Способ получения окситоцина и дезаминоокситоцина

 

Оц 586165

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН И Я

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социал истическнх

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 14.07.76 (21) 2386195/23-04 (51) М. Кл. С07С 103/52 с присоединением заявки № 2386196/

/23-04 (23) Приоритет

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам нзобретеий н еткрытнй (43) Опубликовано 30.12.77. Бюллетень № 48 (45) Дата опубликования описания 29.12.77 (53) УДК 547.964.4..07 (088.8) (72) Авторы изобретения

С. Я. Микста, В. Г. Майрановский, H. Ф. Логинова, Г. И. Чипенс и О. С. Папсуевич

Г

Латвийский филиал Всесоюзного ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского института химических реактивов и особо чистых химических веществ «ИРЕА», Всесоюзный научно-исследовательский витаминный институт и Ордена Трудового Красного Знамени институт органического синтеза А Н Л атвийской С С P (71) Заявители (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОКСИТОЦИНА

И ДЕЗАМИНООКСИТОЦИНА

Изобретение относится к улучшенному способу синтеза биологически активных гормонов — окситоцина и дезаминоокситоцина, нашедших широкое применение в медицине.

В литературе широко известен способ получения окситоцина, исходя из S,S - дибензилзащищенного нонапептида — амида N-карбобензокси - $ - бензил — цистеинил тирозил - изолейцил - глутаминил - аспарагинил - S - бензил - цистеинил-пролил-лейцилглицина или амида N-бутилоксикарбонил - S - бензил - цистеинил — тирозил-изолейцил - глутаминил - аспарагинил - S - бензил - цистеинил - пролил - лейцилглицина отщеплением S - защитных групп.

Известный способ получения дезаминоокситоцина также состоит в отщеплении защитных групп от S,S - дибензилзащищенного нонапептида — амида S - бензил - р - меркаптопропионил - тирозил - изолейцил - глутаминил - аспарагинил - S - бензил - цистеинилпролил-лейцил-глицина.

Отщепление S - бензильных и N-Сво-групп осуществляют металлическим натрием в жидком аммиаке при температуре от — 60 до — 30 С с последующим окислительным замыканием цикла или кислородом воздуха, или феррицианидом калия. Выход окситоцина при этом 18 — 33%, дезаминоокситоцина — 31—

38%, окситоцическая активность 70 — 130 и

684 МЕ/мг соответственно.

Недостаток способа состоит в применении для отщепления защитных групп металлического натрия в жидком аммиаке, что снижает выход и качество целевого продукта, Наиболее близким к предлагаемому является способ отщепления S - бензилзащитных групп от защищенного нонапептида - N — кар10 бобензокси - $ - бензил - цистеинил-тирозилизолейцил - глутаминил - аспарагинил-S-бензил - цистеинил - пролил - лейцил — глицина электролизом в жидком аммиаке при — 60 С в течение 1,5 ч; замыкание дисульфидного

15 цикла с образованием окситоцина проводят известным методом, например кислородом воздуха. Выход окситоцина составляет 28%, окситоцическая активность — 107 МЕ/мг.

Недостатками известного способа являюся:

20 низкий выход целевого продукта, связанный с образованием побочных продуктов на стадии отщепления защитных групп в жидком аммиаке, недостаточно высокая окситоцическая активность и сложность проведения процесса, 25 связанная с осуществлением синтеза в жидком аммиаке при температуре — 60 С.

Цель изобретения — повышение выхода и качества целевого продукта и упрошение технологии процесса, 586165

Это достигается описываемым способом получения окситоцина и дезаминоокситоцина из

S - защищенного нонапептида формулы NBOC - R — тирозил - изолейцил - глутаминиласпарагинил - цистеинил - пролил - лейцилглицина, где R — цистеинил, Р-меркаптопропионил, отщеплением S - защитных групп электролизом с последующей окислительной циклизацией и выделением целевого продукта, заключающийся в том, что в качестве

S-защитных групп используют S - бензамидометильную группу и отщепление последней проводят электролизом в среде диметилформамида при 20 — 30 С.

Реакции электр охимического отщепления

S-защитных групп протекают за 40 — 50 мин.

Последующее окислительное замыкание дисульфидного цикла проводят 0,0114 н. раствором феррицианида калия. После очистки продукта методом гельфильтрации на Sephadex G-15 получают дезаминоокситоцин с выходом 67 /о, ВОС-окситоцин — 68 — 72 /о. Обработка последнего 90О/о-ной трифторуксусной кислотой приводит к образованию окситоцина с выходом 52 — 57 Окситоцитоцическая активность полученных продуктов: 155—

174 ME/мг для окситоцина и 680 NE/мг для дезаминоокситоцина.

Электрохимическое отщепление $ - бензамидометильной группы проходит селективно, не затрагивая пептидные связи, это исключает образование побочных продуктов и обеспечивает увеличение выхода и чистоты целевого продукта.

Пример 1. Окситоцин.

100 мг (0,066 ммоль) амида N-ВОС-S-бензамидометил - цистеинил - тирозил-изолейцилглутаминил - аспарагинил - S - бензамидометил - цистеинил - пролил - лейцил - глицина растворяют в 8 мл безводного диметилформамида и электризуют на ртутном катоде на фоне 1 /о-ного Вп4ИС104 в безводном диметилформамида при напряжении от — 2,0 до — 2,2 В и температуре 20 — 23 С в течение

35 мин. Растворитель упаривают при пониженном давлении в атмосфере азота при

20 С, остаток растворяют в 100 мл воды. рН полученного раствора доводят до 705 н. раствором аммиака. Продукт окисляют 9,2 мл

0,0114 н. раствором феррицианида калия в течение 30 мин в атмосфере азота. Желтоватый раствор обрабатывают ионнообменной смолой Dowex 2Р, 10 (Cl — ) в течение 15 мин до исчезновения желтой окраски, фильтруют.

Фильтрат упаривают в вакууме при температуре 20 — 25 С. Полученный маслянистый остаток растворяют в 3 — 5 мл 50 /о-ной уксусной кислоты, вносят в колонку (2,5;х,150) с

Sephadex G-15 и элюируют 50 /о-ной уксусной кислотой. Элюат лиофилизуют.

Получают 55 мг (68,8 /о) ВОС - окситоцина; т. пл. 167 — 169 С. (я) — 70 (с 0,1; этиловый спирт).

Найдено, /о. С 47,92; Н 6,72; N 13,61, 5

4

С„ Ну,й gO(4$g 6НрО.

Вычислено, : С 47,44; Н 7,13; N 13,82, 50 мг ВОС - окситоцина обрабатывают бмл

90 /о-ной трифторуксусной кислоты при 20 С в течение 30 мин, фильтруют, к фильтрату прибавляют 40 мл воды и смесь упаривают в вакууме при 30 С. К остатку добавляют еще

40 мл воды, лиофилизуют. Продукт сушат в вакууме, получают 34,4 мг (83,1 /о) окситоцина.

Выход окситоцина 52О/о, считая на защищенный нонапептид. (сс) — 24 (с 0,1; 50О/о-ная уксусная кислота).

Окситоцическая активность 155 МЕ/мг.

П р и мер 2. Окситоцин, 200 мг (0,132 ммоль) амида N-BOC-S-бензамидометил - цистеинил - тирозил-изолейцилглутаминил - аспарагинил - S - бензамидометил - цистеинил — пролил - лейцил - глицина растворяют в 20 мл безводного диметилформамида и электролизуют на ртутном катоде на фоне 1 /о-ного Bu4NC104 в безводном диметилформамиде при напряжении от — 2,0 до — 2,2 В и температуре 25 — 30 С в течение

45 мин.

Обработкой реакционной смеси, аналогично описанной в примере 1, получают 115 мг (71,9 /о) ВОС-окситоцина; т. пл. 168 — 170 С. (а) р — 70,3 (c 0,2; этиловый спирт).

Найдено, /о. С 47,87; Н 6,84; N 13,60.

C4sHy4N>gO>4Sz ° 6Н О.

Вычислено, /о. С 47,44; Н 7,13; N 13,82.

Отщеплением ВОС-группы 90 /О-ой трифторуксусной кислотой получают 75,5 мг (79,2 /о ) окситоцина.

Выход 57 /о, считая на защищенный нонапептид. (а) D — 24,3 (с 0,1; 50О/о-ная уксусная кислота).

Окситоцическая активность 174 ME/мг.

Пример 3. Дезаминоокситоцин.

68 мг (0,052 ммоль) амида S - бензамидометил - P - меркаптопропионил - тирозил-изолейцил - глутаминил - аспарагинил - $ - бензамидометил - цистеинил - пролил - лейцилглицина растворяют в 8 мл безводного диметилформамида и электролизуют на ртутном катоде на фоне 1 /О-ного Bu4NC104 в диметилформамиде при температуре 20 — 25 С в течение 40 мин.

Растворитель упаривают при пониженном давлении в атмосфере азота при 20 С, остаток растворяют в 100 мл воды. рН раствора доводят до 7 добавлением 0,5 н. аммиака и продукт окисляют 6,4 мл 0,0114 н. раствором феррицианида калия в течение 30 мин в атмосфере азота, Реакционную массу обрабатывают ионообменной смолой Dowex 2 10 (Cl — ) в течение 15 мин до исчезновения желтой окраски, фильтруют, фильтрат упаривают в вакууме при температуре 20 — 25 С. Остаток растворяют B 3 мл 50 /о-ной уксусной кисло586165

Составитель В. Волкова

Редактор Т. Никольская Техред Н. Рыбкина Корректор E. Мохова

Заказ 2702/13 Изд. № 981 Тираж 563

НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раугнская наб., д. 4/5

Подписное

Типография, пр. Сапунова, 2 ты, вносят в колонку (2,5к,150 см) с Sephadex G-15, элюируют 50 /с-ной уксусной кислотой, Собранный элюат лиофилизуют, получают 33,3 мг (65%) дезаминоокситоцина. (а),",— — 90,5 (с 0,5; 1 ц. уксусная кислота).

Окситоцическая активность 650 МЕ/мг (по тесту сокращения матки).

Пример 4, Дезаминоокситоцин.

131,4 мг (0,1 ммоль) амида S - бензамидометил - P — меркаптопропионил — тирозил-изолейцил - глутаминил - аспарагинил - S - бензамидометил - цистеинил - пролил-лейцил-глицина растворяют в 15 мл безводного диметилформамида и электризуют на ртутном катоде на фоне 1 /о-ного Bu4NC104 в диметилформамиде при напряжении от — 2,0 до — 2,2 В и при температуре 25 — 30 С в течение 45 мин.

Обработав реакционную массу в условиях, описанных в примере 3, получают 69,.4 мг (70 о) дезаминоокситоцина, (я) „ — 90 (с 0,5; 1 н. уксусная кислота).

Окситоцическая активность 680 ME/мг (по тесту сокращения матки).

Фор мула изобретения

Способ получения окситоцина и дезаминоокситоцина из S - защищенного нонапептида

10 формулы N - ВОС - R - тирозил - изолейцилглутаминил - аспарагинил - цистеинил - пролил - лейцил - глицина, где R — цистеинил, Р-меркаптопропионил, отщеплением S-защитных групп электролизом с последующей окис15 лительной циклизацией и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода, повышения качества продукта и упрощения процесса, в качестве S - защитных групп используют S - бенз20 амидометильную группу и проводят электролиз в среде диметилформамида при 20 — 30 С.