидов высокой плотности, рассчитывают прогнозируемое значение относительного содержания концентрации гамма-глутамилтрансферазы в сыворотке крови по формуле: У=620,9241+0,5718×ГГТ1-16,832×АЛЬБ1-05181×ЛПВП1+0,1195×АЛЬБ12, где У - прогнозируемое значение относительной концентрации ГГТ в сыворотке крови, 620,9241 - константа; 0,5718; -16,832; -0,5181; 0,1195 - коэффициенты предикторов; ГГТ1 - уровень гамма-глутамилтрансферазы на момент обследования (Е/мл); АЛЬБ1 - содержание альбумина в сыворотке крови на момент обследования (%), ЛПВП1 - содержание липопротеидов высокой плотности в сыворотке крови на момент обследования (%).

Группа изобретений относится к области медицины и медицинской техники. Офтальмологическое устройство содержит: источник энергии; источник света; биомаркерный датчик, выполненный с возможностью обнаруживать изменения в биомолекулах слезной жидкости и генерировать сигналы; а также процессор, находящийся в логической связи с биомаркерным датчиком, выполненный с возможностью получения и обработки данных сигналов и преобразования их в выходные данные.
Изобретение относится к лабораторной диагностике, в частности к способам определения контактного пути коагуляции плазмы крови человека. Скрининг-тест определения контактного пути коагуляции включает смешивание цитратной плазмы крови с хлоридом кальция и последующую фотометрическую регистрацию свертывания.

Изобретение относится к экологии и может быть использовано при комплексном определении экологической безопасности и биологической эффективности почвогрунтов, создаваемых на основе осадка городских сточных вод в полевых условиях.

Группа изобретений относится к протеомике, а именно способу качественного и количественного определения протеотипического пептида AFG3-подобного белка-2 человека (идентификатор Q9Y4W6 в базе данных UniProt) в сложных биологических образцах.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены способ и набор для диагностики молекулярного фенотипа больных, страдающих заболеванием, сопровождающимся хроническими воспалениями, с отнесением их к подгруппам «Th2-высокая», «Th2-низкая», «Th1-высокая» или «Th1-низкая».

Изобретение относится к области анализа состава жидкостей, а именно к способам, обеспечивающим надежное, безопасное и ускоренное определение присутствия в растворах различных веществ в растворенном состоянии, и может применяться для экспресс-тестирования спиртосодержащих продуктов и питьевой бутилированной воды на наличие примесей, в том числе вредных, а также других жидких пищевых продуктов, кроме того, жидких фармакологических, косметических средств, жидкого топлива, масел.

Изобретение относится к медицине и касается микрофлюидного устройства для исследования влияния химических веществ на клетки млекопитающих, представляющего собой чип с размещенной в нем микрофлюидной системой.

Изобретение относится к прикладной гидробиологии, а именно к физиологии гидробионтов, и может быть использовано для экспресс-оценки общего уровня загрязненности акватории в естественной среде, в эксперименте и при культивировании.

Изобретение относится к определению количества оксоанионов в водных растворах. Способ и система для определения концентрации оксоаниона в водном растворе включает источник водного раствора с неизвестной концентрацией оксоаниона; источник алюминийсодержащего реагента, выполненный с возможностью подачи алюминийсодержащего реагента в водный раствор, с образованием раствора для оптического анализа; оптический датчик, включающий излучатель, выполненный с возможностью направлять свет в раствор для оптического анализа; детектор, выполненный с возможностью обнаружения света, прошедшего через раствор для оптического анализа, и обеспечения оптического отклика, и контроллер, выполненный с возможностью определения концентрации оксоаниона в водном растворе, имеющем неизвестную концентрацию оксоаниона, на основе оптического отклика раствора для оптического анализа.

Изобретение относится к области медицины, в частности к гинекологии. Предложен способ центильной оценки микроценоза слизистой влагалища у девочек путем отбора биоматериала со слизистой боковой стенки влагалища за физиологическим отверстием девственной плевы соскобом одноразовым урогенитальным зондом.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ преимплантационной генетической диагностики спинальной мышечной атрофии, предусматривающий определение делеции 7 экзона гена SMN1, где проводят прямую диагностику с использованием ПЦР-ПДРФ, и косвенную диагностику со специфическими праймерами для анализа наследования молекулярно-генетических маркеров, сцепленных с мутацией.

Изобретение относится к биотехнологии. В частности, настоящее изобретение относится к новым бактериофагам F1245/05, F168/08, F170/08, F770/05, F197/08, F86/06, F87s/06 и F91a/06, выделенным из них полипептидам, композициям, включающим один или несколько новых бактериофагов и/или выделенных полипептидов, способу лечения или профилактики бактериальных инфекций, относящихся к Acinetobacter baumannii.

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к количественному или тест-определению тетрациклина и доксициклина в молоке и молочных продуктах. Для тест-определения из образцов предварительно удаляют белок и молочный жир. Затем антибиотики концентририруют на поверхности химически модифицированного Fe(III) алюмосиликата с образованием окрашенного комплекса. Определение тетрациклина и доксициклина проводят визуально, сравнивая окраску материала в сорбционном патроне с заранее построенной колориметрической тест-шкалой. Для количественного определения тетрациклина и доксициклина проводят определение тетрациклина и доксициклина методом цветометрии с помощью цифрового фотодетектирования по градуировочной зависимости зеленой компоненты цвета от концентрации антибиотика. Изобретение обеспечивает проведение предварительного скрининга проб молока и молочных продуктов в практике лабораторий. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к области диагностики амилоидозов при помощи окрашивания гистологических образцов, и может быть использовано в патологической анатомии, цитологии, клинической лабораторной диагностике и биологии. Способ флуоресцентной идентификации амилоида для диагностики амилоидозов основан на применении для окрашивания препаратов динатриевой соли 2,7-флуорена. Способ не требует исключительно высокой квалификации персонала, обладает высокой степенью специфичности и обеспечивает низкую вероятность ложноположительных и ложноотрицательных результатов за счет практически полного исключения фоновой окраски тканей. 2 ил., 2 пр.

Наверх