Способ получения водонерастворимого ферментного комплекса

 

(11) 524523, ОЛ ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 07.12.73 (21) 1982569/13 (23) Приоритет — (32) 08.12.72 (31) Р 2260185.0 (33) ФРГ (43) Опубликовано05.08.76.Бюллетень № 29 (45) Дата опубликования описания08.06.77 (51) Я. Кле

С07 Cr 7/02

Государственный иомитет

Совета Министров СССР по делам иэооретений и открытий (53) УДК 615.779. .94 (088.81

Иностранцы

Дитер Яворек (ФРГ), Михаэль Нэльбек-Хохштэттер (Австрия), Клаус Беаукамп, Ханс Ульрих Бергмейер и Карл-Хайнц Боч (ФРГ) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

"Берингер Маннхайм ГмбХ" (7 .) Заявитель (ФРГ) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОНЕРАСТВОРИМОГО ФЕРМЕНТНОГО

КОМПЛЕКСА

1 †ф

X- галоге н

Х вЂ” х х=з,с

О! — ei „1ь (®

Э (ф

Π— И

Изобретение относится к области биохимии.

Известен способ получения протеинов, связанных с носителем путем взаимодействия протеина в водном растворе с бифункци- о ональным реагентом, содержащим эпоксид— ную группу и способную к сополимеризации двойную связь. При этом вещество носителя получают в roM же водном растворе путем полимеризации мономеров, а в качестве еще одной функциональной группы, пригодной для связи с носителем, применяют двойную связь, пригодную для сополимеризации, Однако известный способ не обеспечивает получения более стабильного и активного комплекса.

11елью изобретения является получение более стабильного и активного комплекса.

Для достижения этой цели присоединение фермента осуществляют за счет группы бифункционального соединения, способной ацилировать HJIH алкилировать фермент без IIQ» тери биологической активности, процесс получения полимерного носителя осуществляют непосредственно в реакционной среде.

В качестве групп, ацилирующих или алкилирующих в водном растворе протеин в соединении, примененном с протеином для превращения, пригодны многочисленные группировки. Предпочитаемыми ацилирующими группами являются этилен-иминовые группы, ненасыщенные активированные гало генидные группы, галогенидные группы кислот, азидные группы, ангидридные группы кислот, альдегидные группы, оксазолоновые группы.

Реактивноспособные группы для иммобилизации энзимов.

524521 теля можно вводить в водный раствор для образования связи с промежуточным продуктом.

Преимущественно вещество носителя по5 лучают в водном растворе путем полимеризации, растворимых в воде мономеров. В этой форме превращение протеина с соединением связи может происходить или в присутствии одного или нескольких мономеров, спо10 собных полимеризоваться, причем в заключение полимеризацию проводят при вполимеризации соединения связи и протеина и промежуточного продукта, или же мономер или смесь мономеров, способных полимеризоваться, добавляют в раствор только после реакции между протеином и соединением связи, а затем инициируют процесс полимеризапии.

В качестве мономеров применяют растворимые в воде соединения, которые пригодны для образования полиаддукта или поликонденсации. Предпочтительными являются мономеры, способные образовать полиаддукт, в частности такие мономеры, которые имеют, по меньшей мере, одну олефиновую ненасыщенную связь.

) — 0-0Н; ЮН;Х

Х=Р, 1,3r

II — о-с-сн;х

i — СИ=0

B качестве функциональной группы, пригодной для связи с носителем, могут быть такие группы, которые способны образовывать аддукт с собственным веществом носителя или конденсироваться с ним. При иси льзовании соединений связи с группой,при- + годной для конденсации, обрашают внимание на то, чтобы в процессе конденсации не отшеплялись какие-либо вещества, которые отрицательно влияют на активность связанного протеина. 45

Особенно хорошо происходит связывание промежуточного продукта с веществом носителя путем полимеризации в вещество носителя. При этом применяют соединение связи, которое имеет, по меньшей мере, одну двой — 50 ную связь, способную к сополимеризации.

В качестве веществ носителя применяют все такие нерастворимые в воде вещества, которые могут связываться в подходяших условиях в водном растворе через соответству-55 юшую функциональную группу с соединением связи. Применяют зешества носителя, которые являются гидрофильными, легко набухаемыми, совсем без заряда, а также устойчивыми к микроорганизмам. Вешество носи- 60

Мономер должен быть растворим в воде и одновременно содержать двойную олефиновую связь, способную к полимеризации.

В качестве мономеров предпочитаемым являются растворимые в воде производные акриловой кислоты или метакриловой кислоты, такие как,например амиды, нитриды, и сложные эфиры этих соединений. Соединения могут быть замещены также алкильным остатком, при этом растворимость в воде снижается очень незначительно. Эти соединения с уменьшенной растворимостью в воде обладают преимуществом, когда энзим, связанный с носителем, нужно вводить не в чисто водную систему, например в водно-органическую среду. Пригодными являются производные малеиновой и фумаровой кислоты.

Можно применять и нерастворимые в воде мономеры. В этом случае полимеризацию проводят не в растворе, а в суспензии. Преимущество его в том, что можно получить состоящую из мелких частиц перлообразную матрицу без способности к набуханию в водных системах.

В зависимости от желаемой консистенции конечного продукта в мономер добавляютсшиваюшие вещества, содержашие более, чем одну группу, способную полимеризоваться.

Примерами таких сшивающих добавок являются N, Й -метилен-бисакриламид и эти- . ( лендиакрилат. Они являются предпочтительными при работе с водными растворами. Если проводят полимеризацию в суспензии, то могут применять также нерастворимые в во524521

Составитель С. Малютина

Техред М. Левицкая Корректор Н. Золотовская

Редактор В. Смирягина

Заказ 4993/384 Тираж 575 Подписное

1ЛНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r Ужгород, ул. Проектная, 4 де сшивающие средства, такие как дивинилбензол и этилен-диметилакрилат.

Если не применяют сшиваюшее мостикообразующее средство, то получают материалы носителя, которые являются растворимыми или термопластическими.

Превращение протеина и соединений связи осуществляют также в присутствии носителя или исходных продуктов для получения носителя, так как установлено, что сначала р может происходить преврашение протеина и соединения связи, а затем следует связы— вание с носителем.

Благодаря сушественно расширенной шкале применяемых соединений связи, расширя- 15 ется общая возможность применения способа.

Пример 1. 100 мг глюкозооксидазы растворяют в 1 мл 1М триэтаноламиноо вого буфера с рН 8,0 при 10 С в атмосфере азота. Затем добавляют 0 03 мл акрило- 20 илхлорида в 3 мл простого эфира и перемешивают смесь в течение 30 мин. Затем в течение ночи диализуют 2 л 0,01 М диэтаноламинового буфера с рН 8,0 и отцентрифугируют осадок. Энзиматическая активность 25 составляет 16000 Zg

В полученный таким образом раствор до.бавляют 0,4 мл 5%-ного диметиламинопропионитрила и 0,4 мл 5%-ного дисульфата перекиси аммония при 5 до 10 С (энзиматическая активность 14500 Eg ) Затем до( бавляют 3 г акриламида, 0,015 r N,N

-метилен- бис -акриламида в 9 мл воды в азотной атмосфере. Сразу же начавшаяся полимеризация приводит к образованию желеобразной застывшей массы. Полученный продукт гранулируют через 0,4 мм металлическую сетку и затем промывают 2 л 0,2 М фосфатного буфера при рН 7,5. Энзиматическая активность промывочной воды составля- 4 ет 600 Zg Полимеризат лиофилизируют, выход 3 г сухого продукта с энзиматической активностью 1500 Eg *

Способ повторяют без добавки акриоилхлорида. Полимеризация включения дает вы к ход 3 r продукта с обшей активностью 330 Ep

Пример 2. 300 мг трипсина растворяют в 10 мл 0,5 М фосфатного буфера б о при рН 8,0 в атмосфере азота при 10 С.

Полученный раствор перемешивают в течение

30 мин с 0,1 мл акрилоилхлорида в 10 мл простого эфира. Затем добавляют 0,4 мл

5%-ного диметиламинопропионитрила и О, 4мл

5%-ного дисульфата перекиси аммония и перемешивают в течение 30 мин.

Затем добавляют 3 г акриламида, 0,015г

N ((-метилен-бис-акриламида в 9 мл воды ( в атмосфере азота при температуре от 5 до о

10 С и сохраняют эти условия до образования желеобразной твердой массы. Затем полученный продукт гранулируют через 0,4мм металлическую сетку и промывают 3 л

0,2 М фосфатного буфера при рН 7,5.

Промытый продукт сушат охлаждением.

Получают 3 г лиофилизата с удельной активностью 12,9 Е /г.

Повторение способа при одинаковых условиях, но с добавлением акрилоилхлорида, показало удельную активность 0,5E)/ г лиофилизата.

Пример 3. Поступают как описано в примере 1 с применением гексокиназы в качестве протеина. Система полимеризации состоит из аллилового эфира крахмала, ак(( риламида и N, (" -метилен-бис-акриламида. Полученный продукт содержит 120 Eg/г лиофилизата.

Формула изобретения

1. Способ получения водонерастворимого ферментного комплекса путем связывания фермента в водной среде с полимерным носителем через бифункциональное соединение, содержашее способную к сополимеризации двойную связь, о т л и ч а ю ш и и с я тем, что, с целью получения более стабильного и активного комплекса, присоединение фермента осуществляют за счет группы бифункцинального соединения, способной ацилировать или алкилировать фермент без потери биологической активности.

2. Способ по и. 1, о т л и ч а ю ш и йс я тем, что процесс получения полимерного носителя осушествляют непосредственно в реакционной среде.