Способ получения пептидов

 

(и) 511852

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

СоцналнСтннескнх

Ресттубпнк

К ПАТЕНТУ (6!) Дополнительный к патенту. (22) ЗаявлЕно 290672 (21) 1803547/23-4

Р ) Приоритет 1.07 7 (3) (51) М. Кл.. С 07 С 103/52

Гасударственный намитет

6аввтв в!нннстрав СССР аа ленам извбретвннй н атрытий (31) P 2132773 (33) ФРГ

P 22026137 (43) Опубликовано; 2504.76. Бюллетень № 15 (53) УДК 547. 964.4 °

07 (088.8) (45) Дата опубликования описания 151277

Иностранцы

Вольфганг Кениг, Рольф Гейгер и Ханс Виссманн (ФРГ) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма Хест AI" (ФРГ) (71) Заявитель (54 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ

)О е(у о ку

1 в ! и

V-IH-CI-I-С)„, -К-СН-C g II

Изобретение относится к улучшению способа синтеза пептидов иэ фениловых эфиров аминокислот или пептидов, которые находят применение в медицине.

Известны различные способы синтеза пептидов, исходя иэ фениловых эфиров аминокислот или пептидов, имеющие тот недостаток, что в ряде случаев велико время проведения реакции. Так, время проведения реакции -нитрофенилового эфира трет-бутилоксикарбонил- Leu — Phe с трет-бутиловым эфиром составляет 70 час. Известен также спо. соб ускорения конденсации с помощью имидазола. Однако при этом аминолиз активированных эфиров сопровождается рацемизацией. о — ор о

Предлагается неизвестная ранее модификация получения защищенных пептидов общей формулы

HY О HY OHY О HY 0 ! I u I I (! ! 0 I I !!

V- (й-СН"С) -й"СН-C -II - CH -С -(М - СН - C ) (1 )

fill el2 где тп —. число от 0 до 0!

me — число от 0 до и более

500; у — аминозашитная группа или пиооглютаминовый остаток; 30

Y — низший алк1т(10вща остаток, который может быть разветвленным и/илй защищенным при необходимости защищенным ОН,-МНЕ,-$Н-600!I,-с 1МНВ, -гуанидин, -арил, -имидазолил-индолил остатками1 причем группа(-III-Я) также может овна чать пирролидинил — остаток, путем взаимодействия защищенной аминокислоты или защищенного пептида формулы e m,,V u Y имеют укаэанные значения, е представляет собой ди-, три-, -тетра или -пента-. хлорфенил, -нитрофенил, или хлор-нитрофенил« остаток с защищенным при необходимости аминокислотами или пептидами общей формулы

Н Y О Н Y 6

II н-(е-сн-с (к-сн с) -% !Ill) где m.. Y и (-е!Н - Смт- ) остатки имеют указанные значения!

w означает гидроксильную груп.пу, о-алкил, о-аралкил, амииогруппч

511852 или эфиро- или амина-связанный полимерный носитель, замещенный алкилом, аралкилом или арилом.

Способ заключается в том, что взаимодействие проводят при добавлении соединений общей формулы

Х

К-ОК .

1 (iV) в которой Х означает группу С-О, С- или — 8 — и Х и N являются членами 5 — 6-членного гетероциклического кольца, аннелированного с бензольным ядром и/или содержащего 1 или 2 других.гетероатома; их рК составляет

3,7 — 4,2.

Продукты выделяют известными способами.

Установление значений рК может

20 производиться в 0,5 М растворе в смеси из 6 ч. диметилового эфира диэтиленгликоля и 4 ч. воды при 30 С. Если значение рК соединений формулы 1У в таких условиях выше (bf -гидроксипиперидин) или ниже (1-окси-6-нитро-бен25 эотриазол), то их положительное действие снижается. Обычно соедин ение общей формулы CV берут в количестве от 0,1 до примерно 1 экв., однако можно также использовать меньшие или большие количества.

Пригодны следующие соединения формулы (V: 1-гидроксибензотриазолы, например 1-гидрокси-5,6-диметилбенэотриазол, 1-гидрокси-5-метил бенэотриазол, 1-гидрокси-6-метил-бензотриазол, 1-гидрокси-5-метокси-бензотриазол, 1-гидрокси-4-метил-бензотриазол, 1-гидрокси-б-бром-бензотриазол, 1-гидрокси-б-хлор-бенэотриазол, 1- 40

-гидрокси-5-хлор-бензотриазол, циклические гидроксамовые кислоты, например пиридоны: 1-гидрокси-2-пиридон, 1-гидрокси-б-метил-2-пирицон, 1-гидрокси-4,6-диметил-2-пиридон, 1-гидрокси-3,4,6-триметил-2-пиридон, 1-гидрокси-3,5-дихлор-4,6-диметил-2-пиридон, N -гидрокси-сукцинимид или

1-гидрокси-2-окси-2,3-дигидроиндолы, как 1-гидрокси-б-хлор-2-окси-2,3-ди- щ гидро-индол, циклические гидроксамовые кислоты с азотом в качестве гетероатома в кольце, например 3-гидрокси-4-окси-3,4-дигидрохиназолин, З-гидрокси-2-метил-4-окси-3,4-дигид- я@ рохинаэолин, З-гидрокси-4-оксо-3,4-дигидро-1,2,3-бензотриазин, 3-гидрокси-4-окси-2-фенил-3,4- дигидрохинаксолин, циклические гидроксамовые кислоты с кислородом или серой в качестве гетероатома в кольце, например пригодные замешенные 4-гидрокси-4,4-дигидро-3-окси-1,4,2-бензо-оксазины и

4-гидрокси-3,4-дигидро-3-окси-1,4,2-бензотриаэины, или циклические тиогидроксамовые кислоты, например 3- 66

-гидрокси-4-метил-2,3-дигидро-триаэол2-тион.

В качестве заместителей соединений формулы LV могут быть использованы алкил- или алкокси-остатки с

1-3 С-атомами, хлор.

Аминокомпонент Ш может использоваться либо свободным, либо как соль минеральных кислот сильных или слабых органических кислот, например и --толуолсульфо-, трифторуксусной или уксусной кислоты. Если имеется солеобразование с сильными кислотами, то для освобождения аминогруппы должны добавляться третичные органические основания, как триэтиламин или )4 этилморфолин. Также возможно применение соединений обшей формулы ф в виде соли, например натриевой соли

1-гидроксибензотриазола. При этом одновременно освобождается аминогруппа (образование натрневой соли) и образуется несбходимое для катализа

1-гидроксисоединение формулы (ч

В качестве защитной группы могут быть использованы обычные в химии пептидов защитные группы. Предпочтительно применяют аралкилоксикарбонил, например бензилоксикарбонил- или треталкилоксикарбонил-, например трет-бутилоксикарбонил-остатки.

ОН-группа у серина, треонина или тирозина может остаться незащищенной.

Ио она также может защищаться с помощью пригодных групп, например бутил-или бенэилгрупп.

Для получения цистеин- и цистинпептидов должна защищаться SH -группа цистеина при помощи обычных в химии пептидов SH -защитных групп, или проводиться реакция симметричных или несимметричных цистеинпептидов, которые затем могут восстанавливаться до цистеинпептидов.

М означает в карбонильном компоненте общей формулы Й! полимерный носитель, который эфирно- или амидообразно связан с карбоксильной группой. B качестве пригодных полимеров можно использовать сшитый с 1-2Ъ ди винилбензола полистирол, сшитые.

Взаимодействие обычно приводят в растворителях, например диметилформамиде, диметилацетамиде, тетраметилмочевине, или 1 (в. -диметиламиде фосфорной кислоты, в данном случае при добавлении небольшого количества

511852 о воды. Реакционная температура 0-40 преимущественно комнатная.

Обработка обычно происходит просто, так как N -гидроксисоединения общей формулы lV, как 1-гидроксибензотриазол или З-гидрокси-4-окси-3,4-дигидрохинаэолин, могут извлекаться экстракцней при встряхивании в делительной воронке с карбонатом натрия или калия или с содовым раствором. Другие со- 10 единения, например 1-гидрокси-2, пиридон или З-гидрокси-4-метил-2,3-дигидро-триаэол-2-тион, растворяются в воде и могут легко удаляться. К -гидроксисоединения из тяжелорастворимых производных пептицидов могут экстрагироваться изопропанолом, спиртом, метанолом, тетрагидрофураном или горячей водой. Возникающие при взаимодействии фенолы имеют своиства растворения, аналогичные К -гидроксисоединениям и выделяются с ними.

При К -ацил-пептид- активных эфирах добавление К -гидроксисоединений общей формулы lV не вызывает повышения рацемизации. Как при нитрофенил-, так и при трихлорфенил-эфирах нельзя увидеть рацемизации ни с добавкой, ни без добавки К -гидроксисоединений. По другому ведет себя пептахлорфениловый эфир, который дает примерно до 80Ъ рацемизированного трипептида. Путем добавления 1-гидроксибензотриазола эта сильная степень рацемизации могла быть снижена на 26-54%. При добавлении 2-гидроксипиридин-натриевой соли можно увидеть обратный эффект: рацемизация еще более усиливалась.

Путем добавления К -гидроксисоединений общей формулы Й можно пре- 40 одолевать пространственное затруднение, которое может мешать взаимодействию с активированными эфирами, например при взаимодействии Нр -изолейцинактивных эфиров с Н- СуЬ!т>Т!- se>- 45

le>! - ОН . Взаимодействие NpS -lLe-ÎÒ с р с Н-Cg5(Tzt)-sew — ье>> - он в диметилформамиде не может проводиться до конца. Через 5 недель опыт прерывается, так как при помощи тон- 50 кослойной хроматографии наряду с конечным продуктом и исходным материалом обнаружены многие продукты разложения. Напротив, если добавлен, например, 1-гидроксибензотриазол, 3гидрокси-4-окси-3,4-дигидрохиназолин или 1-гидрокси-2-пиридон, реакция заканчивается уже через 15-20 час.

П р и м е ч а н и е. Вос-трет-бутилоксикарбонил-;

2 — бензилоксикарбонил;

Кр5- о-нитрофенилсульфенил;

05и - трет-бутиловый эфиР!

OMe — метиловый эфир;

ОВ» — бензиловый эфир! оир- р-нитрофениловый эФир; á5

0Tep—

ОР Р—

OSa 5l—

T —

Ви —

МЬЬ—

СНА

2, 4, 5-трихлорфениловый эфир; пентахлорфениловый эфир; гидроксисукцинимид-эфир; тритил; трет-бутил-;

4,4 -диметокси-бенагидрил;. циклогексиламин

Применение соединений формулы ф может делать их полезными также в методах пептидной конденсации в твердой фазе. Например, из К -защищенных аминокислот и поли-4-гидрокси-3-нитро-стирольной смолы можно получать соответствующие нерастворимые эфиры, которые затем реагируют с растворимыми аминосоединениями в соответствующие амиды или пептиды. Использованием N -гидроксисоединений может быть значительно сокращено время реакции. При измененном методе Маррифилда в твердой фазе, при котором часто используются К -защищенные активные эфиры аминокислот, например) нитрофениловый эфир, добавки повышают выход продукта и сокращают реакционное время.

В качестве структурных звеньев пептидов принимаются во внимание все аминокислоты в их i -или D -форме, встречающиеся в естественных пептидах.

Также возможно применение 1> -аминокислот, например Р -аланина, или других, только синтетически или полусинтетически доступных аминокислот, например d. — ìåòèë-аланина, о!. -метил-3,4-диокси- L -фенилаланина или Р --хлораланина. Применение К гидроксисоединений в названных сильнополярных растворителях приводит к гелеобразованию, которые из-за их хороших свойств растворения удобны при синтезе высших пептидов.

Пример 1. Определение пери,ода полураспада при синтезе 2 Va!- циклогекснламида из молярных количеств

Z = VaP -" ОКр и циклогексиламина при добавлении различных К -гидроксисоединений и зависимости периода полураспада от РК-значения N -гидроксисоединений.

A . Установление периода п олураспада.

Раствор 1 : 0,5 нмоля циклогексиламина, 0,5 нмоля р-нитрофенола и

1,0 нмоль К -гидроксисоединения на 1 мл диметилформамида.

Раствор и : 1,0 нмоль р-нитрофенола на 1 мл диметилформамида.

Раствор lll 1,0 нмоль К -гидроксисоедннения на 1 мл диметилформамида.

Сравнивают УФ-кривые (область 330300 м) растворов l, Й и Щ, чтобы обнаружить благоприятные длины волн для измерения р-нитрофенола. При этой длине волны измеряется экстинкция. К

511852

Таблица 1

Время, мин

Соединение

Без добавки

112,0

125,0 и -гидроксипиперидин

19,0

1,9

0,25

4,10

4,09

14,8

4,09

5,9

4,08

3,2

1-Гидрокси-2-пиридон

4,08

1,3

4,08

4,05

4,0

4 05

1,5

4 05

60 0

4,04

4,8

2,1

2,8

4,02 полученному значению раствора 1 прибавляются 503 экстинкции раствора.

1 ммоля 2 - VaР - Ой(о и l имая триэтиламина в каждом миллилитре рас" творителя при выбранной длине волн, Сумма этих обеих экстинкций представ.- ляет экстинкцию, при которой взаимо-; действовала половина Е; VaP - OHp c циклогексиламином.

УФ-спектры измеряли при 21 С на

30 аппарате Весктапп TK1A, Вещества растворены в диметилформамиде.

Б. Измерение периода полураспада.

Для кинетического измерения периода полураспада T l/2 измеряли раствор 1 нмоля Z- ЧаР— ONp, 1 нмоля циклсгексиламина и 1 нмоля )4 -гидроксисоединения в каждом миллилитре растворителя при определенной в при- ЯО мере A длине волны. Время, за которое достигается в пункте А установ1-Гидр окси-4-метил-6-и з опропил-2пиридон

З-Гидрокси-2-метил-4-окси-3,4дигидрохиназолин

3-Гидрокси-4-окси-3,4дигидрокси-хиназолин1-Гидрокси-3,4 6-триметил-2-пиридон

1-Гидрокси-4,6-диметил-2-пиридон

1-Гидрокси-4-метил-2-пиридон

З-Гидрокси-4-метил-2,3-дигидрокситиазол-2-тион

1-Гидрокси-3,5-дихлор-4,6-диметил «2-пиридон

1-Гидрокси-2-окси-2,3-дигидро-6 îð-индол уксусная кислота (для сравнения)

И -Гидроксисукцинимид

1-Гидрокси-5,6-диметил-бензотриаэол

l-1идрокси-5-метил-бензотриазол ление величины, соответствует периоду полураспада реакции.

В. Измерение рК- значения в 0,5 М растворе (диметиловый эфир диэтилен= гликоля/вода в соотношении 6 г 4)при

0,5 нмоля вещества растворяют в смеси из 6 мл диметилового эфира диэтиленгликоля, 2,5 мл 0,1 н.едкого натра и 1,5 мп воды нагревают в термостате до 30 . 0дностержневым стеклянным электродом потенциометрически измеряют рН. По приблизительной формуле Р1 — рК - Я @.(f:.-сС) для сС= 0,5 ,рК рй. Измеренное рН-.значение представляет собой рК-значение этого соепинения.

Г. Сравнение периодов полураспада при синтезе Z Vap циклогексиламида из молярных количеств 2-VaP-OMp и циклогексиламина с рК-значениями добавленных М -гидроксисоединений приведено в табл.

511852

Продолжение табл. 1

Время, мин

Соединение рК

2,0

4,00

3,6

4,00

3,0

4,00

3,5

4,00

4,00

18,0

8,9

3,91

3 90

10,6

13,9

3,89

3,72

39,0

3,7

35 0

3,51

Очень медленно

1-Гидрокси-6-метокси-бензотриазол

1-Гидрокси-5-метокси-бензотриазол

1-Гидрокси-4-метил-бензотриазол

1-Гидрокси-бензотриазол

З-Гидрокси-4-окси-3,4-дигидро-l 2,3-бензотриазол

1-Гидрокси-6-бром-бензотриазол

1-Гидрокси-6-хлор-бензотриазол

1-Гидрокси-5-хлор-бензотриазол

1-Гидрокси-6-трифторметил-бензотриазол

1-Гидрокси-5,6-дихлорбензотриазол

1-Гидрокси-6-нитро-бензотриазол

Пример 2. Получение исходных продуктов.

A. НВЧ H-Phe — ОМр

4,2 г Z — Phe - OMp суспендируют в 10 мл ледяной уксусной кислоты. Затем добавляют 10 мл насыщенной HBV ледяной уксусной кислоты и перемешивают один час при комнатной температуре. Затем высаживают гидробромид большим количеством эфира и после этого хорошо промывают эфиром. Выход продукта 3,5 г; т.пл. 216-218 С.

В. НВЧ Н-Phe — OP ср

5,47 г Z -Рве -OP обрабатывают ср аналогично примеру A. Выход продукта

4,1 г; т.пл. 205О(разложение).

В. НВЧ Н вЂ” Phe - От

cp

4,78 г Z -Рйе — OT обрабатывают ср аналогично примеру A. Выход продукта

4,2 г; т.пл. 220 (разложение). ®

Г. Вос Еем Р е ON р

2,49 r Boc- Ьея — ОН 1Н О растворяют в уксусном эфире. Уксусный эфир сушат сульфатом натрия, концентрируют и остаток сушат в глубоком вакууме. Остаток растворяют в 20 мл абсолютного тетрагидрофурана и раствор охлаждают до -10 . При перемешивании и охлаждении льдом прикапывают 1,2 мл

N -этилморфолина и затем раствор

1,27-г изобутилового эфира хлормуравьиной кислоты в слегка охлажденном тетрагидрофуране. Перемешивают 10 мин при — 10, затем добавляют 3,35 г

НВр.Н вЂ” Phe - ONP И МЕДЛЕННО ПРИ- 65 капывают раствор 1,2 мл М -этилморфина в 5 мл тетрагидрофурана. Перемешивают еще 1 час при 0 и 1 час при комнатной температуре, отсасывают осадок, концентрируют фильтрат и остаток растирают с изопропанолом. Вы- . ход продукта 3,77 г; т.пл. 150 - 152

После перекристаллизации из изопропанола : выход 3,10 г; т.пл. 152-153 (с) =-32,2 (с = 1, в диметилацетамиде).

Д. Вос- реп — phe - ОР р .

Из 1,97 r Вос- Ьеп ° 1Н О, 0,93 мл

М-этилморфолина 1,0 г йзобутилового эфира хлормуравьиной кислоты аналогично примеру Г получают смешанный ангидрид, который взаимодействует с 3,55

HBV- H — Phe — OP и 0,93 мп К этил- ср морфолина. Выход продукта 3,35 г; т.пл. 145-147 . После перекристаллизации из изопропанола : выход 2,11 r> т.пл. 163-164 ; (

Е. Вос — Len - Phe — ОТср

Из 2,3 г Вос — 1еп -ОН 1Н О, l,l мл N -этилморфолина и 1,17 г изобутилового эфира хлормуравьиной кислоты получают смешанный ангидрид, который превращают с 3,6 г HBY-Н-Phe-Щ и 1,1 мл N-этилморфолина. Выход продукта 3,7 г) т.пл. 143-145 . После перекристаллизации из изопропанола .выход 3,2 г т.пл. 150-151, (d) -48, 4 (с - 1, в диметилацетамиде), Способ получения Вос-4еа-Им VaR ОМ и Вос - ben - Phe - активных эфиров.

511852

Т а б л и ц а 2 ализатор

70 час

< 2

2-Гидрокси-пиридина натрчевая соль

ON p

3,7

1,0

4 час

5 мин

5 мин

1,0

< 2

0,1

< 2

70 час

2-Гидрокси-пиридина натриевая соль

OT ср

< 2

1 час

5 мин

1,0

< 2

70 час

1 час

5 мин

1,0

OP ср

1,0

10 мин

1 i 0

OT ср

10 мин

10 мин

1,0

1,0

1-Гидрокси-2-пиридин

К раствору 105 мл (0,5 ммолей)

НИ ° Н- Va8-08и в 2,5 мл 0,2 М

И вЂ” э тилморф олин /диме тилацет амид раствора добавляют катализирующую добавку (1-гидроксибензотриазол или 2-гидрокси-пиридина натриевую соль) и

0,5 ммоля соответствующего Вос- реп-pheактивного эфира (250 мл Âoñ-&n-Phe-ONP

313 мг Вос- (.еи — Рпе — OP 279 мг ср

Вос- Len -ОТ ). Оставляют стоять опср ределенное время, разбавляют 50 мл ук1-Гидрокси-бензотриазол

То же

1-Гидрокси-бен зотриазол

2-Гидроксипиридин

2-Гидроксибензотриазол

3- Гидрокси-4-окси- 3, 4дигидро-диназолин

3- Гидр окс и- 2-метил-4-окси-3,4-гидро-хиназолил

Пример 3. Синтезйрз-Йе-Cps (ЧЪ1) - Ger. ахеи — Он

A. Получение Nps - lee активного эфира.

Молярное количество Nps - изолейцина и трихлорфенола соответствующего N --гидроксисукцинимида подвергают взаимодействию в уксусном эфире при 0 с небольшим избытком дициклогексилкарбодиимида (ДЦК). Перемешивают 1 час при 0, затем 3 часа при сусного эфира, эфирный раствор экстрагируют в делительной воронке NaHCO>—

-KHSO4-, NaHCO3 — и NACl — РФствором, сушат сульфатом натрия и концентрируют. Остаток парционально гидролизуют, трифторацетилируют и газохромаграфируют.

Результаты газохроматографическо10 ro определения рацемизации приведены в табл. 2. комнатной температуре, отсасывают осадок и фильтрат концентрируют. Остаток перекристаллизовывают из иэопропанола.

Nps — (8е - ОТ; т пл. 95ср

Nps - (1е - 0; т.пл. 105-1089

Б. Mps- (8е - сцз (ТчЦ "Ьеч-(.еа- OH

2, 9 г ммолей ) H- Cps (T v4) - Sev- Ьеи

ОН Н О и 8 мг (5 ммолей) 1-гидрокси65 .5,б-диметил-бензотриазола растворяют

511852

-СЧЭ(7 Ц -Sey-Ьeq-ОК и4 МР$ - 1В - От р соответствующего Нрав - Ие - OSu u

Н-CgS(Tvtl-Sev — ben -ОК

К раствору 116,3 мг (0,2 ммоля) н — сиз!ТчЦ-Sev- реп оН. н О в 2 мл диметилформамида добавляют 0,2 ммоля

g -гидроксисоединения и 111 мг

0,22 /Ярз — (Ее — ОТ 89,2 мг (0,25 ммоля) NpS — ice — OSu . Через различные промежутки времени на пленочную силикагельную пластину наносят одну каплю реакционного раствора. Опускают в смесь метиленхлорид/метанол (8 : 2) и выделяют ангидрином. В табл,З приведены результаты этого исследования.

Таблица 3

Конец реакции (реакционное время) К вЂ” гидроксисоединение

Эфир

0SU

Прервана через 5 недель, т.к. не было установлено полного превращения

3-Гидрокси-4-окси-З,4-дигидро-хиназолин

То же

Примерно 15 час

То же

1-Гидроксибенз отриазол

З-Гидрокси-4-окси-3,4-дигидро-хиназолин

З-Гидрокси-2-метил-4-окси-3,4-дигидрохиназолин

Примерно 7 дней

3-Гидрокси-4-окси-2-фенил-З,4-дигидрохиназолин Т ср

1-Гидрокси-5,6-диметил-бензотриазол

1-Гидрокси-2-пиридон

1-Гидрокси-2,4-диметил-2-пиридон раз с РаствоРом КН$04, три раза с 2н.

Раствором соды и один раз с водой сушат с сульфатом натрия, концентрируют и остаток растворяют с петролейным эфиром. Выход продукта 2,08 г1 т.пл. 99-104 . После перекристаллиэа" ции из смеси уксусный эфир/петролейный эфир; выход 1,7 г (83В от теоре60 тического); т.пл. 112-114

В. С 0,1 экв. 1-гидроксибензотриазола и 2 — Phe — ОТср

К раствору 0,92 г (5,5 мыслей)

НЙ - H ЧаС вЂ” ОМе, 0,72 мп 9 -этил9f морфолина и 67.5 мг (0,5 ммоля) 1в 25 мл диметилформамида. K нему добавляют 2,32 г (5 ммолей)йрз-йе-ОТр. и оставляют стоять 1 час при комнатной температуре. Исходный трипептид не был обнарУжен с помощью-тонкослойной хрбматографии. Диметилформамид отгоняют в вакууме и остаток растворяют с раствором бикарбоната натрия.

Осадок растворяют в уксусном эфире и извлекают в делительной воронке с раствором КН504 и водой. Остаток растирают с эфиром. Продукт аморфный. Его выход 3,6 r (82% от теоретического);

Щ - 23 5 (с = 1, в диметилацетамиде) .

В. Исследование с помощью тонкослойной хроматографии синтеза NpS-ipe1-Гидрокси-4-метил-2-пиридон

Пример 4. СоставЕ-Phe-ЧоР-оме.

A. С 1 экв. 1-Гидроксибензотри. азола и Z - Phe - OPcp

К раствору 0,92 г (5,5 ммоля)

НСЕ - Н - у е — ОМе, 0,72 мг К— атилморфолина и 675 г (5 ммолей) 1гидроксибензотриаэола в 10 мл диметилформамида добавляют 2,75 г(5 ммолей) Z - Bee — ОР . Смесь перемешиср вают 5 мин, концентрируют в глубоком вакууме, распределяют остаток между уксусным эфиром и 2 н.раствором соды извлекают в делительной воронке один

То же

Примерно 20 час

То же

То же

Примерно 4 дня

511852

1Ь

-гидроксибензотриазола в 10 мг диметилформамида добавляют 2,4 г (5 ммолей)

Z — РИе — OT > Перемешивают

5 мин и работают до выхода продукта

1,66 г (81Ъ от теоретического);

5 т.пл. 112-114

В. С 1 экв . 1-гидроксибензотриазолнатриевой соли и Z-Phe — 0)(р К раствору 0,92 г (5,5 ммолей) HC(! — Н

Va(! — ОИе в 10 мл диметилформамида добавляют 865 г (5,5 ммолей) натриевой соли 1-гидроксибензотриазола и

2,1 r (5 ммоля) Z -Phe — ОКр . Перемешивают 5 мин и работают по примеру A до выхода продукта 1,65 r (80Ъ от теоретического); т.пл. 116 и р и м е р 5 . синтез z - van -чае-Оие

К раствору 0,92 г (5,5 ммолей) цСЕ-Н вЂ” Vae — ОМЕ в 10 мл диметилформамида добавляют 865 r (5,5 ммолей)

1-гидроксибензотриазол-натриевой соли и 1,87 г (5 ммолей) Z-VaP — Ойр . Смесь перемешивают 5 мин и работают по примеру 4А до выхода 1,66 г (91Ъ от теоретического); т.пл. 108-110 C. и р и м е р б. синтез z-Len-qEu(QBu) 28

-Asn(Mba)- туч(В ) -ОН (ряд иэ инсулин-A-цепей).

1. Z — Ьеп-@au(OBu )-Asn (мЫч) — Туч(Ва )C t — ОН

К раствору 1,53 г (2 ммоля) ЗО

H — фи(ОВй) -Asn(Mbh)- Tgv(hu ) - OH и 270 мг (2 ммоля) 1-гидроксибензотриазола в 5 мл диметилформамида добавляют 1, 5 г (2, 2 ммоля) Z - Leo — ОР позволяют 10 мин стоять и концентрй- :"@ руют в глубоком вакууме. Остаток растирают с 2 н.раствором соды. Раствор отстаивают, остаток растирают с водой, затем отсасывают. Фильтруемый материал распределяют между 2,5о-ным 40

KHSO4 -раствором и уксусным эфиром.

Эфирный раствор сушат и концентрируют. Остаток растирают со смесью эфир/петролейный эфир и отсасывают.

Выход продукта 1,8 г (89Ъ от теоре- 45 тического); т.пл. 174 †1

Это соединение по тонкослойной хроматографии является идентичным пробе, которая получена с Z-Leo -OSu

Время реакции 24 час; выход 84Ъ. 66

Разный результат получают при применении З-гидрокси-4-окси-3,4-дигидроксихиназолина, l-гидрокси-5,6диметил-бензотриазола или 1-гидроксипиридона вместо 1-гидроксибензотри- 55 азола.

П. Получение исходного вещества

Н g(.u(O8u )- Лзп(МЬИ) - Тич(Ви ) OH

А. 2-льм(мьи) — trav(But) - он

100 r (О, 138 ммоля)7-Asst(Mba)- Tgv(But) — 0H суспендируют в смеси из 770 мл ди< сана и 200 мл воды. При 37 медленно прикапывают 138 мл 1 н.раствора едкого натра (тимолфталина в качестве индикатора). По окончании реакции 65 подкисляют с 300 мп 2 н.раствора лимонной кислоты. Выпавший продукт отсасывают и промывают водой. Переосаждают из смеси метанол/вода. Выход продукта 88 r (90Ъ от теоретического); т.пл. 212-213;(a(.)z = + 7,6 (с = 1, в диметилформамиде) .

Б . Н - А5Ь(МЬИ) - Tg V (5u ) — OH

Через раствор 87,5 r (0,123 моля)

Z"-ASn fivlbh) -trav(Bu }- ОН в ледяной уксусной кислоте, к которому добавляют немногоРоВ(ОН) /Ba SO4катализатора водород пропускают до тех пор, пока не прекратится образование COZ . Концентрируют и растирают остаток основательно с насыщенным раствором ацетата натрия. Отсасывают, сушат над Р Ое и высаживают из смеси тетрагидрофуран петролейный эфир.

Выход продукта 63 5 г (90Ъ от теоретического); т.пл. 207-209 .(А1д+ 11,1 (с 1, в ледяной уксусной кислоте).

В.Z-дЬ (ОВ u ) — Assi(A4bh) — Тцч(В л ) - ОН

К раствору б 3 г (О, 109 моля)

H-ASn (Mbh)- Tgv(But) QH з 250 мл диметилформамида добавляют при комнатной температуре 47,4 г (0,109 моля) Z — qPv(OBu ) -O>4

1 и отстаивают в течение 20 час при комнатной температуре. Затем вещество высаживают водой, сушат над Р> ÎS и пересаживают из смеси уксусный эфир/ петролейный эфир. Выход продукта

75,5 r (77Ъ от теоретического); т.пл. 166-170 ; (с i = + 1,80 (с=.l, в диметилформамиде).

Г. H — gBv(OBu+) — Asn(hhbh) — Tgv(Bv ) ОН

74, 7 r (83,9 ммоля) Z- gfv(OBut)АЗп(МЫ 1) — Тц /(Яс()ОН растворяют в смеси из 400 мл ледяной уксусной кислоты и 400 мл метанола и по примеру Б каталитически гидрируют и перерабатывают. Для очистки вещество один раз кипятят с водой, отсасывают и сушат. С помощью кипения с уксусным эфиром вещество можно очистить лучше. Выход продукта 53,4 г (84Ъ от теоретического); т.пл. 221-223 (с ) 33,1 (с = 1, в ледяной уксусной кислоте).

Пример 7. Синтез я-фа-о(Lee-чае -0Hz (ряд из секретина) .

А. Z-Ьеа -Vae — MH . к раствору 13 г (66 ммолей) HBVH

«ЦЕ- МН, в 180 мл диметилформамида добавляют 8,91 г 1-гидроксибензотриазола, 8,6 мл М -этилморфолина и 30,8 r (60 ммолеи) 2-len-OPcp.

Смесь перемешивают 10 мин при комнатной температуре и затем концентрируют в глубоком вакууме. Остаток размешивают последовательно с 2 н.раствором соды, водой, 2,5Ъ-ным раствором

КНЬО4 и водой, отсасывают и сушат при

50 над Р> О . Выход продукта 21,3 r (98Ъ от теоретического).

511852

17

Такой же результат получают при применении З-гидрокси-окси-3,4-дигидрохиназолина, 1-гидрокси-5,б-диметилбензотриазола или 1-гидроксипиридона вместо 1-гидроксибензотриазола. 5

Б. НСЕ-Н-1.Е - Vae — НН,.

К суспензии 21 r (57,8 ммолей)

Z-Len- Чай - NH> в смеси из

200 мл диметилформамида и 200 мл метанола добавляются(ОН) Вс ВО4 катализатор, При перемешивании через реакционную смесь проводят водород, причем прикапыванием 1 н.метанольного раствора НСР выдерживают РН 5 с помощью автотитратора. После того, как больше не воспринимается НСе раствор, отсасывают катализатор и концентрируют фильтрат. Остаток растирают с эфиром, отсасывают и сушат при 50 . Выход продукта 15,4 г (100Ъ от теоретического); т.пл. 138-140 . 20

Продукт по тонкослойной хроматографии однообразный.

В. Z-fey — Leo — Yae — ИН, 15,4 г (57,8 ммолей)НСЕ-Н-1.еи-Vae-mg; растворяют с 7,52 мл g --этилморфо- 25 лина и 7,88 r 1-гидроксибензотриазола в 120 мл диметилформамида. К этому добавляют 22, 5 r Z — цыц — OT

cp смеси дают стоять 5 мин и концентрируют с глубоким вакуумом. Остаток растирают с 2 н.раствором соды, отсасывают и промывают водой. Сушат над

Pe0 и затем кипятят с уксусным эфиром. Для очистки мох:но переосаждать из смеси тетрагидрофуран/петролейный эфир. Выход продукта 21,8 г (90 о от теоретического); т.пл. 184-186 (сС ) — 12,8 (с = 1, в диметилацетамиде).

Г. HCe — H -gEy — .еи -Vae — NH

20,0 r (47, б ммолей ) Z-цыц- Lee- voe — йн, гидрируют в 200 мл смеси метанол/диметилформамид (1:1) и перерабатывают. Вещество несколько гигроскопично и для очистки его переосаждают на. смеси метанол/эфир. Сушат над Р2 05 и парафиновыми обрезками. Выход йродукта 13,5 r (88Ъ от теоретического); т.пл. 209-211 56

g.Z-Qev-fey; LQrl- Vae — NH>

К раствору 3, 23 г (10 ммолей ) нсе -í- gey- Len - чае — кн, .

1,3 мл N -этилморфолина и 1,35 г (10 ммолей) 1-гидроксибен3отриазола в 20 мл диметилформамида добавляют

4 r (10 ммолей) -qeu — ОНр и позволяют стоять 10 мин. Выпадает студень.

Разбавляют с эфиром, высадившееся вещество отсасывают, быстро сушат и перемешивают с 2 н.раствором соды.

Промывают водой, Раствором KHSO4 и водой, сушат над Р 05 и кипятят с уксусным эфиром. Охлаждают до комнатной температуры, отсасывают и промывают уксусным и петролейным эфирами. При 65

40 — 50 сушат над Р> О и обрезками парафина. Выход продукта 5 r (91Ъ от теоретического); т.пл. 242-244 (d.) - 25,2 (с=1, в ледяной уксусной кислоте).

Такой же результат получают при использовании З-гидрокси-4-окси-3,4дигидрохиназолина, 1-гидрокси-5,6диметил-бензотриазола или 1-гидроксипиридона вместо 1-гидроксибензотриазола.

Пример 8. Синтез Z-РиО-18е-дВумнд

Л. (Åe- с Ец - Мн

44, 4 r (О, 1 моля) 2-iee -Отср и 11 г (0,1 моля) HCe — Н -фц-ЬП(2 растворяют вместе с 1, б г (10 ммоля) 3-гидрокси-4-окси-3,4-дигидрохиназолина и 130 мл М -этилморфолина в 700

800 мл диметилформамида. Затем концентрируют в глубоком вакууме и остаток растирают с раствором бикарбоната натрия, отсасывают, промывают водой, сушат и для дальнейшей очистки растворяют в диметилформамиде и высаживают смесью эфир/петролейный эфир (1:1).

Выход продукта 28,5 r; т.пл. 202 ; (< ) — 8,1 (с = 1, диметилацетамид).

Вычислено, Ъ: С 59,80; Н 7,21;

М 13,08

С16Н2ЬМь04 мол. в 321,4) .

Найдейо, Ъ: С 59,6; H 7,2; 14 12,8

Б. Z У О вЂ” lee — @РАЙ вЂ” МН

К раствору 20 r (62,2 моля )

z- ме — gey — NH> и 60 мл метанол/диметилформамид (3:1) добавляют немного РЙ (OH)< Ba504 — катализатора. При перемешивании через эту реакционную смесь пропускают водород, причем прикапыванием 1 н.метанольного раствора НС с помощью автотитратора выдерживают РН 4,5. После того, как больше не воспринчмается HCP раствор, отсасывают катализатор, и фильтрат концентрируют. Остаток растворяют в 100 мл диметилфсрмамида. нему добавляют 23 г (62 ммоля)

7-pvQ — ОМр, 8,1 мл N -этилморфолинами, 1,5 г (9, 4 ммоля) 3-гидрокси-4-скси-3,4-дигидрохиназолина; Смесь перемешивают 15 мин и концентрируют в глубоком вакууме. Остаток поглощают уксусным эфиром и схлаждают. Выпадает осадок, который отсасывают и последсвательно растирают с раствором бикарбсната натрия, 2 н.НСГ и водой. Сушат и для дальнейшей очистки хсрошо растирают с уксусным эфиром, отсасывают и сушат. Вьход продукта 20,7 г (80Ъ от теоретического); т,пл. 182-184-; (aL) — 63,2 (с = 1, метанол).

Такой же результат получают при применении 1-гидрокси-4-метил-2-пиридона, 1-гидрокси-б-метокси-бензотриазола или 1-гидрокси-5-метил-бенэо511852

19

20 триазола вместо производного хиназолина.

П р и M е р 9. Синтез Z-Asp(OBu )-ие - ае-ОЕи-7р- Leu- iQe - As@- Thvfaut) OBd

1. Получение исходного вещества

CH COOH. H -Phe-VaE -gQu-Tvp-Leu-)ЕЕ-ASh-Thea)DQ4

А. 2-3Lsn - Thv(But) — OBu+.

42,85 г (161 ммолей) Z — Asm — CH, 43 г (161 ммолей) маслянного НСЕ-H-Thv(But)-0But полученного путем каталитического гидрирования Я- Thv(But)-OBut

1 при добавлении Meòàíoëüíorî НСЕ при рН 4,5 и 21,75 г (161 ммолей) 1-гидроксибензотриазола растворяют в 325 мл диметилформамида. Добавляют 21 мл

К -этилморфолина и при 0 охлажденный раствор 35,45 г дициклогексилкарбодиимида в 80 мл диметилформамида. Перемешивают 1 час при 0 и 1 час при комнатной температуре, отсасывают осадок и концентрируют Фильтрат в глубоком вакууме . Остаток распределяют между уксусным эфиром и раствором

htaHCG . Срганическую фазу экстрагируют в делительной воронке с 2,5Ъным раствором КН504, насыщаемым раст- 26 вором НаНСО> и водой, сушат сульфатом натрия и концентрируют. Растворяют с петролейным эфиром и отсасывают.

Выход 65,8 г, т.пл . 110-115 . Перекристаллизовывают из смеси уксусный. эфир/петролейный эфир. Выход продукта

52,4 (68% от теоретического); т.пл. 120-122 ; (с(.) — 7,6 (с 1, метанол).

Б.НСЕН-А5п - Thv(But) -05ut. и

К раствору 44, 7 г (93,2 ммоля)

z-Asn — ThY(But)-OBut в 300 мл метанола добавляют немного Рс{(ОН) Вс б04 катализатора. При перемешивании через эту реакционную смесь пропускают во- 40 дород, причем путем прикапывания 1 н. метанольной соляной кислоты с помощью автотитратора выдерживают рН 4,5.

После отфильтровывают от нерастворимых и на ночь устанавливают в холо- 46 дильник. На следующий день отсасывают выпавший осадок и промывают эфиром.

Выход продукта 33,65 r (95,6В, от теоретического)1 т.пл. 110-113 ; (oLj7 — 2,6 (с 1, метанол). о D

Вычислено, Ъ: С 50, 32; Н 8, 45;

М 11,01.

С, Й57М505СЮ (мол . a . 382 ) .

Найдено, Ъ: С 500у Н 9,0; И 10,9.

В. Z- { Ев -Лви - туч(Вас) — ОВы Й к раствору 21,8 r (82 ммоля)е-!ED-ОН, 66

31, 3 Г (82 ммоля) НСЕ-3lsh-Thv{But)QBut гидрокситриазола и 10, 7 мл К -этилморфолина в 150 мл диметилформамида добавляют при 0 охлажденный раствор

18,1 г дициклогексилкарбодиимида в

70 мл диметилформамида. Перемешивают

1 час при 0 и 1 час при комнатной температуре по примеру А. Конечный продукт растворяют в 150 мл уксусного эфира, отфильтровывают нераствори- 66 мые остатки и размешивают в 750 мл петролейного эфира. Выход продукта

42,37 r (87Ъ от теоретического); т. пл. 144-146; (а(j — 20, 5 (с=l, метанол) .

Вычислено, Ъ: С 60,82; H 8,14;

М9,46

Сьо Н45К4ов (мс л. в. 592, 75)

Найдено, Ъ: С 60,9; Н 8,4; К 9,2.

Г.НСЕ Н-4Ее -А5И вЂ” т{тч(Ви ) — Oaut

38,6 r (65,2 ммолей)2 -ЕВ -Жи- Thv (But — ОВи+) каталитически гидрируют по примеру Б в метаноле. Вещество растворимо в эфире и под высоким вакуумом дает аморфный продукт. Выход продукта 33,2 r (100Ъ от теоретического); oLD — 5,9 (с 1, метанол).

Вычислено, Ъ: С 53,37; Н 8,76;

М 11,31.

С72 Н45 С1М(0 (мол. в. 495,07)

Найдено, Ъ: С 53,0; Н 9,0; И 10,9.

Д. 2-Lett - j(e - Asm - Thv(But ) pBu

К раствору 16,4 г (61,8 ммоля)

z — ьел — OH, 30,6 г (61, 8 ммоля)

HCQH - ice-Аэи — Thv(But) - OH< t

8,34 г 1-гидроксибензотриазола и 8,1мл

И -этилморфолина в 150 мл диметилформамида добавляют при 0 холодный раствор 13,6 г дициклогексилкарбодиимида в 60 мл диметилформамида. Перемешивают 1 час при 0 и 1 час при комнатной температуре и перерабатывают по примеру A. Вещество растирают с петролейным эфиром и отсасывают. Выход 39,3 г; т ° пл.173-176 . Высаживают из смеси уксусный эфир/петролейный эфир. Выход продукта 37 5 г (86В от теоретического); т.пл . 173- 76 (дС) о — 34,3 (с = 1, метанол).

Э

Вычислено, Ъ: С 61,26; H 8,42;

И 9,92

С Н И505 (мол. в. 705,9)

Найдено, В: С 61,4; Н 8,7; N9,9.

Е. HCQ - Н вЂ” Lee-1ЕŠ— ASn - Thv(But)— ОВи

35,2 r (50 ммолей) z-реп- {ее - As им -() - 0ви гидрируют по примеру

Б каталитически в метаноле. Вещество кристаллизируется при растирании с эфиром. Выход продукта 28,6 г (94В от теоретического); т.пл. 192-193 (разложение); (oCJ = — 17,9 (с = 1, метанол).

Вычислено, В: C 55,26; H 8,96;

И 11,51.

С25 Н54 C lh(507 (MOJI IIе,608) °

Найдено, Ъ: С 55,3; Н 9,0; К 11. 4

Х(. Z Tvp- LeII — {le -Л5П- Thv(But)-Obu

К раствору 26,2 r (43,1 ммоля)

HcQ - н-реп- {ее - Авя- Thv (Ви )- ohu 14, б г (43,1 ммоля) Z-— ?чр — OH, 5,82 г 1-гидроксибензотриазола и 5,6 мл этилморфолина в 150 мл диметилформамида добавляют при 0 холодный раствор 9 5 г дициклогексилкарбодиимида в 60 мл диметилформамида. Перемеши511852

21

22 вают 1 час при Оо и 1 час при комнат ной температуре, отсасывают от осадка и фильтрат концентрируют. Остаток растирают с раствором NaHCO-, отсасывают и сушат. Перекристаллизовывают из изопропанола. Выход продукта

33,8 г (88Ъ от теоретического); т.пл. 228-229 ; (d ) = — 39,5 (с = 1, метанол).

Вычислено, Ъ: С 63,23; Н 7,79;

1410,99

С47 НЬ9Ь(7010 (мол. в 892 1)

Найденс, Ъ: С 63,0; Н 7,8; N 10,7.

3. Нсе н- 7vp-реп-)ee-Asti — Thv(su )-оВа

31,2 г (35 ммолей)2-Yv -i en- ice-ns ТЬ7фм )-Щ каталитически гидрируют в 200 мл смеси диметилформамид/метанол (1:1) по примеру Б. Остаток растирают с эфиром. Выход продукта

27,2 г (98Ъ от теоретического); т пл. 215О (разложение ); (с()%-28 0 (с = 1, метанол). 1)

Проба переосаждается из смеси метанол/эфир; т. пл. 217 о (разложение); (Ц = — 28,4 (с = 1, метанол) .

Вычислено, Ъ: С 58,97; Н 8, 12; 28

N 12,34

С>> Нь4 М, О С 6 (мол. в. 794,45)

Найдено, Ъ: С 57,2; Н 8,2; )(11,8.

И. Z — - Phe — Vae — ОН

10, 7 г Z- Phe — Vae - ОМе растворяют 30 в 200 мл смеси д оксан/вода (68:2) .

Титруют с 27 мл 1 н.раствора НаОН с тимофталеином. Нейтрализуют с 2 н.раствором HCR и раствор концен-рируют. Остаток распределяют между уксусным эфи- Д5 ром и 2 н. НС E. Уксусно-эфирную фазу промывают водой, сушат с сульфатом натрия и концентрируют. Остаток растирают с эфиром и отсасывают. Выход продукта 9,45 r (92Ъ от теоретичес- щр кого); т.пл. 148-149 . Переосаждают из смеси уксусный эфир/петролейный эфир выход 9,2 г; т.пл. 148-150е; (с(.) = — 8,8 (с = 1, метанол).

Вычислено, Ъ: С 66 32 Н 6 58 4

N 7,02.

О 5-. (м(Найдено, Ъ: С бб;б; Н 6,7; М 7 2

K. 2- Phe Vae — о8и - OBu+

К раствору 8,0 г (20 ммолей)

Phe- VaP — OH 4, 8 r НСЗН-qpu-ÎBè+

2, 7 г 1-гидрокситриазола и 2, б мл

N -этилморфолина в 40 мл диметилформамида добавляют при 0 холодный о раствор 4,2 г дициклогексилкарбодиО имида. Перемешивают 1 час при 0 и

1 час прн комнатной температуре, отсасывают от осадка и фильтрат концентрируют. Остаток растирают с раствором МаНСО, отсасывают и промывают, водой.

Выход продукта 11,65 г (100Ъ от теоретического) т.пл. 219-221 (разложение); 1, oL) = — 35,7 (с = 1, метанол). 65

Вычислено, Ъ: С 63,91; H 7,27;

И 9,60

С Н4> N40 (мол. в. 582,7)

Найдено, Ъ: С 64,2; Н 7,7; Й 9,7

Л. 7-Рие -VoB-j(.u ОН

11,1 г (19 ммолей)2-Р77е-Vae-g(u-03è

t растворяют в 30 мл трифторуксусной кислоты. Через 30 мин при комнатной температуре концентрируют и остаток растирают с эфиром и отсасывают . Продукт для дальнейшей очистки кипятят с уксусным эфиром, смешивают с петролейным эфиром, отсасывают и сушат.

Выход продукта 8,45 r (85Ъ от теоретического); т.пл. 225-227 ; (А )7, 10,7 (с = 1, диметилацетамид).

Вычислено, t: С 61,59; Н 6,51;

N 10,64

С77 Н 7 М 0 (мол . в . 526, 7)

Найдено, : С 61,6; Н 6,7; N 10,4.

М.Z-phe-Vae -qeu-Т р- ье77- iee-Asn-, thv(Bu ) — 0Bu, К раствору 7,95 г (10 ммолей)

HC E-H- Tvp-i ei7- ice-As77- Thv(BU

5,27 r (10 ммолей) Z РИе-Vae-geu-QH в

100:мл диметилформамида добавляют

1,3 мл N-этилморфолина, 1,35 r 1»гидроксибензотриазола и при 0 и перемешивании холодный раствор 2,2 г дициклогексилкарбодиимида в 20 мл диметилформамида. Смесь перемешивают

1 час при Ое и 1 час при комнатной температуре. Осадок отсасывают и фильтрат концентрируют. Остаток растирают с раствором М аНСО> и отсасывают. Осадок фильтрования кипятят с

1 л этанола. Труднорастворимый остао ток 5,6 г, т.пл. 253-255 (разложение); (d(.), = — 15,3 (с = 1, диметилацетамид) . Из спирта выкристаллизовывают 2,8 г; т.пл. 251-254 (разложение). Общий выход продукта

8,4 г (66,5Ъ от теоретического).

Вычислено, Ъ: С 62,6; Н 7,56;

M 12,16.

СБ Н,75 Nii О (мол. в. 1266 6) .

Найдено, Ъ: С 62,2; H 7,9; N 11,9.

Н.CH СООй К-Phe ЧаЕ-geu- ГчР- Le77-1Ее — Asn — Гhv(ни )- OR 7

Через раствор 7,6 г (б ммолей)

z-phe — vae- geu Tv@- Let1- юе-Asn-Thv(Bu )-06ч е в 250 мл ледяной уксусной кислоты, к которому добавляют катализатор

Pd(0H) Ьа$0,, пропускают водород до прекращения образования СО . Катализатор отсасывают, фильтрат концентрируют и остаток растирают с эфиром.

Выход 7,4 r, т.пл. 247 †25(разложение). Продукт кипятят с уксусным эфиром и отсасывают на холоду. Выход продукта 6,78 г (95Ъ от теоретического); т.пл. 248-251 (разложение}.

0.2-AS@(05ut)-Fhe- Vae- дГи-тЧр- ЬЕИ)Ге - Я Яп - ГИч(Ва ) — oBu<

К суспензии 6,32 r (5,3 ммолей)

СН Соон Í-phe-Vae-ö(u- тМр-ьen-iee-Asap )-а е

150 мл диметилформамида добавляют

511852

23

0,86 r (5,3 ммоля) 3-гидрокси-4-окси-3,4-дигидрохиназолина в 2,66 г (5,3 ммоля) Z- Asn(05u ) -OTgp . После 5 мин перемешивайия концентрируют и остаток растирают с 2 н.содовым 5 раствором, отсасывают и промывают водой. Фильтровальный остаток отпаривают с метанолом. Труднорастворимый остаток: 5,3 г, т.пл. 246-2484 (разлох<ение) у из фильтрата: 0,5 r; т.пл. 244-246 (разложение); (<Ц з=-15,0 (с = 1, диметилацетамид) .

Общий выход продукта 5,8 г (76,4Ъ от теоретического)

Вычислено, Ъ: С 61,8; Н 7,57;

N.11,69

l5

Cqt Н N4 O>< (мол. в. 1437, 7) ., Найдено, Ъ: С 61,1; Н 7,6; К 11,7.

Такой же результат получают при применении 1-гидрокси-4-метил-2-пиридона, 1-гидрокси-б-метокси-бензотриазола или 1-гидрокси-5-метил-бензотриазола вместо производного хинаэолина.

Пример 10. Синтез -Phe-Чай-ОЩ

2 r Z-фенилаланин-поли-4-гидрокси-3-нитростирольной смолы (содержит

3 ммоля Z -фенилаланина) суспендируют в 5 мл диметилформамида и смешивают с 162 мг (1 ммоля) 3-гидрокси-4-окси-3,4-дигидрохиназолина, 168 мг 30 (1 ммоль) НЫ.Н-Vae-0ме и 0,18 мл

N -этилморфолина. Перемешивают

15 мин, отсасывают, промывают с диметилформамидом, концентрируют фильтрат и остаток распределяют между ук- 38 сусным эфиром и раствором бикарбоната натрия. Уксусноэфирную фазу промывают с 2 н.НС Е, раствором бикарбоната натрия и водой, сушат с сульфатом натрия и концентрируют. Сстаток растворяют 40 с петролейным эфиром, отсасывают и сушат. Выход продукта 390 мг (95Ъ от теоретического); т.пл. 115

Пример 11. Z — Tqv -проинсулин 5 †(31-63)-триаконтатрипептид. 45

40 мг (10 ммолей) триаконтатрипептид — трифторацетата, превращают в 1,8 мл 90Ъ-ного диметилформамнда с 26 мг (60 ммолей)2 -1уч-Онр в присутствии 1,35 мг (10 ммолей) 1-гид- щ роксибензотриазола. Через 15 мин высаживают эфиром и отфильтровывают осадок. После промывки с эфиром и метиленхлоридом получают 36 мг реакци онного продукта. 65

Содержание тирозина 1. Лминокислотный анализ: 1,1 Moll. И 0,72 в н-бутанол(пиридин)уксусная кислота

<вода) 30:6:20:24/, хроматография на бумаге, возникающая, Я1 триаконтапаптида равен 0 22. )не)

П- р и м е р 12.N -(Вос-1.еп-Рифа-е<

-бис-Вос-инсулин.

120 мг (20 ммолей) Вос -инсулина л смешивают с 2 мл диметилформамида с

16,7 мг. (30 Mol) Вос-ben — Phe -От ср и 2, 7 мг (20 МО1) 1-гидроксибензотриазола. Перемешивают 10 мин при комнатной температуре, высаживают эфиром, отфильтровывают осадок и промывают его эфиром. Выход 117 мг.

Вычислено, Ъ: Len 7; Phe 4.

Найдено, Ъ: Ьеп 6,98; Phe3,98.

Миграционное расстояние в электрофорезе на бумаге при рН 2,2: 0,76 х инсулин (Boo — инсулин -. 0,84 х инсулин) °

После отщепления защитных групп с помощью одночасовой обработки с трифторуксусной кислотой и осаждения с эфиром соединение мигрирует в электрофорезе на бумаге как инсулин. Реакционное время без добавки 1-гидроксибензотриазола составляет 3 часа и ведет частично к сшинке.

Такой же результат получают при применении 1-гидрокси-4-метил-2-пиридона, 1-гидрокси-б-метокси-бензотриазола или 1-гидрокси-5-метил-бензотриазола вместо 1-гидрокси-бензотриазола.

Пример 13. Boc-phd- 1ц - «Ìå -pu(08ut)-His-Phe-Avg- Гмр — фу-оН.4Н 0

5, 36 r (4 ммоля) H- Tgv-Sev-Met-g844-(0Bat) -His — Рие — Avo — Tvs- gag,- он хн.о превращают в 50 мл диметилформамида с 1,84 г (5 ммолей)Вос-A-АИ- ОТср в присутствии

540 мг (4 ммоля) 1-гидрокси-бензотриазола. Через 15 мин смесью уксусный эфир/эфир высах<инают 5,65 r (94Ъ) почти чистого хроматографически реакционного продукта, который для полной очистки перекристаллизовывают из 400 мл 60Ъ-ного метанола. Выхол продукта 4,92 г (81Ъ от теоретического). Соединение идентично полученному без добавки 1-гидроксибензотриазола, однако время реакции сократилось с 20 час до 15 мин. 4, 4

IIpимep14.M пента (Lee — phe ) трипсинкалликреин.ингибитор.

90 мг трипсин-калликреин-ингибитора из органов крупного рогатого скота суспендируют н 2 мл диметилформамида. К этому добавляют 56 мг

Вос- <.em — Рие — OT<,.> 13 мг 1-гидроксибензотриазола. При перемешивании добавляют воду (всего 0;51 мл) до полного растнорения. Перемешивают еще 15 мин, концентрируют в глубоком вакууме и растирают остаток с абсолютным тетрагидрофураном. Осадок отсасывают и сушат. Выход 110 мг.

95,7 мг вещества растворяют в 2 мл трифторуксусной кислоты. Позволяют стоять 30 мин при комнатной температуре, концентрируют и осадок распределяют между водой и эфиром, переме шивают нодную фазу с Amber(!ite %-45

511852 (ацетатная форма) и сушат замораживанием. Выход 86 мг.

Вычислено, %: 1.еа 7; РИе 9.

Найдено, Фг Lee 7,2; Phe 9,2.

Пример 15. Синтез Н-фц-Юе-чаР-фи — фи — ОН (инсулин A 1-5) .

1. Получение по методу пептидного синтеза в твердой фазе ". использованием Э-гидрокси-4-окси-3,4-дигидрохиназолина

3. Мрз-Цйм(мьй) полимерное соединение..

Раствор 12,3 г Мрь фи (МЬИ) и 3,2 мл триэтиламина в 60 мл диметилформамида добавляют к 20 г хлорметилирован,ной по Меррифилду сшитой с 2В дивинилЬензола полистирольной смолы, которая имеет хлорсодержание l,15 мэкв/г.

Смесь встряхивают при 80 в течение

48 час, затем фильтруют и смолу многократно промывают.с диметилформамидом, этанолом и метанолом. Выход после сушки в вакууме при 805 над

Р. О -составляет 19,3 г.

Аминокислотное содержание полученной ациламинокислотной смолы составляет 1,15 ммоля/г. в . Вос-да - ие- чае -фа(овгз)- цбл(мыл) полимерное соединение. б г соединения MpS-ô (МЬИ) искусственной смолы в реакционном сосуде со стеклянной фриттой. по Меррифилду подвергают следующим реакционным циклам:

1) промывка тремя порциями по 50 мг ледяной уксусной кислоты;

2) отщепление М -защитных групп путем получасового встряхивания с

1 н.раствором безводного НС . в ледяной уксусной кислоте, фильтрация;

3) промывка ледяной уксусной кислотой по п.l,;

4) трехкратная промывка этанолом, каждый раз по 50 мл;

5) трехкратная промывка диметилфорв мамидом,,каждый раз rio 50 мл, 6) нейтрализация имеющейся в ос- вобожденных aL -аминогруппах гидро- хлоридной группировки путем встряхивания в течение .10 мин с 50 мл 103ного раствора,триэтиламина и диметилформамида;

7) промывка диметилформамидом по п. 5;

8) добавка к диметилформамидному раствору 3,6 ммолей соответствующего трихлорфенилового эфира Вос-амино кислоты в 40 мл диметилформамида вместе с 0,57 г (3,6 ммоля) 3-гидрокси-4-окси-3,4"дихлорхинзолина, и последующее 2-час встряхивание, затем фильтрация;

9) промывка диметилформамидом по и. 5„

10) промывка с абсолютным этанолом по к. 4.

Растворитель удаляется путем фильт рации под давлением (давление воздуха 0,3 атм ) через стеклянную фритту реакционного сосуда.

Для присоединения аминокислоты описанные циклы проводят, смотря по обстоятельствам, один раз. При этом используют следующие по порядку три- хлорфениловые эфиры Вос-аминокислоты по п. 8: Вос ДС (ОЪ 8) -0T, Воска 8 - От, Вос- (0е - ОТ и ВосС » ср Г . Q

J jj!u — От . Выход Вос-фц-I E -+ ср

Qfu -(ОЬрЦ-Яй(/(ЬЬ) полимерного ооеди нения после сушки над РВОВ в глубоком вакууме при 80 .составляет 5,3 г с пептидным содержанием 8,2 (определяют путем кислого гидролиза и количественного определения аминокислоты), В. Выделение пептида.

3 г полученного по примеру Б ацилпептид-полимерного соединения суспендируют в реакционном сосуде с 20 мл безводной трифторуксусной кислоты, затем в течение 90 мин при исключении попадания влаги пропускают медленный поток безводной бромводородной кислоты снизу через стеклянную фритту сосуда и суспензию, находящуюся поверх нее. Затем фильтруют суспензию и смолу трижды промывают трифторуксусной кислотой, каждый раз

40 по 10 мп. Объединенные трифторуксусной кислоты фильтрат и водные раство- ры концентрируют в вакууме, остаток дважды при цеканировании извлекают настаиванием, каждый раз с 50 мл эфи45, ра (абсолютного). Вес после сушки в глубоком вакууме иад Р О составляет

396 мг„ т.пл, 225 (разложение)1 (ck)> = — 51,4 (с 0,25, вода) °

Из 200 мг сырого продукта при помощи

Щ) распределительной хроматографии на

5ephadex ЬН26 растворителем бутанол/уксусная кислота/вода (2:i:10) получают 114 мг бесцветного аморфного вещества. Т.кл. 240 (разложение)

Я г 22 у 1 = - 71,4 (с 0,25 моля) .

АминокислоФный анализ приведен в табл. 4.

511852

27

Та блица 4 (с = 0,25, во с(.j C

75,06

71,5

39,4

Точка разложения, С от 240

От 165

От 255

Тонкослойная хроматография

Однообразный и идентичный с методом Ш

3 пятна, из которых одно идентично с методом Ш

Однородный

Аминокислотный анализ

ДЫ 2,6

qRu 2, 74 фо 2,2 (12 час, при 110 С) фу 1,0

ЧаР 0,9

Ме 0,87

ЯРЧ

VaP 0,445

Ме 0,33

ЦЕу 1,0

VaP 0,9

Ке 0,9

П. Получение по методу пептицидного синтеза в твердой фазе без добавки З-гидрокси-4-оксо-3,4-дигидрохиназолина.

Способ получения качественно и количественно идентичен предыдущему, однако реакция проводится без добавки З-гидрокси-4-оксо-8,4-дигидроксиназолина согласно и. 8. В отдельности 88 при этом опыте получают следующие результаты. Выход сырого продукта:420 мг, т пл. от 96; (а() = — 27 (с = 0,2моля) .

С помощью распределительной хро- 40 матографии $ерпабех (.Н20 получали лишь 84 мг продукта со следующими характеристиками : т.пл. от 165 (разложение); (с ), = — 34,9 (с 0,25, вода). При тонкослойной 45 хроматографии продукт ведет себя ненормально. Аминокислотный анализ приведен в табл. 4 .

Ш. Получение по: общепринятым методам. 50

А. Вос- g(. g — <(e -OH CHA.

К раствору 35 г (0,2 моля) Воску -ОН, 38,4,r (0,2 моля)HCR H-)Ee-оМе и 27 г (0,2 моля) !1-гидроксибензотри азола в 350 мл диметилформамида добавляют 26 мл N -этилморфолина и при 0 раствор 44 r дициклогексилкарбоциимида в 50 мл диметилформамида.

Перемешивают 1 час при 0 и один час при комнатной температуре, отсасывают осадок и фильтрат концентрируют.

Остаток распределяют между уксусным эфиром и раствором бикарбоната натрия.

Уксусно-эфирную фазу экстрагируют путем встряхивания с раствором КН504 раствором КаНСО> и водой, сушат с 65 сульфатом натрия и концентрируют. Выход масляного продукта 61,6 г.

Масло растворяют в уксусном эфире и хроматографируют через колонку со

185 г основного Al О (Woelm, активная ступень 1) . Элюат уксусного эфира концентрируют, выход 55,8 r.

Полученное масло растворяют в

250 мл смеси из диоксана и воды (8:2) и смешивают с небольшим количеством гимолфталеина. Раствор титруют с 1 н. раствором едкого натра до тех пор, пока раствор не станет стойко-голубым. Требуется 179 мл 1 н. раствора едкого натра. Затем нейтрализуют раствором KHSO4 и реакционную смесь сгущают. Остаток растворяют в воде, перемешивают с уксусным эфиром, при ледяном охлаждении подкисляют до рН

2 — 3 с помощью 2 н. Н 5 04 и перемешивают. Уксусноэфирную фазу отделяют, один раз промывают водой, сушат над сульфатом натрия и концентрируют.

Остаток растворяют в эфире и смешивают с циклогексиламином до о"новной реакции. Затем ставят в лед, отсасывают, промывают эфиром и сушат Выход продукта 55,6 г (71,8% от теоретического); т.пл. 198-200"C.

Для дальнейшей очистки вещество растворяют в 100 мл метанола и смешивают с 1,5 мл эфира и охлаждают.

Через 1 час отсасывают. Выход продукта 45,6 r (59% от теоретического); т.пл. 204-205 С; (с(.) = — 17,4 (с 1, метанол).

В. г- va(.-gCu(OBut)-q(. u (МЬИ) — ОН

65,2 г (81 ммоля) -va8-дСо(ОВаЦ-gPufMbh)-ОМе суспендируют в 400 мл смеси диоксан/вода (8:2), титруют с

511852

1 н.раствором едкого натра в присутствии тимолфталеина в качестве индикатора. После того как раствор станет стойко-голубым:подкисляют раствором

KHSO4 и осадок отсасывают. Фильтруемый материал кипятят с ацетоном, отсасывают и пересаживают из диметилформамид/вода. Выход 59 r (92% от теоретического); т.пл. 216-218 .

Вычислено, Ъ: С 63,72; Н 6,85; и 7,05.

С42 Н 4 )4< О» (мол. в. 790,9) .

Найдено, В: С 63,3; Н 7,1; М 8,1.

В. Н-чаЕ-ца4ОВ Р) — дЫ(МЬЬ) ОН

Через суспензию 52 г (65,7 ммолей)

Z-Ча Р- Ра(ОЬа )- Ы(мыл) — ОН и немного Pd / Ba SQ4 катализатора в

500 мл ледяной уксусной кислоты пропускают водород до окончания образования CO . Затем отсасывают катали2 затор и фильтрат концентрируют. Остаток растирают с эфиром и отсасывают.

Осадок примерно 5 час перемешивают с насыщенным раствором ацетата натрия, отсасывают, сушат и кипятя метанолом. Выход 27 r (62,6Ъ от теоретического); т.пл. 226-228аС; (a)z +9,0 (с = 1, ледяная уксусная кислота).

Вычислено, Ъ: С 62,20; Н 7,35;

И 8,53.

С < Н„ЗЛО (мол. в. 656,8) .

Найдено, Ъ: С 61,4; Н 7,3; N 8,5.

Г. Вос-фа-1Са — YaB- Яйцын -дйи(мЬЯ-OH

7,8 г (20 ммолей) Boc-g

40 мл 2 н.лимонной кислоты. Эфирную фазу отделяют, промывают водой, сушат с сульфатом натрия и концентрируют.

Выход 4,6 r масла, К раствору 3,9 г полученного масляйого вещества (Bocgtq — Ke — ОН) в 35 мл диметилацетамида добавляют 2,09 r 3-гидрокси-4-окси-3,4-дигидро-1,2,3-бензотриазина и при О C 2,75 r дициклогексилкарбодиQ имида. Перемешивают 1 час при 0 и

1 час при комнатной температуре. Выпавший осадок отсасывают и промывают небольшим количеством диметилацетамида. К фильтрату добавляют 5,85 г мелкорастертого Н- VaP-фи(ОВ4- цЫ(мьи) — 0н и перемешивают 5 час при комнатной температуре. При этом осаждается плотный осадок, который выстаивает ночь, и на другой день вещество полностью осаждают с 300 мл воды. Вещество отсасывают, промывают водой и кипятят с 200 мл этанола, охлаждают до комнатной температуры, отсасывают и хорошо промывают спиртом. Выход

6,7 r (81,3% от теоретического); т.пл. 253-255 Су (с )В = — 2,1 (с = -1, диметилацетамид) .

Вычислено, Ъ: С 60,90; Н 7,61;

К 9,07.

С47 Н7О МВ О4, (мол. в. 927, 1) .

Найдено, %: С 61,0; Н 7,6; М 9,2.

Д. Н-ЦЬл- late — чаР-ЯРи — фРм- ОН

200 мл Boc- qPu- Ее- va(. -яй40Ва )фа(мьМ044 и 0,5 г анизола растворяют в 5 мл трифторуксусной кислоты и 10 мин кипятят с обратной флегмой. Затем раствор концентрируют, остаток растирают с эфиром. После этого отсасывают и остаток растворяют в воде. Водный раствор смешивают с АтьечйМ /КН5 (ацетатная форма) пока рН не достиг-. нет 3-4. Ионит отсасывают и фильтрат осветляют с активированным углем.

Прозрачный водный раствор сушат вымораживанием. Выход 50 Mr;(aLj -75 С (с = 0,25;вода). При тонкослойной хроматографии продукт однообразный.

Приведенные в таблице результаты показывают превосходство предлагаемого способа при методе в твердой фазе. По традиционному методу при применении треххлорфениловых эфиров без добавки катализаторов получение приблизительно однородного материала невозможно

Получение некоторых катализаторов.

3-Гидрокси-4-метил-2,3-дигидро-триазол-2-тион. а) 5-тиокси-б-окси-5-тио-2-октанон.

Раствор 185 г (2 моля) хлорацетона в 300 мл метиленхлорида смешивают с 300 мл воды. При 10-20 С при перемешивании порционно вносят 320,5 г (2 моля) C2Н О вЂ” CS 5 Х. Перемешивают еще 2 часа при комнатной температуре, разделяют слои, органическую фазу еще раз промывают со, 100 мл воды, сушат сульфатом натрия и дистиллируют.

T.êèï. 92-99 /0 05 торр, выход 305 г; б) 5-тиокси-5 окси-4-тио-2-октано40 ноксим.

К раствору 56,0 г гидроксиамингидрохлорида в 400 мл метанола добавляют

65,6 г ацетата натрия и 137 г получен« ного по п.а) 5-тиокео-6-окса-4-тиа-2-октанола. После 18 час перемешивания при комнатной температуре отгоняют в вакууме растворитель,остаток сме" шивают с водой, экстрагируют метиленхлоридом,органическую фазу сушат с сульфатом натрия и освобождают от растворителя.Остаток поглощают диизопапиловым эфиром. Путем охлаждения отсюда можно в несколько фракций получить всего 101 г оксима с т.пл. 64 . с) З-гидрокси-4-метил-2,3-дигидротиазол-2-тион.

К раствору 104,4 г М аОН в 200 мл воды прикапывают при охлаждении и ин« тенсивном перемешивании в течение

15 мин 125,3 r полученного по п.б) оксима, растворенного в 300 мл метиленхлорида, затем еще перемешивают

5 мин., добавляют 500 мл воды, разделяют слои, водную фазу дважды экстрагируют встряхиванием в делитель511852

32

Н Y О К Y P

l l II () И

H-tl-CR-C-(14-Cg-C) — Ч (1И)

I %А,Х

М-OH

Формула изобретения

500;

Х б

М-ОН (1Ч) ,р

Редактор Л. Джарагетти

Заказ 753/1333 Тираж 557 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, Ул. Проектная, 4 ной воронке, каждый раз со 100 мл гексана, и лодкисляют концентрирован. ной соляной кислотой. до рН2. Перемешивают I час в ледяной бане, хорошо отсасывают осадок и дважды основательно промывают его водой по 300 мл каждый раз. Выход 61,5 r, т.пл. 90 С.

Другие 12 r равного продукта можно получить путем экстракции водного раствора с метиленхлоридом.

Пример 1Â. 1-гидрокси-4,6диметил-3,5-дихлор-2-пиридон.

Растворяют 20 г 1-гидрокси-4,6диметил-2-пиридона в смеси из 75 мл концентрированной соляной кислоты и

60 .мл воды и при 10-15 С пропускают

2i,6 г хлора, затем еще перемешивают

1 час, отсасывают, промывают водой и сушат в вакууме. Выход 22,9 г, т.пл. 213 С. При кристаллизации из ацетонитрила т.пл. 216 С.

Р 20

Сгособ получения пептидов общей формулы

НYОНYОНYОНYО

I I Н I I II I I И I I И

v-(Ы-СН-С);И-СН-С-Н-СН-С-(Н-СИ-С), (1) где ш — число от 0 до 10; т — число от 0 до и более

y — аминозащитная группа или пироглютаминовын остаток;

Y — низший алкиловыи сста-, у ток, который может быть разветвленным и/или замещенным ь случае необходимости защищенным -ОН, — и Н, — $Н, -СООН, -СОМН, -гуанидин, -арйл, -имидазолил, -нндолил-остатками, при- 4п чем группа (— N Н-СНУ) также может означать пиролидил-остаток, путем взаимодействия защищенной аминокислоты или защищенного пептида формулы 45

Н Y 0 Н Y 0

1 Ц I II

Ч-(Н-CH-C) - -М= . Н-C-О-R (ll) где tn,; V u Y имеют укаэанные значения, Q — представляет собой ди- три-, тетра- или пентахлорфенил;

-нитрофенил или хлор-нитрофенил-осататок с защищенным в случае необходимости аминокислотами или пептидами общей формулы

rehem V, и Y (— К Н -СНУ-) остатки имеют указанные значения; означает гидрокскльную группу, О-алкил, О-аралкил, аминогруппу или эфиро- или амнно-связанный полимерный носитель, замещенный алкилом, аралкилом или арилом, с последующим выделением целевых продуктов известными приемами, о тл и ч а ю шийся тем, что процесс ведут в присутствии соединения общей формулы в которой Х означает группу С-О, С- Ь или — и — и Х и К являются членами 5-б-членного замещенного гетероциклического кольца, анналированного с бензольным ядром и/или содержащего

1 или 2 других гетероатома и значение рК которых 3,7-4,2.

Приоритет по признакам:

01.07.71 взаимодействие проводят при добавлении 1-оксибензотриазола;

20.01.72 взаимодействие проводят при добавлении соединения обцей формулы где X означает группу С-О, С-6 или

- М вЂ” и в которой Х и И являются членами 5-б-членного эамещенного гетероциклического кольца, аннелированного с бенэольным кольцом и/или содержащего 1 или 2 других гетероатома и значение рК 3,7-4,2.

Составитель Я. Соколов

Техред О. Луговая Корректор A ° Âëàñåíêî