Способ получения препаратов иммобилизованных ферментов
ибниот
Союз Советских
Социалистических
Республик (»)522189 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 14.10,74 (21) 207183Э/04 с присоединением эаявки №
С 07 & 7/02 (23) Приоритет
Гооударстеениый комитет
Совета Мииистров СССР по делам изооретений и открытий (53) УДК 577.15.04, . 002.237:66 (088.8) (43) Опубликовано25.07.76.Бюллетень №27 (45) Дата опубликования описания,06.09.76 (72) Авторы иэобретения
Е. E. Браудо и В. Б. Толстогузов (71) Заявитель Институт элементоорганических соединений АН СССР (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ HPEHAPATGB
ИММОБИЛИЗОВАННБ1Х ФЕРМЕНТОВ
Изобретение относится к способам получения препаратов иммобилизованных ферментов для использования их в промышленных условиях. Предлагаемый способ получения препаратов может обеспечить более эффективное по сравнению с ранее описанными способами использование в промышленных установках ферментов, иммобилизованных в гелях, поскольку лри употреблении препаратов, полученных предлагаемым |способом, в )О о реакционных колоннах возникает псевдоожиженное состояние, что приводит к уменьшению гидродинамического сопротивления.
Зги препараты могут найти применение в химическом производстве, s частности ле- 15 карственных препаратов, а также в пищевой промышленности.
Известны различные способы иммобилизации ферментов путем включения их в гелевые матрицы. 20
Наиболее эффективный способ осуществления крупномасштабных процессов заключается в проведении химической реакции в псевдоожиженном (фпюиднзированном) слое. Однако до настоящего времени вопрос об ис- 25 пользовании препаратов иммобилизованных
;ферментов в псевдоожиженном слое не ста вился. При ранее известных способах иммо-! ,билизации ферментов в гелях применение таких препаратов в псевдоожйженном .слое .бы ло принципиально невозможно из-за ничтож» ной разности плотностей между препаратами .иммобилизованных ферментов и реакционной смесью. Предлагаемый способ позволяет па лучать препарат иммобилизованных ферментов с заданным значением удельного веса.
Задача регулирования удельного веса препаратов иммобилизованных ферментов ранее в научно-технической или патентной литературе ,не ставилась. Необходимо отметить, что уже
1 известен способ модификации свойств препа1
;ратов иммобилизованных на целлюлозе фер:ментов путем введения в них суспензии фер,ромагнитных частиц.
Однако эта операция преследует узкую цель и проводится для осуществления магнитной сепара4ни частиц катализатора, уносимых потсжом реакционной смеси.
Метод достаточно сложен н нв обладает необходимой универсальностью.
522189
Предлагается способ получения препаратов им мобилизованных ферме н тов введение м фермента в раствор гелеобразуюших веществ с последующим переводом Раствора в гель, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности препаратов путем использования их в псевдоожиженном слое, в раствор гелеобразующих веществ вводят мелкодисперсный инертный наполнитель. г-Для получения препаратов иммобнлизованных ферментов с заданным значением удельного веса в качестве наполнителя применяют химически инертные твердые веществ; з ва с уд. в. 2т4-11,3 г/см . Такими матеРиалами могут быть индивидуалные окисц 36 металлов и неметаллов, например ЪпО,СзЯ, М О.,Т1О,, Ь1О, измельченные химически инертные силикатные материалы, напри мер доменный шлак, стекло, а также металлы в мелкодисперсном состоянии, .например Е стальные опилки, порошкообраэные циик и свинец, Йля предотвращения взаимодействия металла с ферментом или окружающей средой предлагается наносить на металлические час; типы тонкие слои полимерных покрытий.
Объемная доля наполнителя s препарате иммобилизованного фермента может составлять 0,08-Q,6, предпочтительно 0,08-0,4.
Значение объемной доли наполнителя, гречуемое для достижения заданного значения удельного веса препарата, может быть рас- считано по формула ч P — о где Х - объемная доля наполнителя; ч
P — удельный вес наполнителя;
p - удельный вес наполненного геля;
p - удельный sec ненаполненного геля, т
Последняя величина принимается равной
1 г/см .
Значение удельного веса препарата иммобилиэованного фермента, необходимое для, осуществления состояния псевдоожижения, ! может быть рассчигано по формуле
Ат
Be— у 4ОО+ 5.аа Й где ь
Г -Рж
:Re Ах.
Ж
69
В этих формулах
Ю вЂ” скорость движения твердой частицы относительно среды;
d - диаметр частицы;; у - кииематяческая вязкость среды; йк
g - ускорение силы тяжести;
P - удельный еес частицьц р - удельный вес среды.
Т
Предлагаемый способ дает возможность регулировать удельный sec (плотность) пре- у паратов ферментов, иммобилизованных в гелях, в интервале 1,8-7,2 г/см, что позвоз ляет использовать иммобилиэованные ферменты в качестве катализаторов реакций, прсьтекающих в псевдоожиженном слое. Преимущества процессов, протекающих в псевдоожиженном слое, по сравнению с процессами, основанными на использовании стационарного слоя катализатора, заключаются в повышении эффективности использования препаратов ферментов, а именно в более высокой скорости тепло- и массообмена, в меньшем расходе энергии, а также в более эффективном и равномерном исцользовании всего объема юактора, так как псевдоожижеиие позволяет устранить недостатки, связанныт» с уплотнением слоя катализатора.
Пример 1. Готовят препарат гшоко зоксидазна иммябипизованкой в полиакрил жиидном геле. Для этогО О 7 г метилен
-бис-акриламида растворяют в 50 мл воды, в этот раствор виасят 3,5 г акриламида и после его полного растворения 1 мг глюка;эоксидазы. Иля повншеиия удельного веса прейарта иммобилизоваииой глкжозоксидазы до 1,8 г/см к исходной смеси добавляют
Ъ
547 г:порошкообразной окиси цинка (уд.s.
5,6 г/см ), что соответствует объемной доле наполнителя, равной 0,17. Затем в исход .
Ф иую смесь вводят 0,025 мл тетраэтилме-, тилендиамина и 0,25 мл 10%-ного водного раствора персульфата аммония. После этого оставляют смесь на 2 час. 8 резуль тате сополимериэации акриламида и межлек-бис-акриламида образуется гель, содержажий фермент (глюкозоксидазу) и наполнитель (окись цинка). Препарат имеет уд.в, 1,8г/см.
"и ° л"
Аналогично готовят препарат иммобили-зованной глюкозоксидазы, не содержащий наполнителя. Сравнивают ферментативную активность обоих препаратов, измеряя начальную скорость реакций окисления глюкозы методом рН-с гатирования. Сущность метода заключается в регистрации количества едкого натра, пошедшего на титрование глюконо вой кислоты, образующейся в результате гидролиза глюконолак тона, продукта реакции окисления глюкозы, катализируемой глюкозоксидаэой.
Реакцию проводят при 22 С и рН 5 7, при перемешивании в присутствии 0,1 н. хлористого натрия, отношение фермент:субстрат
1:1000.
Активность обоих препаратов была одинаковой. и составляла 55о от активности не иммобилизованной глюкозоксидазы. Следовательно, присутствие наполнителя (окиси цинка) не оказывает влияния на ферментативную активность глюкозоксидазы, 522189
Пример 2. Готовя r препарат глюкоэоксидазы, иммобилизованной в полиакриламидном геле, как описано s rпrрprиIмMеeрpе e 11, но вместо окиси цинка в исходный раствор вводят измельченный до порошкообразного состояния - 5 доменный шлак (уд.в. 2,8 г/см ) в количестве 110 г, что соответствует объемной доле ,0,44. Получают препарат с уд.в, 1,3 г/см .
Пример 3. Готовят препарат глюкс зоксидазы, иммобилизованной в полиакрил амидном геле, как описано в примере 1, Но вместо окиси цинка в исходный раствор вводят. окись хрома (уд.в, 5,2 г/см ) в коли,честве 159 г, что соответствует объемной
;доле 0,35. Получают препарат.суд.в. 2,0г/с б
Активность препарата составляет 45% от активности неиммобили зованной глюкозоксидазы, Пример 4. Готовят препарат глюкозоксидазы, иммобилизованной в полиакрил- 26 амидном геле, как описано в примере 1, но вместо окиси цинка в исходный раствор вводят стальные опилки (уд.в. 7,8 г/см ) в ъ количестве 306 г, что соответствует объ емкой доле 0,4 4. Получают препарат с Я уд.в. 4,0 г/см .
Пример 5. Готовят препарат глюко;зоксидазы, иммобилизованной в полиакриламидном геле, квк описано в примере 4, но
:,стальные опилки предварительно обрабаты- 39 вают препаратом "виникс", представляющим собой раствор поливинилхлорида в хлорофор ме, после чего стальные опилки подвергают распылительной сушке. Обработка стальных опилок, заключается в их перемешивании в д препарате "виникс" в течение 10 мин при комнатной температуре. В результате обработки и последующей расцылительной сушки стальные опилки покрываются тонким слоем поливинилхлор ида. 49
Пример 6. Готовят препарат глюкозоксидазы, иммобилизованной в полиакрил.амидном геле, квк описано в примере 1, но, вместо окиси цинка в исходный раствор вво ят порошкообразный свинец (уд.в. 1 1,3гlсм )я ,в количестве 843 г, что соответствует объемной доле 0,60. Получают препарат с уд.в.
7,2 г/см .
Ъ
Пример 7. Готовят препарат с - -химотрицсина, иммобилизованного в комплексноМг 59 геле. Для этого к 20 мл 0,5Ъ-ного водного раствора альгината натрия, содержащего 0,5% -химотрипсинв, прибавляют по каплям и при перемешивании 25 мл 1%-кого водного раствора этилированного аминоэфира поли- 65 метакрилоаой кислоты. рН растворов 8,0, температура 18оС. В результате взаимодействия противоположно заряженных полиэлектролитов (вльгнната натрия и этилированноаминоэфира полиметакрнловой кислоты) образуется комплексный гель, содержащий
-химотрипсин. Для повышения удельного
Ъ весе геля до 1,8 г/см в исходный раствор
;альгината натрия, содержащий - -химотрипсин, вводят при перемешивании 143 г
l порошкообразной двуокиси кремния (уд.в.
Ъ, 2,4 г/см), что соответствует объемной доI ,ле в исходной смеси и в комплексном геле
t равной 0,57. Образовавшийся комплексный ,гель промывают водой и оставляют стоять
<под слоем дистиллированной воды 5 суток.
Полученный препарат иммобилизованного з, О<- -химотрипсина имеет уд.в. 1,8 г/см .
Активность препарата M -химотрипсина арактеризуют по начальной скорости гидроиэа этилового эфира H -ацетил- 1 -гггроина. Скорость реакции определяют методом рН-статирования, регистрируя количество ед, кого натра, пошедшего на титроввние образующегося при гидролизе И -ацетил- Ь—, -тирозина. Реакцию проводят при 25оС и ,рН 8,2 в присутствии 0,1 н. хлористого на трия, Отношение фе рмен r:субс трат 1: 1 000.
Активность иммобилизованного с - -химот рипсина составляет 15% от активности неиммобилиэованного фермента, т.е. равняется ,активности о - химотрипсина, иммобили эованного тем же методом, но в отсутствие наполнителя. Следовательно, присутствие наполнителя не оказывает влияния на активность
I иммобилизованного Ы -химотрипсина.
Пример 8. Готовят препарат а< -химо трипсина„иммобилизованного в комплексном геле, как описано в примере 7, но вместо двуокиси кремния в водный раствор вльги ната натрия и сА. -химотрипсина вводят порошкообразный свинец (уд.в. 11,3 г/смэ) в количестве 44,2 г, что соответствует объ емной доле 0,08. Частицы свинца предвари,тельно покрывают слоем поливинилхлорида, для чего порошок свинца взбалтывают в тече-! ние 10 мин в препарате виникс, после че
"го подвергают распылительной сушке, Препарат иммобилизовакного K -химотрипсина имеет уд.в. 1,8 г/см . Активность иммобиЪ лизованного с - -химотрипсина составляет
12% от активности неиммобилизоввнного фермента.
Пример 9. Готовят препарат Ф- -химотрнпсина, иммобилизованного в комплексном геле, квк описано в примере 7, но вместо двуокиси кремния и водный раствор альгината натрия и с - -химотрипсинв вводят порошкообразное стекло (уд.в. 2,5 г/см ) в количестве 127 г, что соответствует объемной доле 0 53. Получают препарат с уд.в, 1,8 Г/см
Ь
Пример 10, 235 мг акриламида и
15 MI метнлен-бнс-акриламида растворяют в 2,3 мл 0,5 М фосфатного буфера с рН
Р, 4 Ф
522189
Тираж 575 Подписное
Филиал ППП Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4
7,6.. Далее при непрерывном перемешивании в раствор вводят 1 мг лактатдегидрогенаэы с активностью 20000 ед./мг (по Бюхнеру) и 0,1 мл 5%-ного водного раствора Р -диметиламинопропионитрила. Далее в этот раствор добавляют при перемешивании порошкообразную двуокись титана (уд.в. 4,0 г/см ) з в количестве 11,0 r, что соответствует объемной доле 0,50, и наконец, 0,1 мл 5 /-ного водного раствора персульфата аммония, Полученную смесь выдерживают на ледяной бане в течение 30 мин. Полученный гель измельчают и промывают водой.
Ферментативную активность определяют, пропуская раствор пирувата и гидрированно-. го кофермента, НАД Н, через колонку, эаl5 полненную частицами препарата иммобилизованной лактатдегидрогенаэы. Концентрацию
НАД определяют спектрофотометрически.
Активность препарата 178 ед./мл частиц .геля, тогда как активность препарата фермента, иммобилизованного аналогичным образом, но без добавления двуокиси титана, составляет 192 ед./мЛ.
Полученный препарат иммобилиэованной лактатдегидрогеназы имеет уд.в. 2,5 г/см .
Ь
Пример 11. 500 мг проназы раст воряют в 10 мл воды и этот раствор вводят при перемешивании в 40 мл 1%ного раствора агара, предварительно нагретого до
95 С и охлажденного до 40оС. В получено ный раствор добавляют при перемешивании опилки (уд.в. 7,8 г/см ) в количестве 182 г, э что соответствует объемной дозе наполнителя 0,30. Полученную смесь выдерживают при 6-8оС в течение 16 час.
Для определения ферментативной активности 20 мг препарата иммобилизованной проназы суспендируют в 5 мл воды и выдер-: живают в течение 20 мин. Затем отбирают пробу объемом 0,1 мл и вводят ее в 10 мл
0,02 М pacraopa этилового эфира H -ацетил-? -тирозина в 0,5 М трис-буфере с рН 9,0 при температуре 30 С, За ходом ре-i 41 акции гидролиэа этилового эфира И -ацетил-I
- L -тироэина следят с помощью рН-статирования, поддерживая постоянное значение рН реакционной смеси путем титрования 0,05 и. едким натром. 50
3а меру активности фермента принимают начальную скорость расхода титранта. Активность препарата иммобилиэованной пронаэы составляет 38% от активности неиммобилиэованного фермента. Препарат имеет уд. в.
3,0 г/см .
Ц)- ИИПИ Заказ 3576/318
Пример 12. 500 мг цапаина раст воряют в 10 мл воды, содержащей 0,01моль/л цистеинхлорида и 2 ммоль/л трилона Б. Этот раствор вливают при перемешивании в 40мл
Ф
8%-ного водного раствора клейстеризованного картофельного крахмала при 40оС. В пс лученный раствор вводят при перемешивании порошкообраэную окись алюминия (уд.в, 3,8 г/см ) в количестве 160 r, что соответствует объемной доле наполнителя 0,43.
Полученную смесь выдерживают при 6-8оС в течение 40 час, Для определения активности 50 мг препарата иммобилизованного папаина суспендируют в 10 мл воды, в которой содержится
0,01 моль/л цистеинхлорида и 2 ммоль/л трилона Б, и выдерживают в течение 10 мин.
Затем отбирают пробу объемом 0,5 мл и вводят ее в 10 мл 0,02 М раствора этилового эфира H -бензоил- L -аргинина в0,05
М трио-буфере с рН 8,5 при температуре
35оС. За ходом реакции гидролиэа этилового эфира H -бенэоил- Q -аргина следят с помощью рН«статирования, поддерживая по4 стоянное значение рН реакционной смеси путем титрования 0,05 н, едким натром, В качестве меры активности фермента принимают начальную скорость расхода титранта.
Активность препарата иммобилиэованного папаина составляет 18% от активности неим мобилизованного фермента. Препарат имеет уд,в. 2,2 г/см .
Формула изобретения
1. Способ получения препаратов иммобилизованных ферментов введением фермента в раствор гелеобразуюших веществ с последующим переводом раствора в гель, o r—
Jl и ч а ю ш и и с я тем, что, с целью повышения эффективности препаратов путем использования их в псевдоожиженном слое, в раствор гелеобразуюших веществ вводят мелкодисперсный инертный наполнитель.
2. Способ по и. 1, о т л и ч а ю ш и йс я тем, что, с целью получения препаратов иммобилизованных ферментов с заданным значением удельного веса, в качестве наполнителя используют химически инертные вещества с уд.в. 2,4-11,3 г/см, причем объЪ емная доля наполнителя составляет 0,08-0,6.
3. Способ по пп. 1 и 2, о т л и ч а юim и и с я тем, что в качестве наполнителя используют химически инертное вещество, выбранное из труппы, состоящей иэ окислов металлов, окислов неметаллов, мелкодисперсных металлов, силикатных материалов.
